Name: Überwachung der Montage einer sezernierte bakterielle Virulenz-Faktor mit Site-spezifische Vernetzung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Erfahren Sie die Methode zur Untersuchung dynamischer Protein-Protein-Interaktionen in vivo mittels ortsspezifischer Photo-Vernetzung und Pulse-Chase-Markierung in E. coli. Diese Technik ermöglicht die zeitaufgelöste Analyse von Assemblierungsprozessen.

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Diese Arbeit wurde durch das Intramurale Forschungsprogramm des National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases unterstützt.

1. Plasmid-Konstruktion
<ol>
	<li>Nach der Klonierung eines Gens, das für ein Protein von Interesse kodiert, in einen geeigneten Expressionsvektor führen Sie Bernsteinmutationen an den gewünschten Stellen mit einem ortsgerichteten Mutagenese-Kit ein. 
	HINWEIS: Strukturelle Informationen und Vorhersagen zur Oberflächenexposition können als nützliche Anhaltspunkte dienen, um die Positionen von Mutationen zu bestimmen. Da die Effizienz der bernsteinfarbenen Suppression und Vernetzung erheblich variieren kann, sollten bernsteinfarbene Mutationen an mehreren Stellen eingeführt werden. Da Bpa ein Analogon von Tyrosin und Phenylalanin ist, versuchen Sie außerdem, bernsteinfarbene Mutationen an Positionen einzuführen, die normalerweise große hydrophobe Aminosäuren kodieren, um Störungen der Proteinstruktur und -funktion zu minimieren. Bei der Auswahl eines Expressionsvektors ist zu berücksichtigen, dass die Überproduktion eines interessierenden Proteins auf einem sehr hohen Niveau die Effizienz des Bpa-Einbaus einschränken kann.</li>
</ol>
2. Vorbereitung der Kultur
<ol>
	<li>Verwenden Sie die Elektroporation, um einen geeigneten E. coli-Stamm mit einem Plasmid zu transformieren, das für das bernsteinfarbene Suppressionssystem (pDULE-p Bpa; siehe Referenz4) kodiert, und einem kompatiblen Plasmid, das für das Protein von Interesse mit einer bernsteinfarbenen Mutation kodiert.</li>
	<li>Plattenzellen auf LB-Agar, die geeignete Antibiotika enthalten (verwenden Sie 5 μg/ml Tetracyclin zur Selektion für pDULE-p Bpa). Die Platten O/N bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Am nächsten Tag beginnen Sie mit O/N-Kulturen aus Einzelkolonien in 3-5 ml M9 Medium14, das 0,2 % Glycerin, alle L-Aminosäuren außer Methionin und Cystein (40 μg/ml) und Antibiotika enthält. Inkubieren bei 37 °C.</li>
	<li>Am nächsten Tag zentrifugieren Sie O/N-Kulturen bei 2.500 x g für 5 min bei RT zu Pelletzellen. Resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml frischem M9-Medium und wiederholen Sie die Zentrifugation. 
	HINWEIS: Dieser Waschschritt ist entscheidend für die Aufrechterhaltung von Plasmiden, die für eine Ampicillinresistenz kodieren, da kleine Mengen an b-Lactamase, die im Medium aus O/N-Kulturen vorhanden sind, frisch zugesetztes Ampicillin abbauen, bevor ein signifikantes Zellwachstum auftritt.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml frischem Medium und messen Sie die Zellkonzentration in einem Spektralphotometer (OD550).</li>
	<li>Die Zellen werden in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben gegeben, der 50 ml M9-Medium und Antibiotika bei OD550 = 0,03 enthält. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 °C in einem Schüttelwasserbad.</li>
</ol>
3. Bpa-Inkorporation und Vorbereitung für Photocrosslinking
HINWEIS: Das unten beschriebene Protokoll gilt für einen Beispielzeitverlauf mit drei Zeitpunkten (0, 1 und 5 Minuten). Passen Sie die Lautstärke entsprechend an, wenn eine andere Anzahl von Zeitpunkten gewünscht wird. Ein Überblick über das Vorgehen ist in Abbildung 1 dargestellt.
