Name: Ein screenbaren In-vivo- Assay für Mitochondriale Modulatoren Verwendung transgener Bioluminescent Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Erfahren Sie einen In-vivo-Assay zur Identifizierung mitochondrialer Modulatoren mit transgenen Caenorhabditis elegans. Diese Methode ermöglicht das Screening von Arzneimittelbibliotheken zur Quantifizierung zellulärer ATP-Reserven.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken David Gray von der Dundee Drug Discovery Unit für die freundliche Spende von Glühwürmchen-Luciferase-hemmenden Verbindungen DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 und DDD00023047; Tibor Harkani (Medizinische Universität Wien) für die Anregung von Oxalacetat als Testverbindung; und Charlie Dear (University of Aberdeen) für Illustrationen. Diese Arbeit wurde durch einen BBSRC Pathfinder Award (BB/FOF/PF/4/11) und die University of Aberdeen finanziert.

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen (Sterilbank) und mit vorab sterilisierten Materialien (durch Autoklavieren 126 ° C, 11 min). Eine LB-Platte mit ausgestrichen E. coli OP50 bei 4 ° C gehalten wird benötigt, streifen out auf frische LB-Platten zu restreak jeden Monat. 1. Die bakterielle Food (Escherichia coli OP50) Herstellung <ol><li> Tag 1 beimpft 2 x 5 ml LB in zwei Universal-Flaschen mit einer Einzelkolonie von E. coli OP50 und Platz im Schüttelinkubator bei 37 ° C (220 rpm) für 8 h. </li><li> Nach 8-stündiger Inkubation, verwenden Sie 2 ml E. coli OP50 LB-Kultur zu je 3 x 200 ml LB zu inokulieren Ort Kolben in Schüttelinkubator (220 UpM) O / N (17 Stunden) bei 37 ° C. </li><li> Wiegen 20 x 50 ml Zentrifugenröhrchen und Schreibgewicht auf dem Schlauch. </li><li> Tag 2. Mit einem serologischen Pipette aliquote 30 ml O / N E. coli OP50 Kultur in das vorgewogen Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 7.741 xg, 10 ° C, 8 min. </li><li> Dekantieren Sie vorsichtig den Überstand, halten Sie den Schlauch mit Deckel umgekehrt auf und lassen Sie es für einige Minuten stehen lassen. Mit einer Pipette zu entfernen überschüssiges Überstand, der im Deckel angesammelt haben kann. Wiegen des Rohres und berechnet das Gewicht des Pellets. </li><li> Berechnen die benötigt wird, um eine Suspension von 30 g / L bereitzustellen, und markieren dieses Volumen an der Rohrvolumens. Datum, Bezeichnung und Ort Röhrchen bei -20 ° C für den Einsatz innerhalb von 1-3 Monaten oder bei - 80 ° C, wenn die Speicherung länger als 3 Monate. </li><li> Bereiten Bakteriensuspension für den Anbau von Nematoden; ermöglichen Bakterienpellet auftauen und fügen erforderliche Volumen des S Komplettmedium 11,12 in jedes Röhrchen, Vortex vorsichtig, um Pellet resuspendieren, Pool Inhalte der verschiedenen Rohren, um das erforderliche Volumen zu erhalten. Arbeiten unter sterilen Bedingungen. </li></ol> 2. Herstellung von Drug Standards in einer 96-Well-Plattenformat HINWEIS: Bei Verwendung eines Medikamentenbibliothek, sind Drogenplatten an einem einzigen bereitgestelltKonzentration der Verbindung in DMSO. Primärscreening werden Verbindungen in einer einzigen Konzentration zu testen. Anweisungen für die Vorbereitung der Drogenplatte für den Zweitverbindung Tests in einem Bereich von Konzentrationen zwischen 0 bis 160 &amp; mgr; M, nachdem eine statistische Signifikanz bei 10 uM ausgewählt. Die folgenden Schritte können angepasst, um andere Konzentrationen zu testen. VORSICHT! Folgen notwendigen Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Drogen (im allgemeinen Gesichtsmaske, Schutzbrille, Schutzhandschuhe sind erforderlich). <ol><li> Bereiten Drogenplatte mit Arbeitsnormen für den Zweitscreening: wiegen die erforderliche Menge an Verbindung