Ein screenbaren In-vivo- Assay für Mitochondriale Modulatoren Verwendung transgener Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Es wird ein Protokoll für den in vivo Nachweis der Wirkungen von mitochondrialen Inhibitoren im Modellorganismus Caenorhabditis elegans und für die Identifizierung potenziell verstärkender Verbindungen beschrieben. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Arzneimittelbibliotheken auf Verbindungen zu untersuchen, die die mitochondriale Funktion modulieren.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die mitochondriale Toxizität oder die vorteilhaften Wirkungen von Arzneimitteln anhand des Modellorganismus zu identifizieren. C Eleganz. Dies wird durch die in vivo Quantifizierung eines TP-Spiegels in transgenen Seeelganstämmen erreicht, die das Glühwürmchen-Kreuzblütler-Enzym exprimieren, das mit dem grün fluoreszierenden Protein fusioniert ist.

Das Fusionsgen verleiht Nematoden zwei unterschiedliche Eigenschaften. Die erste ist, dass die Nematoden, wenn sie das Substrat Luzifer erhalten, Licht im sichtbaren Bereich im Verhältnis zu ihren zellulären A-TP-Reserven emittieren. Und das zweite ist, dass sie, wenn sie mit der richtigen Wellenlänge beleuchtet werden, eine starke grüne Fluoreszenz aufweisen.

Die Fluoreszenz ist unabhängig von den TP-Werten der Nematoden und ist proportional zu ihrer Masse oder Anzahl. Daher kann es verwendet werden, um die Biolumineszenzmessungen zu normalisieren. Während eines typischen Assays wird eine Population von entwicklungssynchronisierten Würmern bis zum L-Vierlarvenstadium gezüchtet.

Die Nematoden werden dann für eine gewisse Zeit mit den Testwirkstoffen behandelt, bevor sowohl die Fluoreszenz als auch die Biolumineszenz gemessen werden. Die Ergebnisse zeigen eine potenzielle Toxizität des Arzneimittels. Wenn die Biolumineszenz reduziert wird, deutet ein verstärktes Signal auf einen Treffer für weitere Tests auf positive Auswirkungen auf die Mitochondrienfunktion hin.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Wirkstoffscreening an kultivierten Zellen besteht darin, dass das Screening im physiologischen Kontext eines ganzen lebenden mehrzelligen Organismus mit nahezu 50% genetischer Ophthalmologie zum Menschen durchgeführt wird. Und wie beim Menschen erfordert die Eleganz tatsächlich eine mitochondriale oxidative Phosphorylierung, um sich bis ins Erwachsenenalter zu entwickeln, und ihre Mitochondrien teilen auch mit den Mitochondrien von Säugetieren viele Eigenschaften in Bezug auf ihre Struktur, ihre Funktion, ihre Bioenergetik Zu den kritischen Parametern innerhalb des Protokolls gehören das Entwicklungsstadium, in dem die Exposition die Dauer der Exposition gegenüber dem Nematoden einleitete, auf das Medikament von Interesse und die Aussaat einer ähnlichen Anzahl von Nematoden in jedem der Brunnen und natürlich die Vermeidung von Kontamination am ersten Tag. Unter sterilen Bedingungen überführt man Nematoden von einer sechs Zentimeter großen Nematodenwachstumsmedienplatte in zwei Millilitern S vollständiges Medium in einen Kolben mit 30 Gramm pro Liter E-coli.

OP 50 in S vollständiges Medium, dann den Kolben am vierten Tag durch Schütteln inkubieren, die Kultur der GR-Nematoden bleichen, um die Eier zu ernten und die Wurmpopulation zu synchronisieren. Dann inkubieren Sie die Eier über Nacht in einem Glaskolben mit 15 Millilitern S Vollmedium unter Schütteln am nächsten Tag, Tag fünf, die Nematoden befinden sich im gleichen Wachstumsstadium. Um die Anzahl der geschlüpften Würmer jedes Mal mit einer sauberen Spitze zu bestimmen, übertragen Sie drei 100-Mikroliter-Aliquots von Nematoden in separate Mikroröhrchen mit 900 Mikrolitern Medium, ergänzt mit 0,01 % Tween 20, pipettieren Sie einige Male auf und ab, um alle an der Spitze anhaftenden Würmer freizusetzen.

Zählen Sie dann die Nematoden in vier separaten 10-Mikroliter-Tröpfchen aus jedem der dreifachen Verdünnungsröhrchen und berechnen Sie das Volumen der Nematodensuspension, das erforderlich ist, um zwei 20-Milliliter-Kulturen mit 10 Nematoden pro 10 Mikroliter einzurichten, und dekantieren Sie das ungefähre Volumen in zwei vorgewogene konische 15-Milliliter-Röhrchen. Wiegen Sie die Röhrchen, um das tatsächlich abgegebene Volumen zu bestimmen. Dann, um das Zielvolumen anzupassen, wirbeln Sie vorsichtig vor und entfernen Sie überschüssiges Volumen.

Waschen Sie nun die Nematoden in insgesamt 14 Millilitern frischem S, vollständigem Medium pro Röhrchen und reaktivieren Sie die Pellets in fünf Millilitern S vollständigem Medium mit 30 Gramm pro Liter equali. OP 50. Die Nematoden werden in konische Glaskolben überführt, die 15 Milliliter S enthalten, komplett mit 30 Gramm Equali pro Liter.

OP 50 auf ein Gesamtvolumen von 20 Millilitern pro Kolben und den Zeitpunkt der Fütterung aufzeichnen. Bestimmen Sie die durchschnittliche Anzahl der Nematoden in neun 10-Mikroliter-Tröpfchen, um zu bestätigen, dass die Kulturen auf 10 Nematoden pro 10 Mikroliter verdünnt sind. Legen Sie die Kulturen für 42 bis 44 Stunden in den Inkubator.