<ol>
	<li>Während die Kulturen wachsen, bereiten Sie eine frische 1 M (1.000x) Lösung von Bpa in 1 M NaOH (27 mg Bpa in 100 μl 1 M NaOH) vor. Verwende ein dunkelwandiges Rohr, um die Lösung im Dunkeln zu halten.</li>
	<li>Wenn die Kulturen die frühe bis mittlere logarithmische Phase (OD550 = 0,2) erreichen, fügen Sie jeder Kultur 50 μl 1 M Bpa hinzu. Geben Sie Bpa tropfenweise hinzu, während Sie den Kolben schwenken, um Ausfällungen zu vermeiden. Fügen Sie als Nächstes alle Induktoren hinzu, die benötigt werden, um die Expression der Bernsteinmutante zu steuern. Inkubieren Sie die Kulturen weitere 30 Minuten lang bei 37 °C.</li>
	<li>Während der 30-minütigen Einarbeitungszeit beschriften Sie sechs 15-ml-Einweg-Zentrifugenröhrchen mit dem Zeitpunkt (0 min, 1 min, 5 min) und entweder "+ UV" oder "- UV". Lege die Röhren auf Eis.</li>
	<li>Füllen Sie einen zweiten Eiskübel mit Eis und legen Sie eine 6-Well-Gewebekulturplatte auf das Eis.</li>
	<li>Tauen Sie die hohe spezifische Aktivität (1.000 mCi/mmol) von 35S-Methionin und 35S-Cystein (oder eine vorgefertigte Mischung aus den beiden Verbindungen) für die Impulsmarkierung auf und bereiten Sie eine Lösung aus nicht-radioaktivem L-Cystein und L-Methionin (jeweils 100 mM) für die Jagd vor (oder tauen Sie</li> sie auf).
	<li>Schalten Sie die UV-Lampe fünf Minuten vor der Radiomarkierung ein. 
	HINWEIS: Die Lampe sollte so verstellbar sein, dass sie ~3-4 cm von den Proben in der Multiwell-Platte entfernt positioniert werden kann.</li>
	<li>Geben Sie Eis (~2 ml) in jedes Röhrchen mit der Bezeichnung "- UV" und in zwei der Vertiefungen in der Multiwell-Platte. 
	HINWEIS: Eis sollte unmittelbar vor dem 5-Minuten-Zeitpunkt in eine dritte Vertiefung gegeben werden. Es ist wichtig, Eis direkt in die Röhrchen und Vertiefungen zu geben, um intrazelluläre Reaktionen zu jedem Zeitpunkt sofort zu stoppen und so genaue "Momentaufnahmen" eines bestimmten biochemischen Signalwegs zu erhalten.</li>
	<li>Am Ende der 30-minütigen Induktionsphase werden 25 ml der Kultur in einen vorgewärmten 125-ml-Einweg-Erlenmeyerkolben überführt. Stellen Sie den Kolben in das 37 °C heiße Schüttelwasserbad.</li>
</ol>
4. Pulse-Chase-Markierung und UV-Bestrahlung
HINWEIS: Das Pulsverfolgungsmarkierungs- und UV-Bestrahlungsprotokoll besteht aus vielen Schritten, die zeitnah durchgeführt werden müssen und die eine beträchtliche Organisation und Vorbereitung im Voraus erfordern. Alle Reagenzien und Röhrchen sollten leicht zugänglich sein. Im Folgenden finden Sie ein Protokoll für ein Experiment mit Zeitpunkten von 0, 1 und 5 Minuten.
<ol>
	<li>Zum Zeitpunkt 0:00 (min:sec) werden 25 ml Kultur in einen 125-ml-Kolben überführt.</li>
	<li>Zum Zeitpunkt 0:30 werden 30 μCi/ml radioaktive Aminosäuren zugegeben; zum Mischen schnell schwenken. Stellen Sie den Kolben in das 37 °C heiße Schüttelwasserbad.</li>
	<li>Um 1:00 Uhr werden 250 μl der 100 mM Methionin-Cystein-Lösung zugegeben; zum Mischen schnell schwenken.
	<ol>
		<li>4 ml der Kultur werden sofort in eine der Vertiefungen der gekühlten Multiwell-Platte pipettiert, die Eis enthält. Pipettieren Sie ein zweites 4-ml-Aliquot in das 15-ml-Röhrchen mit der Aufschrift "0 min - UV". Stellen Sie den Kolben wieder in das Wasserbad.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Um 14:00 Uhr pipettieren Sie 4 ml der Kultur in die zweite Vertiefung der gekühlten Multiwell-Platte, die Eis enthält. Weitere 4 ml aliquot werden in das 15-ml-Röhrchen mit der Aufschrift "1 min - UV" pipettiert. Der Kolben wird wieder in das Wasserbad gestellt.</li>
	<li>Um 18:00 Uhr pipettieren Sie 4 ml der Kultur in die dritte Vertiefung der gekühlten Multiwell-Platte, die Eis enthält. Pipettieren Sie weitere 4 ml aliquot in das 15 ml Röhrchen mit der Aufschrift "5 min - UV".</li>
	<li>Stellen Sie den Eiskübel mit der Multiwell-Platte unter die vorgeheizte UV-Lampe und bestrahlen Sie jede Probe einzeln für 4 min. 