in sterile 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bereiten 16 mM Verbindung in DMSO (dh konzentrierte 100x relativ zum gewünschten Spitzenkonzentration für die Exposition). </li><li> Seriell zu verdünnen 16 mM Stamm 1: 2 in DMSO zu erhalten, 8, 4, 2, 1, 0,5 und 0,25 mM Standards (steril). Diese sind 100x konzentriert und wird bis auf Endkonzentrationen von 0 (nur Vehikel) verdünnt werden,2,5, 5, 10, 20, 40, 80 und 160 &amp; mgr; M (in 1% DMSO) während der Arzneimittelexposition. </li><li> In einer Sterilbank, legen 20-50 ul pro Vertiefung der Verbindung Standards innerhalb einer Spalte einer 96-Well-Platte, zum Beispiel Plattenposition A1: 16 mm, B1: 8 mm, C1: 4 mm, D1: 2 mm, E1: 1 mM, F1: 0,5 mM, G1: 0.25 mM Wirkstoff und H1: DMSO. Verwenden Sie verschiedene Spalten für Verdünnungsreihe von verschiedenen Drogen. </li><li> Aliquot Fahrzeug zu den Vertiefungen der Spalte 12 in dem Arzneimittel Platte. Hinweis: das Testen von Fahrzeugsteuer Spalten nach unten zusätzlich zu der Prüfung entlang der Zeile H zu erleichtern, so dass Fahrzeug in Positionen repräsentativ für die gesamte Platte getestet. HINWEIS: Jedes Medikament Platte für den Zweit Screening hält Verdünnungsreihe für maximal 11 verschiedene Medikamente getestet werden und der Fahrzeugsteuerung. </li><li> Label und Dichtungsplatte, mit Folie abdecken und Ort bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 3. Nematode Experimente HINWEIS: Führen Sie alle Schritte under sterilen Bedingungen, aseptisch und mit vorher sterilisiert Materialien und Reagenzien. Pflegen C. elegans Stämme routinemäßig auf NGM-Platten mit E. coli OP50. 12 Vorgeschlagene Zeitpunkte für die verschiedenen Protokollschritte sind in Tabelle 1 angegeben. <ol><li> Tag 1 Aufgabe: bis Flüssigkultur von Biosensor-Stamm für die spätere Synchronisation eingestellt. <ol><li> Nehmen Sie Nematoden von einem 6 cm NGM Platte (mit viel jungen Larven, wo Lebensmittel ist soeben abgelaufen) in 2 ml S vollständig und zu übertragen, mit 30 g / l E. Kanne coli OP50 in S komplette (Gesamtvolumen 30 ml in einem 250 ml fassenden konischen Glaskolben). Inkubiere 3 Tage lang bei 20 ° C, 160 Umdrehungen pro Minute. </li></ol></li><li> Tag 4 Task (gewähren ungefähr 30-35 min): Bleich Kultur, Eier zu ernten und Wurmpopulation zu synchronisieren. Führen Sie alle Zentrifugationsschritte für 1 min, 600 x g. <ol><li> Bereiten Sie Bleichmittel-Lösung unmittelbar vor Gebrauch: zu je 16 ml 0,156 M KOH / NaOH 4 ml Bleichmittel. </li><li> Gießen Sie 2 x 14 mlWurmkultur in 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Erlauben Würmer durch die Schwerkraft (3 min) zu begleichen. Entfernen und entsorgen Sie Flüssigkeit über siedelt Nematoden. 5 ml Bleichlösung in jedes Röhrchen und starten Timer. Kombinieren Sie Datenträger in einem Rohr. </li><li> Kehren Rohr vorsichtig für 2 min, check Stereoskop für das Brechen von Würmern und der Veröffentlichung von Eier in Suspension. Wenn die meisten Eier freigesetzt werden oder an einer maximalen Zeit von 2 min in der Bleichlösung, zentrifugieren. </li><li> Überstand entfernen sorgfältig. Waschen Pellet 1x mit 14 ml S vollständig und Zentrifuge. </li><li> Überstand verwerfen, 10 ml Bleichlösung und starten Timer (diese zweite Bleichstufe stellt sicher, dass die meisten der Wurm Karkassen zerfallen und nicht mehr unter Stereoskop sehen). Nach einer maximalen Zeit in Bleichlösung von 2 min, Zentrifuge. </li><li> Wash Pellet 3x in S abgeschlossen ist, vorsichtig dekantieren Überstand und Pellet in 14 ml S komplett nach jeder Zentrifugation. Nach dem letzten Waschen resuspendieren Ei Pellet in 14 ml S complete. </li><li> Übertragen Sie die Lautstärke auf einen kegelförmigen Glaskolben. Inkubiere 18-24 h bei 20 ° C, 160 Umdrehungen pro Minute. HINWEIS: Die geernteten Eiern schlüpfen O / N und Verhaftung Entwicklung bei der ersten Larvenstadium (L1) aus Mangel an Nahrung, damit sie alle auf der gleichen Stufe des Wachstums sein. </li></ol></li><li> Tag 5 Aufgabe: bis synchronisiert Wurmkulturen gesetzt für Drogentests. HINWEIS: Worms in Hungermedium suspendiert sind in der Regel an hydrophobe Kunststoffoberflächen wie beispielsweise Pipettenspitzen und Rohre entsprechen. 