Adhäsion und Aggregation unter Fluss mit Mikrofluidik-Flow-Cells

Das Bioflusssystem ist ein automatisiertes Instrument und ein mikrofluidisches Gerät für die Durchführung von Lebendzellassays unter kontrolliertem Scherfluss. Dieses System verwendet mikrofluidische Well-Plattentechnologie, um Durchflusszellengeräte im Mikrometermaßstab in SBS-Standard-Well-Platten zu integrieren. BioFlex kann zur Durchführung von Thrombozytenadhäsions- und Aggregationsstudien mit hohem Durchsatz und reduziertem Blutvolumen verwendet werden.

Mit Fluoreszenzfarbstoff markiertes Vollblut wird in die Vertiefungen gegeben und dann durch die Kanäle geflossen. Unter kontrollierter Strömung werden hochauflösende Mikroskopiedaten erzeugt, die die Thrombozytenadhäsion und -aggregation in Gegenwart von Wirkstoffen und anderen variierenden Parametern quantifizieren. Hallo, ich bin Mike Schwartz vom RD-Labor bei Flexion Biosciences.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für den Einsatz von mikrofluidischen Durchflusszellen in Thrombozytenadhäsionsassays. Wir verwenden dieses Protokoll in unserem Labor für eine Vielzahl von gefäßbiologischen Assays. Also lasst uns loslegen.

Rindfleisch, bevor das Durchflusszellenexperiment durchgeführt wird, müssen die mikrofluidischen Kanäle der Bioflussplatte mit einer Proteinbeschichtung von Interesse Kollagen vorbereitet werden, die in diesem Experiment verwendet wird. Jeder der 24 experimentellen Kanäle der Bioflussplatte ist mit einer Einlassschacht und einer Auslassschacht für diese Platte verbunden. Die Einlassvertiefung ist die linke Vertiefung, die den Kanal speist, und die Auslassvertiefung befindet sich auf der rechten Seite, verdünnen Sie die Kollagen-Ein-Brühe auf eine Konzentration von 200 Mikrogramm pro Milliliter.

In 0,02 molare Essigsäure werden 20 Mikroliter für jeden verwendeten Kanal benötigt. Da für dieses Experiment 11 Kanäle erforderlich sind, stellen Sie 200 Mikroliter Kollagenbeschichtung her. Ein Kanal bleibt unbeschichtet und wird durch sanfte Iteration mit einer Mikropipettenspitze gemischt.

Geben Sie 20 Mikroliter Beschichtung in jeden jeweiligen Kanal, indem Sie die Flüssigkeit mit einer Mikropipette in den Innenstempel der Vertiefung geben. Bei der Speisung des interessierenden mikrofluidischen Kanals, wie hier gezeigt, mit dem gelben Farbstoff wird ein Kanal ohne Kollagen als Negativkontrolle für die Thrombozytenadhäsion und -aggregation eingeschlossen. Nachdem die Kollagenbeschichtung auf alle entsprechenden Kanäle aufgetragen wurde, befestigen Sie die Schnittstelle an der Platte.

Wenn Sie die Schnittstelle bio flux 1000 verwenden, können Sie beide Riegel auf der Bühne festklemmen. Wenn Sie den ersten Finger der Bio flux 200-Schnittstelle verwenden, ziehen Sie die vier Schrauben fest. Und wenn sie alle eingestellt sind, ziehen Sie sie mit dem Drehmomentschlüssel vollständig fest.

Der Drehmomentschlüssel klickt, wenn er das Maximum erreicht. Wenden Sie im manuellen Modus der Bioflux-Software eine Perfusion auf die interessierenden Kanäle in Höhe von 2 D pro Quadratzentimeter vom Auslass an. Nun, verwenden Sie ein Objektiv mit geringer Leistung an einem Mikroskop, um den Einlassschacht zu finden, und beobachten Sie, wie der gegenüberliegende innere Stempel mit Flüssigkeit gefüllt wird.

