Methoden, um die Sensitivität der High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotypisierung in Malaria erhöhen

Das übergeordnete Ziel des folgenden hochauflösenden Schmelzeexperiments ist es, die Sensitivität des Nachweises von mutierten Allelen, die in niedrigen Konzentrationen mit einer einzelnen Probe vorhanden sind, zu erhöhen. Dies wird erreicht, indem zunächst die extrahierte DNA hergestellt wird, indem das Template auf die erforderlichen Volumina und Konzentrationen verdünnt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Assays mit asymmetrischen Anteilen des Vorwärts- und Rückwärtsprimers vorzubereiten, um das Template-Sondenprodukt zu erhöhen.

Nach der Vorbereitung der Reaktionen wird die Glühtemperatur zwischen den Schmelztemperaturen der Sonde eingestellt, wenn sie entweder an den Wildtyp- oder an die Mutantenvorlage gebunden ist. Der letzte Schritt besteht darin, die amplifizierten Produkte auf der entsprechenden HRM-Plattform zu analysieren. Letztendlich ermöglichen die Verzerrung der mutierten Allelamplifikation und die sondenbasierte asymmetrische PCR einen empfindlicheren Nachweis von herausfordernden SNP-Mutationen bei niedrigen Konzentrationen in Proben.

Diese erhöhte Sensitivität ist nützlich für die Mutationsüberwachung in Populationen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem standardmäßigen hochauflösenden Schmelzen oder der Tac-Man-Genotypisierung besteht darin, dass sie eine erhöhte Empfindlichkeit für Allele ermöglicht, die in niedrigen Konzentrationen vorhanden sind, und auch die Genotypisierung von SNPs, die sich proximal zueinander im Genom befinden. Diese Methode kann jedoch Aufschluss über die Ausbreitung von Arzneimittelresistenzen beim Malariaparasiten geben.

Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf die Überwachung anderer Arten von Infektionskrankheiten wie HIV oder die Erkennung seltener Krebsvarianten in einer Zellpopulation. Das Verfahren wird von Caitlin Durphy vorgeführt. Ein Techniker aus unserem Labor.

Templates für hochauflösendes Schmelzen oder HRM werden aus Plasmodium falciparum-Proben hergestellt, die direkt aus dem Blut von Patienten gewonnen werden, die an Feldstudien teilnehmen. Die Proben können auf Filterpapier, auf Schnellnachweistests oder als pelletierte Proben roter Blutkörperchen gelagert werden, die auch für die In-vitro-Züchtung geeignet sind. Einige Standard-Laborstämme für die Analyse können bei der Malariaforschung bestellt werden, und Proben des Referenzreagenzien-Ressourcenzentrums können aus Vollblut, roten Blutkörperchen oder Filterpapier extrahiert oder direkt aus pelletierten roten Blutkörperchen oder Kulturen zur direkten Amplifikation aus pelletierten roten Blutkörperchen verwendet werden.

Bestimmen Sie zunächst den Para der roten Blutkörperchen mit Hilfe einer Dünnabstrichmikroskopie nach dem Verfahren der Centers for Disease Control and Prevention. Rote Blutkörperchen mit Paras über 0,5% werden dann um eins auf 400 verdünnt. Bei der TE werden drei Mikroliter verdünnte rote Blutkörperchen für jede Reaktion von fünf bis 10 Mikrolitern verwendet, da zwischen einer Variabilität immer positive und negative Kontrollen in die HRM-Analysen einbezogen werden müssen.

Bereiten Sie 10 Pikogramm bis 10 Nanogramm pro Mikroliter Verdünnungen von Plasmid oder Standards mit sequenzverifizierten Snip-Genotypen als positive Trolle vor. Verwenden Sie Wasser in PCR-Qualität als Negativkontrolle ohne Vorlage für die Amplifikationsreaktionen. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie 10 x Arbeitsmaterial der Primer und Sonden vorbereiten.

Das gleiche Protokoll gilt für Assays mit 96-Well-Platten, 384-Well-Platten, acht Röhrchenstreifen oder Glaskapillaren. Für diese Demonstration werden jedoch nur 96-Well-Platten und Glaskapillaren verwendet. Diese Tabelle zeigt die empfohlenen 10-fachen Konzentrationen des Arbeitsbestands sowie die Endkonzentrationen für die auf blockierten Sonden basierende HRM-Genotypisierung.

Bereiten Sie jeweils Reaktionsmischungen vor. Nun, fügen Sie jeweils einen Mikroliter von jedem der 10 x Arbeitsmaterial vorwärts und rückwärts Primer und Sonden hinzu. Vier bis fünf Mikroliter des HRM-Mastermixes, ein Mikroliter Template und Wasser in PCR-Qualität für ein Gesamtreaktionsvolumen von 10 Mikrolitern.

Machen Sie das Gleiche für jede Glaskapillare. Decken Sie die Platten und Glaskapillaren ab. Verwenden Sie optische Plattendichtungen für die plattenbasierte Amplifikation und Kunststoffkappen für kapillarbasierte Systeme.

Stellen Sie sicher, dass die Abdeckung vollständig ist und Platten und Kappen vollständig versiegelt und gesichert sind, um eine Verdunstung zu verhindern. Während der Verstärkung. Schleudern Sie die Proben, um Luftblasen zu entfernen.