0,01% Tween-20 ist ein Tensid, hier verwendet, um Kunststoffoberflächen übertragen hydrophilere und eine größere Genauigkeit beim Zählen (0,01% Triton-X100 kann auch verwendet werden). Wenn Nematoden sind in der Bakterien ergänzten Medium, sie nicht dazu neigen, den Kunststoffstab. <ol><li> Bestimmen Sie Anzahl von schraffierten L1 in Kolben, Kolben zu halten beim Schütteln Plattform (160 Umdrehungen pro Minute). <ol><li> Nehmen Sie 3x 100 ul Proben von Kolben (mit einem sauberen Spitze jedes Mal) in einzelne 1,7 ml Mikroröhrchen mit 900 ul Flüssigkeit medium 0,01% Tween-20. HINWEIS: Aspire 100 ul Probe in die saubere Spitze nur einmal. Dann bei der Abgabe, Pipette nach oben und unten ein paar Mal in den zwischen ergänzten Medium, um alle Würmer an der Spitze anhaftenden freizugeben. </li><li> Zählen Sie die Nematoden in 4x 10 ul Tröpfchen aus jeder Dreifachverdünnungsröhrchen. Berechnen Sie Mittelwert und schätzen die Zahl der in der konischen Glaskolben vorhanden Würmer. </li></ol></li><li> Berechnen Sie das Volumen des schraffierten erforderlich, um mit 10 Nematoden pro 10 &amp; mgr; l Einrichtung einer 2 x 20 ml-Kultur Nematodensuspension. Erhöhen berechnete Volumen um 10%, für einige nachfolgende Nematodenverlust während Zentrifugationsschritte ausmachen. </li><li> (Vorgewogen) dekantieren Volumen in 2 x 15 ml Zentrifugationsröhrchen erforderlich. Wiegen Rohre tatsächliche Volumen verzichtet, Vortex vorsichtig zu erhalten und stellen Sie die Lautstärke, indem überschüssiges Volumen mit einer 5 ml Pipette (nur der sterile Spitze sollte das Rohr geben) zielen. </li><li> Make up Volumen bis 14 ml mit frischem S vollständig warh Nematoden. Zentrifuge (1 min, 600 g). Entfernen und entsorgen Sie Stand mit darauf, dass die Nematoden Pellet stören. </li><li> 5 ml S komplett mit 30 g / l E. coli OP50 zu pelletiert Nematoden. Übertragen die 5 ml in jedem Röhrchen in eine konische Glaskolben mit 15 ml S komplett mit 30 g / l E. coli OP50. Notieren Sie sich Zeit Nematoden wurden zuerst mit Nahrung versorgt. </li><li> Schüttelkolben sanft (160 rpm), nehmen Sie 9 x 10 &amp; mgr; l Tröpfchen auf Objektträger (mit frischen Spitzen jedes Mal), um Nematoden zählen und zu bestätigen, durchschnittlich etwa 10 (± 2) pro 10 &amp; mgr; l. </li><li> Platzieren Nematoden Kolben in Schüttelinkubator bei 20 ° C, 160 Upm für 42-44 Std. </li></ol></li><li> Tag 7 Aufgabe: Übertragung Nematoden auf 96-Well-Platten und initiieren Arzneimittelexposition. <ol><li> Kombinieren Nematodenkulturen in einem einzigen Kolben, halten wirbelnden Kolben vorsichtig und legen Sie 3 x 4 ml Nematodenkultur in 60 ml sterile Trog. Zeigen Trog auf einem Schütteltisch (160 rpm). </li><li> Verwenden Sie 8 channel Pipette 25 ul suspendiert Nematoden pro Well von 96-Well schwarze Mikrotiterplatten mit einem flachen transparenten Boden Aliquot (für die Aufnahme sowohl Lumineszenz und Fluoreszenz-Messwerte, oder weiße Platten für Lumineszenz-only). Deckel mit Deckelplatte und beiseite stellen. <ol><li> Nach oben von je 2 Platten setzen, stellen weitere 2 x 2,5 ml Nematoden im Trog, um verlorene Volumen zu ersetzen (halten Sie einen &quot;Totvolumen&quot; in Rinne von ca. 7 ml). </li><li> Bis 13/14 Platten mit Nematoden gesetzt. 