	HINWEIS: Bei Experimenten, bei denen die Zeitpunkte mindestens 4 Minuten voneinander entfernt sind, sollte jede Probe bestrahlt werden, sobald sie in die Multiwell-Platte pipettiert wird.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen in die gekühlten 15-ml-Röhrchen mit der Aufschrift "0 min +UV", 1 min +UV" usw.</li>
	<li>Zellen bei 2.500 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Resuspendieren Sie jede Probe in 300 μl M9-Medium oder PBS und fügen Sie 33 μl 100 % kalte Trichloressigsäure (TCA) hinzu, um Proteine auszufällen. Die TCA-Ausfällungen in einer Mikrofuge bei Höchstgeschwindigkeit für 10 min zentrifugieren und den Überstand entfernen. Zu diesem Zeitpunkt können die Proben bei - 20 °C gelagert werden.</li>
</ol>
5. Immunpräzipitation und Nachweis von Vernetzungsprodukten
<ol>
	<li>Geben Sie 50 μl Solubilisierungspuffer (15 % Glycerin, 200 mM Trisbase, 15 mM EDTA, 4 % SDS, 2 mM PMSF) zu jeder Probe und erhitzen Sie sie 5 Minuten lang unter Rühren bei 95 °C, um das gefällte Protein zu lösen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml RIPA-Puffer (Radioimmunoprecipitation Assay) hinzu (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 1,0 % Igepal CA-630, 0,5 % Desoxycholat, 0,1 % SDS) und führen Sie Standard-Immunpräzipitationen15 mit einem Fünftel bis zur Hälfte jeder Probe durch. 
	HINWEIS: Igepal CA-630 (Octylphenyl-Polyethylenglykol) wird anstelle von NP-40 verwendet, das nicht mehr im Handel erhältlich ist. Die beiden Verbindungen sind chemisch nicht zu unterscheiden.</li>
	<li>Immunpräzipitierte Proteine mittels SDS-PAGE auflösen. Färben, entfärben und trocknen Sie Gele.</li>
	<li>Setzen Sie Gele einem Phosphor-Screen-O/N aus und weisen Sie radioaktive Proteine (einschließlich Vernetzungsprodukte) mit einem Phosphorimager nach.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).</li>
<li>von Mering, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+large-scale+data+sets+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions.</a> Nature. 417, 399-403 (2002).</li>
<li>Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+a+photocrosslinking+amino+acid+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli.</a> PNAS. 99, 11020-11024 (2002).</li>
<li>Farrell, I. S., Toroney, R., Hazen, J. L., Mehr, R. A., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-cross-linking+interacting+proteins+with+a+genetically+encoded+benzophenone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Photo-cross-linking interacting proteins with a genetically encoded benzophenone.</a> Nat. Methods. 2 (5), 377-384 (2005).</li>
<li>Wittelsberger, A., Mierke, D. F., Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+ligand-receptor+interfaces%3A+approaching+the+resolution+limit+of+benzophenone-based+photaffinity+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol.+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Mapping ligand-receptor interfaces: approaching the resolution limit of benzophenone-based photaffinity scanning.</a> Chem. Biol. Drug Des. 71, 380-383 (2008).</li>
<li>Ieva, R., Tian, P., Peterson, J. H., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+and+spatially+restricted+interactions+of+assembly+factors+with+an+autotransporter+beta+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Sequential and spatially restricted interactions of assembly factors with an autotransporter beta domain.</a> PNAS. 108, 383-391 (2011).</li>
<li>Wang, F., Robbins, S., Guo, J., Shen, W., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Deiters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+amino+acids+with+novel+reactivity+to+the+genetic+code+of+Saccharyomycescerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharyomycescerevisiae.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 11782-11783 (2003).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Brock, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+repertoire+of+the+methylotrophic+yeast+Pichiapastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic repertoire of the methylotrophic yeast Pichiapastoris.</a> Biochemistry. 48 (12), 2643-2653 (2009).</li>
<li>Hino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+photo-cross-linking+in+mammalian+cells+by+site-specific+incorporation+of+a+photoreactive+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid.</a> Nat. Methods. 2 (3), 201-206 (2005).</li>
<li>Liu, W., Brock, A., Chen, S., Chen, S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 4 (3), 239-244 (2007).</li>
<li>Leyton, D. L., Rossiter, A. E., Henderson, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+self+sufficiency+to+dependence%3A+mechanisms+and+factors+important+for+autotransporter+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">From self sufficiency to dependence: mechanisms and factors important for autotransporter biogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 10 (3), 213-225 (2012).</li>
<li>Ieva, R., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+an+autotransporter+passenger+domain+with+BamA+during+its+translocation+across+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Interaction of an autotransporter passenger domain with BamA during its translocation across the bacterial outer membrane.</a> PNAS. 106, 19120-19125 (2009).</li>
<li>Pavlova, O., Peterson, J. H., Ieva, R., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+link+between+barrel+assembly+and+the+initiation+of+autotransporter+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Mechanistic link between barrel assembly and the initiation of autotransporter secretion.</a> PNAS. 110, (2013).</li>
<li>Harlow, D., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+D+%22Using+antibodies%3A+a+laboratory+manual%22">Using antibodies: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laborator Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).</li>
<li>Barnard, T. J., Dautin, N., Lukacik, N., Bernstein, P., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autotransporter+structure+reveals+intra-barrel+cleavage+followed+by+conformational+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autotransporter structure reveals intra-barrel cleavage followed by conformational changes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (12), 1214-1220 (2007).</li>
<li>Akiyama, Y., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SecY+protein%2C+a+membrane-embedded+secretion+factor+of+E.+coli%2C+is+cleaved+by+the+ompT+protease+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">SecY protein, a membrane-embedded secretion factor of E. coli, is cleaved by the ompT protease in vitro.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 167 (2), 711-715 (1990).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

In dieser Arbeit wird eine Methode beschrieben, die ortsspezifische Photovernetzung mit Pulse-Chase-Markierung kombiniert, um die Dynamik der Wechselwirkungen zwischen einem Protein von Interesse und anderen Komponenten einer lebenden Zelle zu untersuchen. Die Methode ist besonders nützlich, um mehrstufige Prozesse zu untersuchen, bei denen das Protein sequentiell mit anderen Faktoren interagiert. Im Gegensatz zu herkömmlichen chemischen Vernetzungsansätzen liefert die ortsspezifische Photovernetzung detaillierte Informa...