Drehen Sie die Platten in einer Tischzentrifuge drei Minuten lang mit dem 1.800-fachen G.Spin Glaskapillaren in einer Pico-Zündung für 10 bis 15 Sekunden. Platzieren Sie die Reaktionsplatte und die Glaskapillaren in einem Thermocycler, der Standard-Blocksonden- oder MAAB-Amplifikationsprotokolle ausführt. Fahren Sie nach der PCR-Amplifikation mit der Schmelzanalyse über die Schnittstelle der Systemsoftware fort.

Schmelzen Sie die Platte von 40 Grad Celsius auf 80 Grad Celsius, um sowohl Sonden- als auch Amplikon-Schmelzpeaks zu erzeugen. Der erste Schritt der Schmelzanalyse am Light Cycler four 80 ist die Normalisierung von der negativen Ableitung der normierten Fluoreszenz in Bezug auf die Temperaturansicht. Verschieben Sie die Normalisierungsbalken so, dass sie den Schmelzebereich der Sonde umgeben.

Der Sondenschmelzebereich ist die untere Temperatur der beiden Schmelzbereiche. Die Normalisierungsbalken sollten sich an der Basis der Schmelzepeaks befinden. Wählen Sie nach der Normalisierung Gruppen berechnen, um bei Bedarf automatisch Stichproben Gruppen zuzuweisen, und weisen Sie Stichproben manuell bestimmten Gruppen zu.

Wählen Sie Proben aus, die nicht amplifiziert haben oder die gezackte Schmelzpeaks aufweisen. Gehen Sie dann zu Neuer Anruf und wählen Sie Negativ. Nachdem Sie alle verbleibenden falsch klassifizierten Proben ausgewählt haben, gehen Sie zu Neuer Aufruf, wählen Sie die entsprechende Gruppierung aus und klicken Sie auf Anwenden ändern Genotypen für jede Gruppe basierend auf den Standards zuweisen.

Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die berechneten Gruppen korrekt sind, wählen Sie auf der Registerkarte Gruppierung die Option Gruppennamen bearbeiten und geben Sie die Genotypen der Standards in das entsprechende farbige Feld ein. Wenn z. B. Standard 3D Seven einen bekannten C-Genotyp aufweist und sich in Gruppe eins befindet, haben alle Proben in Gruppe eins Presseergebnisse des Genotyps C, und Genotypen werden neben Proben angezeigt.

Exportieren Sie abschließend die Ergebnisse als TXT-Datei für die weitere Analyse der Stichprobenpopulation. Nach Beendigung des Laufs auf dem Light Cycler 2.0 notieren Sie die Probennamen und -positionen unter den Probendaten. Bevor Sie mit der Analyse beginnen, kennzeichnen Sie die Negativkontrollen und die Genotypen der Schmelzstandards. Beginnen Sie die Schmelzeanalyse, indem Sie Analyse auswählen, unter Schmelzkurvenanalyse die Genotypisierung auswählen und pressen. Okay.

Um die Empfindlichkeit der automatischen Gruppierung zu erhöhen, wählen Sie alle Proben aus, sodass die Anzeige in den Schmelzkurven dargestellt wird. Schieben Sie den Normalisierungsbalken an die obere Grenze der Schmelzpeaks der Sonde. Vergewissern Sie sich, dass die Beispiele korrekt gruppiert wurden, indem Sie jede Gruppe unter dem Gruppennamen einzeln auswählen.

Exportieren Sie die Genotypen für jede Probe, indem Sie alle Proben auswählen, die Daten kopieren und in ein Arbeitsblatt einfügen. Die Darstellung der negativen Ableitung der normierten Fluoreszenz in Bezug auf die Temperatur ist in der Regel der einfachste Weg, um Schmelzpeaks zu visualisieren und Genotypen zu bestimmen. Wenn Sie das Analysefenster nur auf einen Sondenbereich setzen, erhalten Sie eine klare Unterscheidung der Peaks, die bestimmten SNPs entsprechen.

Perfekte Übereinstimmungen führen zu höheren Schmelzpeaks, die rot dargestellt sind. Während SNP-Fehlanpassungen niedrigere Schmelztemperaturen aufweisen, werden sie grau angezeigt, wenn beide Allele in einer Probe vorhanden sind. Die Prob-basierte HRM-Analyse stellt beide Allele als zwei Peakkurven dar, die orange dargestellt sind, mit Peaks, die mit einzelnen Allelproben übereinstimmen, die in Rot und Grau dargestellt sind. Die fortschreitende Reduzierung der Ealing-Temperatur während der Amplifikation führt zu einer Verzerrung in Richtung des mutierten Allels, das durch den linken Seitenpeak in einer polygenomischen oder polyallelischen Probe dargestellt wird.

Diese Verzerrung der Mutantenallelamplifikation führt zu einer HRM-Sensitivität beim Nachweis kleinerer Allele, die in polygenomischen oder polyallelischen Proben bei weniger als 1 % vorhanden sind. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Qualität der Probe entscheidend ist. Geringfügige Unterschiede in den Pufferkonzentrationen können die HRM-Kurven verschieben.

Die Verwendung von Steuerelementen ist eine nützliche Möglichkeit, Ergebnisse zu standardisieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die prob-basierte asymmetrische PCR und die Verzerrung der Mutantenallelamplifikation verwenden können, um Malaria-SNPs aus einer Vielzahl von Probentypen genau und sensitiv zu genotypisieren.