11 Nematodenplatten werden benötigt, um zwei 96-Well-Platten Medikament testen. Der 12. Nematodenplatte wird ausschließlich mit Fahrzeug als eine Steuerung geladen werden. Die 13. Platte wird verwendet, um die Hintergrundfluoreszenz am Tag 8 (siehe unten) festzulegen. Eine zusätzliche Platte für den Einsatz vorbereitet werden sollen Fehler bei der Einrichtung auftreten. </li></ol></li><li> Aliquot 74 ul S komplett in jede Vertiefung und Ort Platte in einer feuchten Kammer (siehe Materialliste) in einem Schüttelinkubator (20 ° C, 160 rpm) until bereit aliquoten Testverbindungen an der vorgewählten Entwicklungszeit (zB 45 h 30 min nach Essen zur Verfügung gestellt). [Volume pro Vertiefung ist jetzt 99 &amp; mgr; l]. </li><li> Auftauen Drogenplatte (n) zu testen. </li><li> Verwenden Sie Mehrkanalpipette um Nematodenplatten mit Drogen Einrichten, Ändern Spitzen jedes Mal. Erhalten Sie 5 min pro Platte mit 96 Vertiefungen für die Aliquotierung Droge. <ol><li> Nehmen Sie 1 ul vom 1. Säule der Drogenplatte und in den Spalten 1-5 von einer Platte, die Nematoden; wiederholen vom 2. Spalte in der Drogenplatte in Spalten 8-12 der Platte, die Nematoden. 1 ul Fahrzeug Spalten 6 und 7 der Nematode Platte. Hinweis: 100-Verdünnung der Verbindung / Fahrzeugs: Das Gesamtvolumen pro Vertiefung in dem Fadenwurm Platte werden 100 &amp; mgr; was zu einem 1 sein. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang durch Zugabe von 1 &amp; mgr; l des 3. / 4-ten Spalte des Medikaments Platte, um Spalten 1-5 / 8-12 des zweiten Fadenwurm Platte; Fahrzeug in den Spalten 6 und 7 des Fadenwurms Platte.</li><li> Weiter zum übrigen Drogenbodenkolonnen zu testen. Richten Sie ein Minimum von einem Nematoden Platte mit Fahrzeug in alle Vertiefungen durch Abtasten von Spalte 12 der Arzneimittelplatte. Platz Platten zurück in feuchten Kammern im Schüttelinkubator (20 ° C, 160 rpm) für 20 bis 22 h (siehe Hinweis für Tag 8). </li></ol></li><li> Part-Vorbereitung der Lumineszenz-Puffer zum nächsten Tag: add DMSO und 10% Triton-X-100 auf das erforderliche Volumen des S vollständig auf 1% DMSO und 0,15% Triton X-100 zu erhalten. Lassen Sie 5 ml pro Platte Lese für Lumineszenz, plus 1 ml zur Grundierung Luminometer Injektor. </li></ol></li><li> Tag 8 Aufgabe: Lesen experimentellen Endpunkten - Fluoreszenz und Biolumineszenz. (GFP Fluoreszenzmesswerte werden als ein Mittel, um Daten zu normalisieren Biolumineszenz empfohlen). HINWEIS: Richten Sie den Endpunkten von 66-67 Stunden nach dem Essen zu lesen, um Nematoden, um signifikante Nachkommen Produktion unter den beschriebenen Versuchsbedingungen zu verhindern. <ol><li> Richten Sie Platte, die als Hintergrund Steuerung für GFP Messwerte zu verwenden. Combine auch Inhalte vom 13. Platte in eine 15-ml-Tube. Erlauben Nematoden zu begleichen (2-3 min). Verwenden Sie Überstand, um eine Mikroplatte (schwarz mit transparentem Boden) mit 100 ul Bakteriensuspension pro Vertiefung zu laden. <ol><li> Beachten Sie Hintergrundsteuerplatte unter Mikroskop notieren Brunnen, wo Nematoden zu sehen. Auszuschließen diese vom Hintergrundschätzung in nachfolgenden Datenanalyse verwendet. </li></ol></li><li> Lesen Fluoreszenz jeder Platte mit 96 Vertiefungen, einschließlich der Hintergrundsteuerung. (Einstellungen: Optik von der Unterseite der Platte; Filter 485/20 Anregungs; 528/20 Emissions.) </li><li> Bereiten Puffer für Lumineszenz-Messungen: add Luciferin (20 mM) auf Teil vorbereitet Puffer (vom Vortag), Lumineszenz-Puffer mit 1% zu erhalten DMSO (1x), 0,15% Triton-X100 (3x) und 0,3 mM Luciferin (3x ). Prime Luminometer Injektor 6x mit 150 ul Puffer Lumineszenz. <ol><li> Vorheriger Schritt wird davon ausgegangen 