Überwachung der Montage einer sezernierte bakterielle Virulenz-Faktor mit Site-spezifische Vernetzung

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Dynamik der Protein-Protein-Wechselwirkungen innerhalb einer lebenden Zelle zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Protein von Interesse in E. coli exprimiert wird, das Aminosäureanalogon Benzoylphenylalanin an einer bestimmten Stelle in das Protein eingebaut wird und eine Pulsverfolgungs-Radiomarkierung durchgeführt wird, um eine kleine Population synchron synthetisierter Proteinmoleküle zu markieren. Als zweiter Schritt.

Aliquots von Zellen, die zu verschiedenen Zeitpunkten während der Jagd gesammelt wurden, werden bestrahlt, um die Bildung kovalenter Bindungen zwischen dem interessierenden Protein und allen Faktoren, mit denen es interagiert, auszulösen. Als nächstes werden Proteine mit spezifischen Antikörpern immunpräzipitiert und durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgelöst, um interagierende Faktoren zu identifizieren, werden Ergebnisse erhalten, die Veränderungen in den Wechselwirkungen zwischen dem interessierenden Protein und anderen intrazellulären Faktoren im Laufe der Zeit zeigen, basierend auf Änderungen der elektrophoretischen Mobilität von Vernetzungsprodukten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Co-Immunpräzipitation oder der chemischen Vernetzung, besteht in ihrer Fähigkeit, zeitliche Informationen über Wechselwirkungen zu generieren, die zwischen einem bestimmten Rest in einem Protein von Interesse und anderen Molekülen auftreten.

Solche Daten sind besonders wertvoll, wenn es darum geht, die Progression eines Proteins über einen mehrstufigen Assemblierungsweg zu untersuchen und Assemblierungszwischenprodukte zu identifizieren. Obwohl diese Methode für den Einsatz bei E-coli optimiert wurde, kann sie auch in anderen Systemen verwendet werden, einschließlich anderer Bakterien, Hefen und Säugetierzellen. Details zur Kulturvorbereitung finden Sie im Textprotokoll.

Bereiten Sie kurz fünf Milliliter M neun Medium vor, das 0,2 % Glycerin enthält, alle el-Aminosäuren außer Methionin und Cystin und Antibiotika, beginnen Sie mit der Zugabe von E-coli, die mit einem Plasmid transformiert wurden, das für das Protein von Interesse mit einer Bernsteinmutation kodiert, und das Plasmid, das für das bernsteinfarbene Suppressionssystem kodiert, inkubieren bei 37 Grad Celsius. Am Tag des Experiments wird eine geeignete Menge von Zellen aus der Übernachtkultur in einen 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben gegeben, der 50 Milliliter M neun Medium und Antibiotika enthält, um eine optische Dichte bei 550 Nanometern von 0,03 zu erhalten. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius in einem schüttelnden Wasserbad.

Wenn die Kulturen die frühe bis mittlere logarithmische Phase erreichen, fügen Sie jeder Kultur 50 Mikroliter eines molaren Benzoylphenylalanins oder BPA hinzu. Fügen Sie BPA Tropfen für Tropfen hinzu, während Sie den Kolben schwenken, um Niederschläge zu vermeiden. Fügen Sie als Nächstes alle Induktoren hinzu, die benötigt werden, um die Expression der Bernsteinmutante zu steuern.

Inkubieren Sie die Kulturen während der 30-minütigen Induktionsphase weitere 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Beschriften Sie sechs 15-Milliliter-Einweg-Zentrifugenröhrchen mit dem Zeitpunkt und entweder plus UV oder minus UV. Legen Sie die beschrifteten Röhrchen auf Eis.

Stellen Sie eine Sechs-Well-Gewebekulturplatte auf einen zweiten Eiskübel, der mit Eis gefüllt ist. Schalten Sie die UV-Lampe fünf Minuten vor der Funkbeschriftung ein. Geben Sie dann etwa zwei Milliliter Eis in jedes Röhrchen mit der Aufschrift minus UV und in zwei der Vertiefungen in der Multi-Well-Platte.

Es ist wichtig, das Eis direkt in die Röhrchen und Vertiefungen zu belüften, um intrazelluläre Reaktionen zu jedem Zeitpunkt sofort zu stoppen und so eine genaue Momentaufnahme des biochemischen Signalwegs am Ende der 30-minütigen Induktionsphase zu erhalten. 25 Milliliter der Kultur werden in einen vorgewärmten 125-Milliliter-Einweg-Erlenmeyerkolben umgefüllt. Stellen Sie den Kolben in das 37 Grad Celsius heiße Schüttelwasserbad.

Die Schritte der Pulsverfolgungsmarkierung und der UV-Bestrahlung müssen rechtzeitig durchgeführt werden und erfordern eine erhebliche Organisation und Vorabvorbereitung. Geben Sie 30 Mikrocurie pro Milliliter S 35-markiertes Methionin und Cystein in die Kultur und schwenken Sie sie schnell, um sie rechtzeitig zu mischen. Eine Minute null Sekunden.

Fügen Sie 250 Mikroliter einer nicht radioaktiven 100 millimolaren Methionin-Cystein-Lösung hinzu und schwenken Sie sie schnell. Zum sofortigen Mischen pipettieren Sie vier Milliliter der Kultur in eine der Vertiefungen der gekühlten Multi-Well-Platte, die Eis enthält, pipettieren Sie ein zweites Aliquot von vier Millilitern in das 15-Milliliter-Röhrchen mit der Aufschrift null Minuten minus UV. Zwei Minuten, null Sekunden.