Sie sollten zuerst eine winzige Ladung Flüssigkeit sehen, die den inneren Stempel nach einigen Minuten langsam füllt, und wenn der innere Einlassstempel gefüllt ist, stoppen Sie den Überfluss auf allen Kanälen, indem Sie in der Software auf Stopp drücken. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Während dieser Inkubationszeit können Sie am Ende der einstündigen Inkubation mit der Aufbereitung des Vollbluts beginnen.

Sobald das Blut aufbereitet wurde, entfernen Sie die Grenzfläche und geben Sie einen Milliliter PBS plus Kalzium- und Magnesiumionen in den Auslass. Nun, beginnen Sie mit der Üppigkeit aus dem Auslass bei zwei Dines pro Quadratzentimeter und setzen Sie die Üppigkeit 10 Minuten lang fort. Stoppen Sie nach 10 Minuten die Profusion Entfernen Sie nach dem Entfernen der Schnittstelle überschüssiges PBS sowohl aus der Einlass- als auch aus der Auslasswelle.

Entfernen Sie niemals Flüssigkeit, die den Innenstempel füllt. Um die Kanäle zu verstopfen, geben Sie einen Milliliter Blockierlösung in jeden Auslass. Gut zu verwenden Perfusion aus dem Auslass bei zwei Diner pro Quadratzentimeter und setzen Sie die Perfusion 10 Minuten lang fort.

Stoppen Sie den Überfluss nach 10 Minuten und entfernen Sie die Schnittstelle. Die Kanäle sind nun fertig und können den ganzen Tag über verwendet werden, während die Platte mit Kollagen beschichtet wird. Während einer einstündigen Inkubation sollte frisches menschliches Blut von einer nüchternen Person für die Bildgebung vorbereitet und in die Platte eingebracht werden.

Das Blut sollte in Natriumcitrat, Antikoagulans, entnommen und innerhalb von drei Stunden nach der Entnahme verwendet werden. Geben Sie zunächst einen vier Millimolar großen Bestand an Calcium M in DMSO in einer Verdünnung von einem bis 1000 Volumen pro Volumen in das Blut. Zur Gewinnung von vier Mikromolaren wird Calcium durch sanfte Inversion gemischt.

Als nächstes geben Sie einen Milliliter des mit Kalzium markierten Blutes in zehn Ein-Komma-Fünf-Milliliter-Mikroröhrchen ab. Geben Sie GP zwei B drei a Inhibitor-Antikörper in der gewünschten Verdünnung in jedes Röhrchen. Achten Sie darauf, eine Negativkontrolle ohne Antikörper und eine Positivkontrolle ohne verwandte Antikörper einzuschließen, die durch sanfte Inversion gemischt wird.

Inkubieren Sie die Röhrchen eine Stunde lang bei Raumtemperatur und mischen Sie alle 10 Minuten durch sanfte Inversion, bevor Sie das Durchflusszellenexperiment durchführen. Im Bioflux-Kontrollmodul für Kollagen sollte ein automatisiertes Protokoll eingerichtet werden. Eins. Richten Sie ein Protokoll ein, um das Blut 10 Minuten lang in einer Höhe von zehn neun Zentimetern im Quadrat vom Auslass laufen zu lassen.

Nun, mit der BioFlex 1000 Workstation sollten Datenerfassungsparameter eingestellt werden, die die gewünschte Erfassung der Tischpositionen in der Fitz-Wellenlängen- und Zeitraffereinstellung beinhalten. Ein typischer Bildaufnahmeplan für dieses Protokoll würde ein Sichtfeld pro Kanal umfassen, das mit einem 10-fach-Objektiv alle 30 Sekunden über eine Gesamtdauer von 10 Minuten erfasst wird. Zusätzliche Sichtfelder und alternative Zeitraffer-Einstellungen sind ebenfalls möglich.