1% DMSO als Fahrzeug während Arzneimittelexposition. Als Vehikel Wasser ist, stellen Sie die Zusammenarbeitncentration DMSO in Lumineszenz-Puffer auf 3% (dh 3 ×). </li></ol></li><li> Arbeiten mit einer Platte zu einem Zeitpunkt. Dispense 50 ul Lumineszenz Puffer pro Vertiefung. (150 &amp; mgr; l Endvolumen in gut; 3x Verdünnung von Lumineszenz-Puffer: 1% DMSO, 0,05% Triton-X100 und 0,1 mM Luciferin Endkonzentrationen.) Unmittelbar am Bewegungstisch und starten Timer. <ol><li> Nach 3 min auf Schütteltisch (160 rpm), lesen Sie Lumineszenz (1 Sekunde pro Messung). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Subtrahieren durchschnittliche GFP Hintergrund Lesen von Fluoreszenz Ergebnisse. Teilen Sie Biolumineszenz durch entsprechende GFP Lesen. <ol><li> Wenn eine hohe GFP-Wert wird für Nematoden in eine Verbindung ausgesetzt detektiert messen Fluoreszenz der Verbindung auf ihren eigenen, für jede Verbindung, Fluoreszenz zu berücksichtigen. Wenn höher als der Durchschnitt, verwenden Sie diese als Hintergrund statt. </li></ol></li><li> Express Biolumineszenz, GFP normalisierten Biolumineszenz einnd GFP-Fluoreszenz-Daten als Prozentsatz des Durchschnittswerts für die Fahrzeugsteuerung in jeder Platte. </li><li> Plot Durchschnittswerte und Fehlerbalken für jede Konzentration. </li><li> Test auf statistische Signifikanz unter Verwendung von 2-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit Wirkung von &#39;Konzentration&#39;, &#39;Experiment&#39; und ihre Wechselwirkung (jeder Datenpunkt bezieht sich auf eine einzige gut), und verwenden Sie den Dunnett-Test als post-hoc-Test (vs . Fahrzeugsteuerung). HINWEIS: Wenn das &quot;Experiment&quot; oder die &quot;Interaktion&quot; Begriffe sind signifikant, können weitere Experimente erforderlich, um Antwort zu bestätigen. Wo keine Variabilität zwischen Experimenten ist aus der Beobachtung der Datengrundstücke ersichtlich ist, kann ein Einweg-ANOVA auf gepoolten Daten aus unabhängigen Experimenten durchgeführt werden. <ol><li> Für die statistische Analyse der Platte (n) nur mit Fahrzeug, wählen Sie alle Vertiefungen in den Spalten 6 -7 und alle Vertiefungen in der Reihe H als Kontrollgruppe (das sind die Positionen während Verbindung Tests routinemäßig Fahrzeug zugeordnet). </li&gt; </ol></li></ol>

<ol><li>Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+phenotypic+gap%3A+real-time+assessment+of+mitochondrial+function+and+metabolism+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> BMC Physiol. 8, 7(2008).</li>
<li>Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sublethal+toxicity+assessment+using+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans%2C+a+novel+whole-animal+metabolic+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor.</a> Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).</li>
<li>McLaggan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sublethal+levels+of+environmental+pollutants+found+in+sewage+sludge+on+a+novel+Caenorhabditis+elegans+model+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor.</a> PloS one. 7, e46503(2012).</li>
<li>Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+control+of+the+Crabtree+effect+in+ascites+hepatoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells.</a> Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).</li>
<li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+the+Crabtree+effect%3A+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).</li>
<li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5%27-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).</li>
