Mikroskopische Analyse von Synapsen in Hippocampusschnitten der Maus mittels Immunfluoreszenz

Platzieren Sie eine Hippocampus-Scheibe aus einem Mäusegehirn in eine Vertiefung, die einen Puffer enthält. Die Scheibe enthält ein Netzwerk von Neuronen, die über Synapsen kommunizieren.

Präsynaptische Neuronenterminals enthalten Neurotransmitter-gefüllte Vesikel mit charakteristischen Transmembrantransportern, während postsynaptische Terminals charakteristische Gerüstproteine aufweisen, die Neurotransmitterrezeptoren regulieren. Beide dienen als Schlüsselmarker für synaptische Strukturen.

Den Puffer durch eine Permeabilisierungs-blockierende Lösung ersetzen und unter Rühren inkubieren, um die Zellmembranen zu permeabilisieren und unspezifische Bindungsstellen zu blockieren.

Primäre Antikörper hinzufügen, die auf die präsynaptischen und postsynaptischen Marker abzielen, und unter Rühren inkubieren, um eine Bindung zu ermöglichen.

Die Scheibe waschen, fluorophor-konjugierte Sekundärantikörper hinzufügen, die für die primären Antikörper spezifisch sind, und unter Rühren im Dunkeln inkubieren.

Waschen Sie die Scheibe und montieren Sie sie dann auf eine Folie.

Identifizieren Sie mit einem konfokalen Mikroskop den interessierenden Bereich und vergrößern Sie, um Synapsen sichtbar zu machen.

Nehmen Sie Bilder auf, um die fluoreszenzmarkierten präsynaptischen und postsynaptischen Marker zu identifizieren und ihre Kolokalisation an den Synapsen zu bewerten.

Um mit der Immunfluoreszenzfärbung zu beginnen, ersetzen Sie das PBS in den Slice-Wells durch blockierenden und permeabilisierenden Puffer und inkubieren Sie es 4 bis 6 Stunden lang bei Raumtemperatur auf dem Shaker. Gegen Ende des Blockierungsschritts verdünnen Sie den Antikörper zu VGLUT1 1 bis 2000 in blockierendem und permeabilisierendem Puffer. Bitte beachten Sie, dass diese Verdünnung je nach Unternehmen und Charge des verwendeten Antikörpers unterschiedlich sein kann. Inkubieren Sie die Scheiben über Nacht in der primären Antikörperlösung bei 4 Grad Celsius. Verwenden Sie eine Schüttelplattform mit kräftigen Bewegungen.

gleichmäßige Verteilung der Primär- und Sekundärantikörper ist wichtig für eine optimale Färbung. Unserer Erfahrung nach ermöglicht kräftiges Schütteln die beste Antikörperpenetration.

Nach der Inkubation im primären Antikörper waschen Sie die Scheiben dreimal dreimal für jeweils 10 Minuten in PBS, wie zuvor. Während der letzten Wäsche verdünnen Sie die entsprechenden Sekundärantikörper 1 bis 500 in Blockpuffer. Dann die Scheiben in dieser Lösung 2 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben vor Licht geschützt sind, da Sekundärantikörper lichtempfindlich sind.

Nachdem Sie die Scheiben wie zuvor gewaschen haben, nehmen Sie die Scheiben vorsichtig mit einer Bürste von der 24-Well-Platte und legen Sie sie gleichmäßig auf vorbeschriftete Objektträger. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf jede Scheibe. Legen Sie dann vorsichtig ein Deckglas auf die Scheiben und achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen bilden.

Vor Licht schützen und die Objektträger mindestens drei bis vier Tage bei Raumtemperatur trocknen lassen. Lagern Sie die Objektträger kurzfristig bei 4 Grad Celsius. Für die Langzeitlagerung sollten Sie sie jedoch bei minus 20 Grad Celsius aufbewahren. Beginnen Sie mit der Verwendung eines 10x- oder 20x-Objektivs, um die Region des Hippocampus zu identifizieren, die abgebildet werden soll - in diesem Fall die Synapsen zwischen den CA1-Pyramidenneuronen und den Schaffer-Kollateralaxonen.

Wechseln Sie zu einem 40x- oder 63x-Ölimmersionsobjektiv und stellen Sie sicher, dass die Anatomie der Scheibe intakt ist, indem Sie kontinuierliche Neuriten und eine organisierte Struktur identifizieren. Verwenden Sie einen neuronalen Marker, z. B. MAP2, als Referenz. Passen Sie die Einstellungen für jeden Kanal an, um ein optimales Signal und einen optimalen Kontrast mit einer Auflösung von 1024 x 1024 Pixeln zu erhalten. Stellen Sie die Intensität jedes Lasers ein, um die Sättigung von Pixeln zu vermeiden.

Bewerten Sie die Tiefe, in der die Färbung gleichmäßig ist, und stellen Sie dann die Software so ein, dass Bildstapel von mindestens acht äquidistanten 250-Nanometer-Ebenen erfasst werden. Nehmen Sie dann drei benachbarte repräsentative Bildstapel aus demselben Interessenbereich pro Slice. Wiederholen Sie die Einnahme in mindestens drei Scheiben pro Zustand und von sechs bis acht Tieren pro Behandlungsgruppe.