Es ist oft wichtig, Wechselwirkungen zwischen einem Protein von Interesse und anderen zellulären Komponenten zu identifizieren und zu charakterisieren, um seine Rolle in einem biologischen Signalweg zu definieren, seine Assemblierung zu verstehen oder seinen Wirkmechanismus aufzuklären. Eine Vielzahl von Ansätzen wird häufig verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, aber alle haben ihre Grenzen. Die einfachste unvoreingenommene Methode zur Identifizierung von Proteinen, die an ein Protein von Interesse binden, ist die Coreinigung (oder Coimmunpräzipitation), aber dieser Ansatz erfordert, dass ein Proteinkomplex während des Aufreinigungsverfahrens intakt bleibt. Schwache oder vorübergehende Proteinwechselwirkungen können durch chemische Vernetzung stabilisiert werden, aber diese Methode erfordert in der Regel die Verwendung von Verbindungen, die Proteine über primäre Amine verbinden, die in der Proteinsequenz weit verstreut sind. Komplizierte Vernetzungsmuster, die schwer zu interpretieren sind, können erzeugt werden, insbesondere wenn die interessierenden Proteine Bestandteile von Multiproteinkomplexen sind. Da die Spacerarme chemischer Vernetzer im Allgemeinen eine Länge von mehr als 10 Å überschreiten, können kovalente Bindungen mit Proteinen gebildet werden, die sich in der Nähe des interessierenden Proteins befinden, aber nicht direkt mit ihm interagieren. Methoden wie Affinitätschromatographie und Zwei-Hybrid-Screens sind ebenfalls oft nützlich, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu identifizieren. Der erste Ansatz erfordert jedoch die Reproduktion von Bedingungen, die physiologisch signifikante Wechselwirkungen begünstigen und nicht zum Nachweis schwacher Wechselwirkungen verwendet werden können. Der letztere Ansatz setzt voraus, dass Bindungsinteraktionen im Wirtsorganismus repliziert werden können und aufrechterhalten werden, wenn ein Protein von Interesse und seine Bindungspartner in den Kontext eines Fusionsproteins gestellt werden. Zwei-Hybrid-Methoden neigen auch dazu, falsch-positive Ergebnisse zu generieren2. Ist eine Protein-Protein-Wechselwirkung erst einmal festgestellt, ist oft erheblicher Aufwand erforderlich, um den Ort der Wechselwirkung zu kartieren. Der vielleicht bedeutendste Nachteil traditioneller Ansätze besteht darin, dass sie keine Informationen über die zeitliche Abfolge intermolekularer Wechselwirkungen oder die Kinetik der Bindung liefern.
Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode, die einige der Einschränkungen anderer Ansätze überwindet, die zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden. Zunächst wird eine einzelne bernsteinfarbene Mutation in das Gen eingeführt, das für ein Protein von Interesse kodiert. Die bernsteinfarbene Mutante wird dann mit einer bernsteinfarbenen Suppressor-tRNA und einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase koexprimiert, die von Methanococcus jannaschii abgeleitet sind und so konstruiert wurden, dass sie das photoaktivierbare Aminosäureanalogon p-Benzoylphenylalanin (Bpa) nur an bernsteinfarbenen Codons3 einbauen. Die Bestrahlung von Zellen mit langwelligem ultraviolettem (UV) Licht (~365 nm) erleichtert dann die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen Bpa und Proteinen, die sich innerhalb von ~3-8 Å4,5 befinden. In einigen experimentellen Kontexten können auch Quervernetzungen zwischen aktiviertem Bpa und Nichtproteinkomponenten von Zellen wie Lipiden und Nukleinsäuren gebildet werden6. Moleküle, die am bernsteinfarbenen Codon terminiert sind, sollten im Allgemeinen leicht von dem Protein in voller Länge auf SDS-PAGE unterscheidbar sein und können nicht mit anderen Proteinen vernetzt werden. Indem die Zellen vor der Vernetzung einer Pulsverfolgungs-Radiomarkierung unterzogen werden und anschließend immunpräzipitierende oder affinitätsreinigende Vernetzungsprodukte hergestellt werden, können die Abfolge und Dauer der Protein-Protein-Wechselwirkungen bestimmt werden. Die Fähigkeit, zeitliche Informationen über intermolekulare Wechselwirkungen zu generieren, ist besonders wertvoll, um die Progression eines Proteins von Interesse durch einen geordneten mehrstufigen Assemblierungs-, Transport- oder Signalweg zu untersuchen und Zwischenprodukte zu identifizieren. Wie die chemische Vernetzung erkennt auch die ortsspezifische Vernetzung Protein-Protein-Wechselwirkungen, die unter physiologischen Bedingungen auftreten, aber die Einführung eines Vernetzers an einer einzigen Position erleichtert die Analyse von Wechselwirkungen zwischen einzelnen Segmenten eines Proteins und anderen Faktoren. Diese einzigartige Eigenschaft der ortsspezifischen Vernetzung ist besonders vorteilhaft, wenn das Protein von Interesse mehrere Segmente oder Domänen aufweist, die das Potenzial haben, mit unterschiedlichen Bindungspartnern zu interagieren. Darüber hinaus kann die ortsspezifische Vernetzung in Kombination mit Methoden wie der Massenspektrometrie genutzt werden, um die Rückstände, die Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln, präzise zu kartieren. Obwohl diese Methode für den Einsatz in E. coli optimiert ist, wurde der Einbau von photoaktivierbaren Aminosäureanaloga in Proteine durch Bernsteinsuppression in Mycobacterium-, Hefe- und Säugetierzellen berichtet7-11. Somit kann unsere Methode prinzipiell auch in anderen Systemen eingesetzt werden.
Wir haben diese Methode ausgiebig verwendet, um intermolekulare Wechselwirkungen zu identifizieren, die die Biogenese von EspP, einem E. coli O157:H7-Virulenzfaktor, erleichtern. EspP gehört zu einer Superfamilie von Proteinen, die als "Autotransporter" bekannt sind und eine große N-terminale extrazelluläre Domäne ("Passagierdomäne") und eine aC-terminale Domäne ("b-Domäne") enthalten, die sich zu einer zylindrischen b-Fassstruktur falten und das Protein an der äußeren Membran (OM) verankern12. Der Mechanismus, durch den der Passagierbereich über das OM verlagert wird, war lange Zeit ein Rätsel. Wie alle bakteriellen Zelloberflächenproteine muss EspP durch die innere Membran transportiert, durch das Periplasma (den Raum zwischen der inneren und äußeren Membran) transportiert und in einer Reihe von geordneten Ereignissen zum OM geleitet werden. Nach ihrer Translokation durch das OM wird auch die EspP-Passagierdomäne durch eine proteolytische Spaltung von der b-Domäne getrennt und von der Zelloberfläche freigesetzt. Durch die Kombination von ortsspezifischer Vernetzung mit Pulse-Chase-Radiomarkierung haben wir gezeigt, dass beide Domänen des Proteins zunächst mit dem molekularen Chaperon Skp im Periplasma interagieren6. Anschließend interagieren diskrete Segmente der b-Domäne auf stereospezifische Weise mit Komponenten eines Heterooligomers, dem sogenannten Bam-Komplex, der die Integration von b-Fassproteinen in das bakterielle OM durch einen unbekannten Mechanismus katalysiert. Am interessantesten ist vielleicht, dass wir herausgefunden haben, dass die Passagierdomäne mit einer der Untereinheiten des Bam-Komplexes (BamA) in Kontakt steht, während sie den OM13 durchquert. Unsere Ergebnisse haben es uns ermöglicht, ein detailliertes Modell für die Autotransporter-Montage14 zu konstruieren und den Bam-Komplex in den Transport des Passagierbereichs über den OM einzubeziehen.