<li>Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tobacco-specific+nitrosamine+4-%28methylnitrosamino%29-1-%283-pyridyl%29-1-butanone+%28NNK%29+induces+mitochondrial+and+nuclear+DNA+damage+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans.</a> Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).</li>
<li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+early+life+exposure+to+ultraviolet+C+radiation+on+mitochondrial+DNA+content%2C+transcription%2C+ATP+production%2C+and+oxygen+consumption+in+developing+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9(2013).</li>
<li>Kuang, J. J., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+failure+to+extend+lifespan+via+disruption+of+complex+II+is+linked+to+preservation+of+dynamic+control+of+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism.</a> Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).</li>
<li>Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans+as+multicellular+eukaryotic+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors.</a> FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-11 (2006).</li>
<li>Brenk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learnt+from+assembling+screening+libraries+for+drug+discovery+for+neglected+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases.</a> ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).</li>
<li>Lagido, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLagido%2C+C+%22Nematodes+as+environmental+indicators%22">Nematodes as environmental indicators</a>. Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. , CABI. 225-251 (2009).</li>
<li>Thorne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+in+chemical+biology%3A+a+compendium+of+inhibitors%2C+mechanistic+evaluation+of+chemotypes%2C+and+suggested+use+as+a+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter.</a> Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).</li>
<li>Houtkooper, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitonuclear+protein+imbalance+as+a+conserved+longevity+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism.</a> Nature. 497, 451-457 (2013).</li>
<li>Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+approaches+to+restore+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Pharmacological approaches to restore mitochondrial function.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).</li>
<li>Tsang, W. Y., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+genome+content+is+regulated+during+nematode+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial genome content is regulated during nematode development.</a> Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).</li>
<li>Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-Consumption+during+Development+and+Aging+of+the+Nematode+Caenorhabditis-Elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Phys+A%22%5BJournal%5D)">Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans.</a> Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).</li>
<li>Dillin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+behavior+and+aging+specified+by+mitochondrial+function+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development.</a> Science. 298, 2398-2401 (2002).</li>
<li>Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+absorption+efficiency+in+Caenorhbditis+elegans+delivered+by+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods.</a> PloS one. 8, e56877(2013).</li>
<li>Yochem, J., Gu, T., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+marker+for+mosaic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+indicates+a+fusion+between+hyp6+and+hyp7%2C+two+major+components+of+the+hypodermis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis.</a> Genetics. 149, 1323-1334 (1998).</li>