Sobald das automatisierte Protokoll und die Datenerfassungsparameter eingerichtet sind, kehren Sie zur BioFlex-Platte zurück und entfernen Sie die Flüssigkeit auf beiden Seiten des Kanals mit Ausnahme der inneren Stempel. Achten Sie darauf, dass Sie schnell arbeiten, und geben Sie 500 Mikroliter Blut jeder Erkrankung in die Ausgangsvertiefungen jedes Kanals. Beachten Sie, dass die Ausgangsvertiefungen zur Abgabe des Blutes verwendet werden, da dies der kürzeste Weg zum Betrachtungsbereich ist und eine unmittelbarere Reaktion des Blutes auf die Kollagenbeschichtung ermöglicht.

Platzieren Sie außerdem das Kontrollblut ohne Antikörper in einen Kanal, der mit Kollagen beschichtet ist und nur blockiert ist. Legen Sie die Platte auf das BioFlex 1000 Workstation-Mikroskop und klemmen Sie sie an der Schnittstelle fest. Führen Sie die Kalibrierung der Stufenliste durch, indem Sie den ersten Kalibrierungspunkt suchen, der als Ursprung definiert ist.

Suchen und markieren Sie dann den zweiten Kalibrierungspunkt. Wenden Sie diese Kalibrierung auf die entsprechende Stufenliste an. Dadurch wird sichergestellt, dass alle Betrachtungspunkte auf der Platte automatisch gefunden werden.

Bewegen Sie den Tisch auf einen der Kanäle mit Blutsatz, der die Bildaufnahmeparameter wie Belichtungszeit und Verstärkung in der BioFlex-Montagesoftware enthält. Starten Sie den entsprechenden Workflow, indem Sie auf die gewünschte Schaltfläche klicken. Dadurch werden das Ablaufprotokoll und die Bildaufnahme gleichzeitig gestartet.

Am Ende des Versuchs nehmen Sie die Platte vom BIOFLU 1000 Arbeitsplatz und entsorgen Sie sie gemäss den institutionellen Richtlinien. Unter Verwendung von kollagenbeschichteten mikrofluidischen Kanälen des Bioflusssystems. Eine aggressive Thrombusbildung wird im Laufe der Zeit bei der unbehandelten Kontrollblutprobe beobachtet.

Im Gegensatz dazu wird bei dem unbeschichteten Kanal keine Thrombusbildung beobachtet. In einem kürzlich durchgeführten Experiment betrug die durchschnittliche Größe der Aggregate unter Kontrollbedingungen 2000 Mikrometer im Quadrat. GP two B three A ist ein potenter Mediator von Thrombozyten-Thrombozyten-Wechselwirkungen und Aggregationsstabilisierung, wenn es durch Adhäsion an Kollagen aktiviert wird, wie hier gezeigt, wird nach Inkubation mit Anti-GB-2-B-3a-Antikörper für eine Stunde vor der reinen Exposition eine Abnahme der Größe von Thromben sowie eine Abnahme der Häufigkeit der Thrombusbildung beobachtet.

Eine dosisabhängige Reaktion kann typischerweise bei zehn neun Zentimetern im Quadrat beobachtet werden, und der IC 50-Wert für diesen speziellen Inhibitor betrug 17 Nanomolaren. Die maximale Hemmung für diesen Spender im Vergleich zur Kontrolle ohne Antikörper betrug 11 % bei 10 Din-Zentimetern im Quadrat. Eine 48-Well-High-Shear-Platte ist auch für die Durchführung von Vollblutexperimenten mit bis zu 200 dpt pro Quadratzentimeter oder 5.000 inversen Sekunden erhältlich.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie mit Hilfe von mikrofluidischen Strömungskanälen physiologisch relevante gefäßbiologische Experimente durchführen können. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, daran zu denken, das Kollagen im richtigen Puffer zu verdünnen. Verwenden Sie immer die richtige Pipettiertechnik, um das Einbringen von Luftblasen zu vermeiden, und befolgen Sie immer die Biosicherheitsvorschriften Ihres Labors.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.