<table><tbody><tr><td>QuikChange II Site-Directed Mutagenese Kit</td><td>Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>BPA (H-p-Bz-Phe-OH)</td><td>Bachem</td><td>F-2800</td><td></td></tr><tr><td>TRAN35S-LABEL, Reagenz für die metabolische Markierung (35S-L-Methionin und 35S-L-Cystein, >1.000 Ci/mmol)</td><td>MP Biomedicals</td><td>51006</td><td></td></tr><tr><td>Spektroline SB-100P Super-High-Intensity UV-Lampe, 365 nm</td><td>Spectronics Corporation</td><td>SB-110P</td><td></td></tr><tr><td>Spektroline Ersatzlampe 100S</td><td>Spectronics Corporation</td><td>11-992-15</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Gewebekulturplatte, 6-well</td><td>Becton Dickinson Laborbedarf</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Einweg 125 ml Erlenmeyerkolben</td><td>Corning</td><td>430421</td><td></td></tr><tr><td>Innova 3100 Schüttelwasserbad</td><td>Neu Brunswick Scientific</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

Überwachung der montage einer sezernierte bakterielle virulenz-faktor mit site-spezifische vernetzung

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zum Nachweis und zur Analyse dynamischer Wechselwirkungen zwischen einem Protein von Interesse und anderen Faktoren in vivo. Unsere Methode basiert auf der Bernsteinunterdrückungstechnologie, die ursprünglich von Peter Schultz und Kollegen1 entwickelt wurde. Eine bernsteinfarbene Mutation wird zuerst an einem bestimmten Codon des Gens eingeführt, das für das Protein von Interesse kodiert. Die Bernsteinmutante wird dann in E. coli exprimiert, zusammen mit Genen, die für eine bernsteinfarbene Suppressor-tRNA und eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase kodieren, die von Methanococcus jannaschii abgeleitet ist. Mit diesem System wird das photoaktivierbare Aminosäureanalogon p-Benzoylphenylalanin (Bpa) am Amber-Codon eingebaut. Die Zellen werden dann mit ultraviolettem Licht bestrahlt, um den Bpa-Rest kovalent an Proteine zu binden, die sich innerhalb von 3-8 Å befinden. Die Photovernetzung wird in Kombination mit Pulse-Chase-Markierung und Immunpräzipitation des interessierenden Proteins durchgeführt, um Veränderungen in Protein-Protein-Wechselwirkungen zu überwachen, die über eine Zeitskala von Sekunden bis Minuten auftreten. Wir haben das Verfahren optimiert, um den Zusammenbau eines bakteriellen Virulenzfaktors zu untersuchen, der aus zwei unabhängigen Domänen besteht, einer Domäne, die in die äußere Membran integriert ist, und einer Domäne, die in den extrazellulären Raum transloziert ist, aber die Methode kann verwendet werden, um viele verschiedene Assemblierungsprozesse und biologische Signalwege sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Zellen zu untersuchen. Prinzipiell können wechselwirkende Faktoren und sogar spezifische Reste von wechselwirkenden Faktoren, die an ein Protein von Interesse binden, durch Massenspektrometrie identifiziert werden.

Wir verwendeten standortspezifisches Photovernetzen, um Proteine zu identifizieren, die während des Transports von EspP zur äußeren Membran (OM) mit diesem interagieren. In den hier gezeigten Experimenten wurden Phenylalanin-Codons an den Positionen 1113 und 1214 durch Amber-Codons ersetzt. Beide Positionen liegen in der β-Domäne, die in die OM integriert wird und als Membrananker dient. Die Kristallstruktur der EspP-β-Domäne16 zeigt, dass die beiden Reste auf der periplasmatischen Seite des β-Fasses liegen, j...

Dieser Artikel veranschaulicht die Verwendung von Pulse-Chase-Radiomarkierung in Kombination mit ortsspezifischer Photovernetzung, um Wechselwirkungen zwischen einem Protein von Interesse und anderen Faktoren in E. coli zu überwachen. Im Gegensatz zu herkömmlichen chemischen Vernetzungsmethoden erzeugt dieser Ansatz hochauflösende "Schnappschüsse" eines geordneten Assemblierungswegs in einer lebenden Zelle.