Am siebten Tag ziehen Sie die Nematodenkulturen in einen einzigen Kolben unter kontinuierlichem, sanftem Schwenken. Übertragen Sie dann drei, vier Milliliter Aliquots von Nematoden in einen einzigen sterilen 60-Milliliter-Trog. Verwenden Sie eine Achtkanalpipette für Eloqua, 25 Mikroliter suspendierte Nematoden pro Vertiefung in 96.

Gut schwarze Mikrotiterplatten mit flachen, transparenten Böden. Setze dann die Deckel wieder auf die Teller und lege die Teller beiseite. Jedes Mal, wenn zwei Platten ausgesät wurden, werden zwei weitere 2,5 Milliliter Aliquots Nematoden in den Trog übertragen, um das verlorene Volumen zu ersetzen.

Nachdem Sie 13 bis 14 Platten mit Nematoden besät haben, geben Sie 74 Mikroliter S Complete Medium in jede Vertiefung und geben Sie die Platten bis zur Verabreichung des Arzneimittels in eine feuchte Kammer und einen Schüttinkubator, während die Platten zittern. Tauen Sie 2 96 Wirkstoffplatten für die Prüfung auf. Verwenden Sie dann eine Mehrkanalpipette und wechseln Sie die Spitzen jedes Mal.

Übertragen Sie einen Mikroliter aus der ersten Säule der ersten Wirkstoffplatte auf die Spalten eins bis fünf einer Nematodenplatte. Übertragen Sie einen weiteren Mikroliter aus der zweiten Säule der Wirkstoffplatte in die Spalten acht bis 12 der Nematodenplatte. Geben Sie dann einen Mikroliter Vehikel in die Spalten sechs und sieben der Nematodenplatte.

Verwenden Sie die verbleibenden Säulen in der Medikamentenplatte, um den Rest der Nematodenplatten auf die gleiche Weise zu behandeln, und stellen Sie sicher, dass Sie auch zwei vollständig mit Fahrzeugen behandelte Platten enthalten. Legen Sie dann am achten Tag alle Platten für weitere 20 bis 22 Stunden in die feuchten Kammern im Schüttelinkubator zurück. Um eine Hintergrundkontrollplatte für Fluoreszenzmessungen vorzubereiten, kombinieren Sie den Well-Inhalt einer vollständig mit Vehikel behandelten Nematodenplatte und lassen Sie die Nematoden zwei bis drei Minuten lang absetzen.

Sammeln Sie dann die Bakterien, die Snat enthalten, und laden Sie 100 Mikroliter Proben in jede Vertiefung einer schwarzen Mikroplatte mit transparentem Boden. Betrachten Sie die Platte unter einem Mikroskop und notieren Sie sich die Vertiefungen, in denen die Nematoden zu sehen sind, um diese Vertiefungen aus der Fluoreszenzhintergrundschätzung auszuschließen. Dann lesen Sie schließlich die Fluoreszenz ab, um die Biolumineszenz für jede Platte zu messen.

Geben Sie im Gegenzug jeweils 50 Mikroliter frisch zubereiteten Lumineszenzpuffer an, stellen Sie die Platte gut auf eine Schüttelplattform und starten Sie den Timer nach drei Minuten. Lesen Sie die Lumineszenz mit einer Sekunde pro Messung ab. In diesem ersten repräsentativen Experiment reduzierte Fäulnis, die als mitochondrialer Komplex-Ein-Inhibitor bekannt ist, die Lichtleistung der Nematoden sowohl nach relativ kurzer als auch nach längerer Exposition bei einer Reihe von Konzentrationen.

In diesem Experiment konnte gezeigt werden, dass das Herbizid Paraquat die Biolumineszenz GFP-Fluoreszenz signifikant verringert und die Biolumineszenz des C-Stammes PE 2 54 normalisiert. Des Weiteren war der Rückgang der Biolumineszenz größer als der der Fluoreszenz, was mit den bekannten Effekten einer verminderten mitochondrialen Funktion übereinstimmt und eine durch das Arzneimittel hervorgerufene TP-Produktion reduziert. Diese Grafik zeigt ein Beispiel für eine Verbindung, die die Nematoden-Biolumineszenz, das Zwischenprodukt Oxalacetat im Zitronensäurezyklus, in einer Einzelkonzentration von acht Millimolar verstärkt.

Beachten Sie, dass die experimentelle Variabilität, die zwischen diesen Replikationsläufen beobachtet wird, für Luzifer-basierte Experimente nicht ungewöhnlich ist. Hier wurde beobachtet, dass Firefly-Luciferase-inhibitorische Verbindungen die in vitro Luziferaktivität bei 25 Mikromolaren und 100 Mikromolaren beeinflussen, mit einer fast vollständigen Abschwächung der Aktivität durch die DDD-Verbindung. 1, 4 3 4, obwohl nicht direkt vergleichbar, wurde ein signifikanter Rückgang der Biolumineszenz nach Behandlung mit Lucifer-inhibitorischen Verbindungen auch in vivo beobachtet.

Dies zeigt, dass Veränderungen der Biolumineszenz eher aus der Wirkung von Luzifer-Enzymhemmern als aus Änderungen der in vivo A TP-Spiegel resultieren können. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu berücksichtigen, dass Verbindungen die Aktivität des Glühwürmchen-Luziferase-Enzyms direkt beeinflussen können, anstatt den Energiestatus des Wurms zu beeinflussen. Daher können Unterwärme mit vielen Techniken zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion validiert werden, wie z. B. die Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs, die Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials von reaktiven Sauerstoffspezies oder die Visualisierung von Mitochondrien in Stämmen von Meereseleganz.

Mit GFP-Tag, Mitochondrien.