Pipettieren Sie vier Milliliter der Kultur in eine zweite Vertiefung der gekühlten Multi-Well-Platte, die Eis enthält. Pipettieren Sie dann weitere vier Milliliter Aliquot in das 15-Milliliter-Röhrchen mit der Aufschrift eine Minute minus UV unmittelbar vor dem Fünf-Minuten-Zeitpunkt bei etwa zwei Millilitern Eis in eine dritte Vertiefung in der Multi-Well-Platte, und zwar zu Zeiten sechs Minuten null Sekunden. Pipettieren Sie vier Milliliter der Kultur in die dritte Vertiefung der gekühlten Multi-Well-Platte, die die Eispfeife enthält.

Hatte weitere vier Milliliter aliquot in das 15-Milliliter-Röhrchen mit der Aufschrift fünf Minuten minus UV. Stellen Sie den Eiskübel mit der Multi-Well-Platte unter die vorgeheizte UV-Lampe und bestrahlen Sie jede Probe einzeln vier Minuten lang. Übertragen Sie die Zellen in die gekühlten 15-Milliliter-Röhrchen mit der Aufschrift null Minuten plus UV, ein Minuten plus UV und so weiter.

Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 2.500 Mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie jede Probe in 300 Mikrolitern M neun Medium oder PBS und 33 Mikrolitern 100 % kalter Trichloressigsäure oder TCA, um die Proteine auszufällen, zentrifugieren Sie die TCA in einer Mikrofuge bei Höchstgeschwindigkeit für 10 Minuten. Vor der Entnahme des Sats geben Sie 50 Mikroliter Solubilisierungspuffer zu jeder Probe und erhitzen Sie sie fünf Minuten lang unter Rühren bei 95 Grad Celsius, um das gefällte Protein zu lösen.

Nach Zugabe von einem Milliliter Radioimmunpräzipitation führt der Assay-Puffer Standard-Immunpräzipitationen mit einem Fünftel bis der Hälfte jeder Probe durch. Lösen Sie die immunpräzipitierten Proteine durch Natrium-ESAL-Sulfat, Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder SDS-Seite auf. Schließlich wurden die gefärbten und getrockneten Gele über Nacht einem Phospho-Sieb ausgesetzt und um radioaktive Proteine, einschließlich Vernetzungsprodukte, mit einem Phospho-Imager zu detektieren, wurde eine ortsspezifische Photovernetzung verwendet, um Proteine zu identifizieren, die mit ESPP auf seinem Weg zur äußeren Membran interagieren.

Für dieses Experiment wurden pH-Alanin-Codons an den Resten 1113 und 1214 der ESPP-beta-Domäne durch Amber-Codons ersetzt. Die Kristallstruktur der ESPP-Beta-Domäne zeigt, dass sich die beiden Reste beide auf der periplasmatischen Seite des Beta-Zylinders befinden und etwa 120 Grad voneinander entfernt sind. Zwei verschiedene Polypeptide wurden sowohl aus bestrahlten als auch aus Kontrollzellen durch das C-terminale Anti-ESPP und Serum immunpräzipitiert.

Zu einem späteren Zeitpunkt überwog zunächst eine etwa 135 Kilodalton schwere Vorläuferform des Proteins, die kovalent verknüpfte Passagier- und Beta-Domänen enthält. Der PRO-ESPP-Spiegel sank und die freie Beta-Domäne begann zu dominieren, da die Passagierdomäne durch die äußere Membran translokalisiert und durch eine proteolytische Spaltung von der Beta-Domäne getrennt wurde. Die UV-I-bestrahlten Proben wiesen jedoch deutlich höhere Molekulargewichtsbanden auf, die in den Kontrollproben nicht vorhanden waren.

Diese Banden resultieren aus der Vernetzung von PRO ESPP mit interagierenden Proteinen Basierend auf der Mobilität dieser Polypeptide wurden die Größen der interagierenden Proteine geschätzt, um zu testen, ob sie den bekannten Assemblierungsfaktoren des Außenmembranproteins entsprechen könnten. Zusätzliche Immunpräzipitationen mit Anti-Cera, die gegen die mutmaßlichen Interaktionspartner erzeugt wurden, wurden durchgeführt. Ein ungefähr 150 Kilodalton Polypeptid, das beobachtet wurde, wenn BPA an beiden Resten 1113 und 1214 eingebaut wurde, konnte mit einem Antiserum gegen den 17 Kilodalton periplasmatischen Chaperon-Skip immunpräzipitiert werden.

Darüber hinaus fanden wir, dass größere Polypeptide, die beobachtet wurden, wenn BPA nur an einer der beiden Positionen eingebaut wurde, mit Anti-Cera gegen die Untereinheiten des BAM-Komplexes, BAM B bzw. BAM D, immunpräzipitiert werden konnten. Nach Durchführung dieses Verfahrens können Vernetzungsprodukte gereinigt und andere Methoden, einschließlich Massenspektrometrie, durchgeführt werden, um Faktoren zu identifizieren, die mit einem Protein von Interesse interagieren. Nach dem Anschauen mit dem Video sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Pulsverfolgungsmarkierung erfolgreich mit ortsspezifischer Fotovernetzung kombinieren können, um die Dynamik der Wechselwirkung Ihres Proteins mit anderen Molekülen in der lebenden Zelle zu untersuchen.