<li>Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+aerobic+metabolism+and+superoxide+production+rate+potential+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).</li>
<li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li>
<li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li>
<li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev Biol. 317, 549-559 (2008).</li>
<li>Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+Battling+Starvation+Stress%3A+Low+Levels+of+Ethanol+Prolong+Lifespan+in+L1+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li>
<li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+Grow+or+Not+to+Grow%3A+Nutritional+Control+of+Development+During+Caenorhabditis+elegans+L1+Arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest.</a> Genetics. 194, 539-555 (2013).</li>
<li>Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Pol+II+Accumulates+at+Promoters+of+Growth+Genes+During+Developmental+Arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest.</a> Science. 324, 92-94 (2009).</li>
<li>Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+control+of+mRNA+isoform+expression+during+developmental+arrest+and+recovery+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans.</a> Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).</li>
<li>Cressman, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+toxicants+for+toxicity+testing+using+Caenorhabditis+elegans+in+aquatic+media%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Soc+Test+Mater%22%5BJournal%5D)">Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media.</a> Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).</li>
<li>Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+to+pH%2C+salinity%2C+and+hardness+in+aquatic+media%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Environ+Con+Tox%22%5BJournal%5D)">Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media.</a> Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).</li>
<li>Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-like+protein+5+positively+regulates+chaperone+gene+expression+in+the+mitochondrial+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response.</a> Genetics. 174, 229-239 (2006).</li>
<li>Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mitochondrial+Superoxide+Signal+Triggers+Increased+Longevity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Biol%22%5BJournal%5D)">A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Plos Biol. 8, (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren

Der Modellorganismus C. elegans stellt ein leistungsfähiges experimentelles System. Es ist leicht, Kultur und produziert reichlich genetisch identische Nachkommen mit einer 3,5 Tage Lebenszyklus vom Ei bis zum Reproduzieren Erwachsenen (über juvenile Larvenstadien L1 bis L4). Aufgrund seiner geringen Größe, kann es bequem in 96-Well-Platten gezüchtet werden, die Erleichterung Substanz-Screening. Wir präsentieren eine phänotypische Screening-Protokoll basierend auf Stämme von C. elegans, die als in vivo Sensoren von Energieniveaus dienen. 14 Das Protokoll ist anwendbar auf jedes Labor, obwohl eine 96-Well-Platte Luminometer und einem sterilen Gehäuse ist nicht notwendig. Es ist wichtig, um eine Kontamination in Assays durch die Verwendung eines Labortechnik verhindern. Wenn sie manuell arbeiten, ist die maximale Anzahl der Nematodenplatten erzielbare 13 pro Versuch ermöglicht die Prüfung von 2x 96-well Platten Medikament ist und zwei Fahrzeug-Platten. Repräsentative Ergebnisse sind für die mitochondriale Komplex I Inhibitor Rotenon vorgestellte, die Superoxid-Generator Paraquat, dem Zitronensäurezyklus Zwischen Oxalacetat und vier Verbindungen mit bekannten Leuchtkäfer-Luciferase-inhibitorische