Überwachung der Montage einer sezernierte bakterielle Virulenz-Faktor mit Site-spezifische Vernetzung

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Dynamik von Protein-Protein-Interaktionen innerhalb einer lebenden Zelle zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Protein von Interesse in E. coli exprimiert, das Aminosäure-Analogon Benzoylphenylalanin an einer bestimmten Stelle in das Protein eingebaut und eine Puls-Chase-Radio-Markierung durchgeführt wird, um eine kleine Population synchron synthetisierter Proteinmoleküle zu markieren. Als zweiter Schritt.Aliquote von Zellen, die zu verschiedenen Zeitpunkten während der Chase gesammelt wurden, werden UV-bestrahlt, um die Bildung kovalenter Bindungen zwischen dem Protein von Interesse und allen Faktoren, mit denen es wechselwirkt, auszulösen. Anschließend werden die Proteine mit spezifischen Antikörpern immunpräzipitiert und mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt, um wechselwirkende Faktoren zu identifizieren. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen zeitliche Veränderungen in den Wechselwirkungen zwischen dem Protein von Interesse und anderen intrazellulären Faktoren, basierend auf Änderungen der elektrophoretischen Mobilität der Vernetzungsprodukte. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Co-Immunpräzipitation oder der chemischen Vernetzung besteht in ihrer Fähigkeit, zeitliche Informationen über Wechselwirkungen bereitzustellen, die zwischen einem spezifischen Rest in einem Protein von Interesse und anderen Molekülen stattfinden.Solche Daten sind besonders wertvoll beim Studium des Fortschreitens eines Proteins entlang eines mehrstufigen Assemblierungsweges und zur Identifizierung von Assemblierungsintermediaten. Obwohl diese Methode für die Anwendung in E. coli optimiert wurde, kann sie ebenfalls in anderen Systemen eingesetzt werden, einschließlich anderer Bakterien, Hefe und Säugetierzellen. Einzelheiten zur Kulturpräparation sind im Textprotokoll enthalten.Bereiten Sie kurzfristig fünf Milliliter M-neun-Medium mit 0,2 % Glycerin, allen el-Aminosäuren mit Ausnahme von Methionin und Cystin sowie Antibiotika vor. Beginnen Sie Übernachtkulturen, indem Sie E. coli, die mit einem Plasmid transformiert wurden, das für das Protein von Interesse mit einer Amber-Mutation kodiert, und mit dem Plasmid, das für das Amber-Suppressionssystem kodiert, hinzufügen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius. Am Tag des Experiments geben Sie eine geeignete Zellmenge aus der Übernachtkultur zu einem 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben, der 50 Milliliter M-neun-Medium und Antibiotika enthält, um eine optische Dichte bei 550 Nanometern von 0,03 zu erreichen. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius in einem schüttelnden Wasserbad.Wenn die Kulturen die frühe bis mittlere log-Phase erreicht haben, geben Sie 50 Mikroliter einer einmolaren Benzoylphenylalanin- oder BPA-Lösung zu jeder Kultur hinzu. Fügen Sie BPA tropfenweise hinzu, während Sie das Kolbeninhalts vorsichtig schwenken, um eine Ausfällung zu vermeiden. Danach geben Sie alle erforderlichen Induktoren zu, die zur Expression des Amber-Mutanten benötigt werden.Setzen Sie die Inkubation der Kulturen während der 30-minütigen Induktionsphase weitere 30 Minuten bei 37 Grad Celsius fort. Beschriften Sie sechs Einweg-Zentrifugenröhrchen mit 15 Milliliter mit dem Zeitpunkt und entweder „+ UV“ oder „– UV“. Stellen Sie die beschrifteten Röhrchen auf Eis.Stellen Sie eine sechs-Loch-Zellkulturplatte auf einen zweiten Eisbehälter, der mit Eis gefüllt ist. Schalten Sie die UV-Lampe fünf Minuten vor der Radio-Markierung ein. Geben Sie dann etwa zwei Milliliter Eis in jedes mit „ohne UV“ gekennzeichnete Gefäß und in zwei der Vertiefungen der Mehrfach-Platte.Es ist entscheidend, Luft-Eis direkt in die Röhrchen und Vertiefungen einzubringen, um intrazelluläre Reaktionen zu jedem Zeitpunkt unmittelbar zu stoppen und so einen genauen Überblick über den biochemischen Weg am Ende der 30-minütigen Induktionsphase zu erhalten. Übertragen Sie 25 Milliliter der Kultur in einen vorgewärmten, 125 Milliliter fassenden Einweg-Erlenmeyerkolben. Stellen Sie den Kolben in das schüttelnde Wasserbad bei 37 Grad Celsius.Die Schritte der Puls-Chase-Markierung und der UV-Bestrahlung müssen zeitgerecht durchgeführt werden und erfordern eine sorgfältige Organisation und umfassende Vorbereitung. Geben Sie 30 Mikrocurie pro Milliliter S 35-markiertes Methionin und Cystein zur Kultur hinzu und mischen Sie die Lösung sofort durch vorsichtiges Schwenken. Ein Minute null Sekunden.Fügen Sie 250 Mikroliter einer nicht-radioaktiven 100-Millimolar-Methionin-Cystein-Lösung hinzu und schwenken Sie schnell. Umgehend 4 Milliliter der Kultur in eines der Vertiefungen der gekühlten Mehrfachplatte pipettieren, die Eis enthält, und einen zweiten 4-Milliliter-Aliquot in das mit „Null Minuten minus UV“ beschriftete 15-Milliliter-Röhrchen zum Zeitpunkt zwei Minuten null Sekunden geben.Pipettieren Sie vier Milliliter der Kultur in ein zweites Loch der gekühlten Mehrlochplatte, das Eis enthält. Danach pipettieren Sie einen weiteren vier Milliliter großen Aliquot in das 15-Milliliter-Röhrchen, das mit „eine Minute minus UV“ beschriftet ist, unmittelbar vor dem Fünf-Minuten-Zeitpunkt, und geben etwa zwei Milliliter Eis in ein drittes Loch der Mehrlochplatte zum Zeitpunkt sechs Minuten null Sekunden. Pipettieren Sie vier Milliliter der Kultur in das dritte Loch der gekühlten Mehrlochplatte, das Eis enthält, in die Pipette.Gegeben Sie ein weiteres vier Milliliter Aliquot in das 15-Milliliter-Röhrchen, das mit fünf Minuten minus UV beschriftet ist. Stellen Sie den Eiskübel mit der Mehrlochplatte unter die vorgewärmte UV-Lampe und bestrahlen Sie jede Probe einzeln vier Minuten lang. Überführen Sie die Zellen in die gekühlten 15-Milliliter-Röhrchen, die mit null Minuten plus UV, eine Minute plus UV und so weiter beschriftet sind.Anschließend die Zellen bei 2.500 × g zehn Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Jede Probe in 300 Mikroliter M9-Medium oder PBS und 33 Mikroliter 100 % kalter Trichloressigsäure oder TCA resuspendieren, um die Proteine zu fällen. Die TCA-Präzipitate in einer Mikrozentrifuge zehn Minuten lang bei maximaler Drehzahl zentrifugieren. Vor dem Entfernen der Überstände 50 Mikroliter Solubilisierungspuffer zu jeder Probe hinzufügen und unter Rühren fünf Minuten bei 95 Grad Celsius erhitzen, um das präzipitierte Protein aufzulösen.Nach Zugabe von einem Milliliter Radio-Immunpräzipitationspuffer führen Sie Standard-Immunopräzipitationen unter Verwendung von einem Fünftel bis zur Hälfte jeder Probe durch. Trennen Sie die immunopräzipitierten Proteine mittels Natrium-ESAL-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder SDS-PAGE. Belichten Sie schließlich die angefärbten und getrockneten Gele über Nacht auf einen Phospho-Screen und detektieren Sie radioaktive Proteine einschließlich der Vernetzungsprodukte mit einem Phospho-Imager. Spezifische photochemische Vernetzung wurde verwendet, um Proteine zu identifizieren, die während des Transports von ESPP zur äußeren Membran mit diesem interagieren.Für dieses Experiment wurden die pH-Alanin-Codons an den Resten 1113 und 1214 der ESPP-Beta-Domäne durch Amber-Codons ersetzt. Die Kristallstruktur der ESPP-Beta-Domäne zeigt, dass sich die beiden Reste auf der Periplasma-Seite des Beta-Fasses befinden und etwa 120 Grad voneinander entfernt liegen. Zwei verschiedene Polypeptide wurden sowohl aus bestrahlten als auch aus Kontrollzellen mittels des C-terminalen anti-ESPP-Serums immunpräzipitiert.Zunächst dominierte eine Vorstufe des Proteins von etwa 135 Kilodalton, die kovalent verknüpfte Passagier- und Beta-Domänen enthält, zu späteren Zeitpunkten. Die Konzentration von PRO ESPP nahm ab, und die freie Beta-Domäne begann vorzuherrschen, während die Passagier-Domäne translokaliert über die äußere Membran transportiert und durch einen proteolytischen Schnitt von der Beta-Domäne getrennt wurde. Die mit UV I bestrahlten Proben wiesen jedoch eindeutig Banden mit höherem Molekulargewicht auf, die in den Kontrollproben nicht vorhanden waren.Diese Banden entstehen durch die Vernetzung von PRO ESPP mit wechselwirkenden Proteinen; basierend auf der Mobilität dieser Polypeptide wurden die Größen der interagierenden Proteine abgeschätzt, um zu prüfen, ob sie bekannten Faktoren der äußeren Membranprotein-Assemblierung entsprechen könnten. Zusätzliche Immunpräzipitationen unter Verwendung von Anti-Cera, das gegen die vermuteten Interaktionspartner erzeugt wurde, wurden durchgeführt. Ein ungefähr 150 Kilodalton großes Polypeptid, das beobachtet wurde, wenn BPA an den Resten 1113 und 1214 eingebaut wurde, konnte mittels eines Antiserums gegen den 17 Kilodalton großen periplasmatischen Chaperon Skip immunpräzipitiert werden.Außerdem stellten wir fest, dass größere Polypeptide, die beobachtet wurden, wenn BPA an nur einer der beiden Positionen eingebaut wurde, jeweils mit Anti-Cera-Antikörpern gegen die BAM-Komplex-Untereinheiten BAM B und BAM D immunpräzipitiert werden konnten. Nach Durchführung dieses Verfahrens können die Vernetzungsprodukte gereinigt und weitere Methoden wie die Massenspektrometrie angewendet werden, um interagierende Faktoren mit einem Protein von Interesse zu identifizieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Puls-Chase-Labeling-Methode erfolgreich mit ortsspezifischer photochemischer Vernetzung kombiniert, um die Interaktionsdynamik Ihres Proteins von Interesse mit anderen Molekülen in der lebenden Zelle zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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