Aktivität. Die ersten beiden Verbindungen führte zu einer Abnahme der Biolumineszenz wie vorherwohin Oxalacetat führte zu einer Verbesserung, eher von größer Erzeugung von ATP führen. Die Oxalacetat Datensätzen auch die intrinsische Variabilität bei Experimenten basierend auf Leuchtkäfer-Luciferase als Reporter zu demonstrieren. Ein Minimum von drei unabhängigen Experimenten sind ratsam, um die Robustheit der Antworten auf nicht bekannten Verbindungen festzustellen. Inhibition der Firefly-Luciferase-Aktivität war erkennbar mit einem in vitro-Assay unter Verwendung eines kommerziellen Kits. 3 Eine der Verbindungen führte zu einem erheblichen Anstieg der GFP-Fluoreszenz, die mit dem Inhibitor die Erhöhung des Niveaus der GFP-markierten Luciferase durch Bindung an das Luciferase-Enzym die aktive Stelle und macht sie stabiler. 15 In einigen Fällen(in diesem besonderen Fall) kann dies zu erhöhten Werten von Biolumineszenz 15 führen, wenn der Inhibitor durch überschüssiges Substrat verschoben wird. Es ist daher wichtig, nicht zu Ergebnissen irrtümlich aus Verbindungen, die mit dem Glühwürmchen-Enzyms in Wechselwirkung zu interpretieren, wie verringerte oder erhöhte ATP-Spiegel / Funktion der Mitochondrien. Veränderungen in Lumineszenzsignal korrelieren oft mit zusätzlichen Messungen der Gesundheit wie Bewegung, Entwicklung und Wachstum. Als ein Beispiel, ist eine Verbindung, ein Verdächtiger Luciferase-Inhibitor, wenn ein dramatischer Rückgang der Biolumineszenz-Signal erkannt wird, aber Würmer sind nicht von Kontrollen durch mikroskopische Beobachtung. Eine Erhöhung der GFP-Fluoreszenz, nicht durch das Wachstum oder die Autofluoreszenzverbindung erläutert, kann auch auf eine Inhibitor. Eine Anzahl von Luciferase Inhibitoren 15 sind bekannt und wurden in PubChem eingegeben. Daher in erster Linie ist es gute Praxis, Informationen über Luciferase Inhibitoren durch PubChem gehalten zu konsultieren; gefolgt von testing der Wirkungen der Verbindung in in vitro-Tests mit dem gereinigten Enzym 3 und / oder die Bestätigung von Wirkungen auf die Funktion der Mitochondrien durch zusätzliche Mittel. 16,17 GFP-Fluoreszenz-Messungen ermöglichen die Erkennung von Glühwürmchen-Luciferase-Ebenen (und das Potenzial Nachweis einiger Luciferase-Enzym-Inhibitoren, wie oben erörtert) machen ein starkes Argument für die Messung dieser Endpunkt neben Biolumineszenz, soweit möglich. Normalisierung der Messwerte auf Biolumineszenz GFP ist auch ein Mittel zur Berücksichtigung der Unterschiede in Wurmzahlen zwischen Vertiefungen (obwohl dies auch durch Einschluss von mehreren technischen Wiederholungen erreicht werden). Zu einer höheren Empfindlichkeit, ist es wichtig, um Hintergrundfluoreszenz von den Messungen subtrahiert. Das Protokoll beurteilt Beitrag der Bakteriensuspension auf die Hintergrund-Fluoreszenz jedoch Nematodenautofluoreszenz ist nicht für (eine Begrenzung der Strom Assay für jede Alterungs stu besonders kritisch entfielenstirbt da Nematoden Autofluoreszenz steigt mit dem Alter). Autofluoreszenz der Testverbindungen sollten auch parallel bewertet werden. GFP Normalisierung scheint unverzichtbar, wo Forscher wollen Protokoll anzupassen, um zelluläre ATP-Pools in verschiedenen genetischen Mutanten oder nach dem Schweigen der verschiedenen Genen zu vergleichen, um für Dehnungsunterschiede auf dem Niveau der Expression des Transgens Biolumineszenz steuern. Kritischen Parameter innerhalb des Protokolls sind die Entwicklungsstufe, bei der Belichtung initiiert wird, der Dauer der Einwirkung und Erhalten ähnliche Anzahl von Nematoden in verschiedenen Vertiefungen. Die Belichtung kann in jedem Stadium der Entwicklung der Nematoden L3 Stadium beginnen jedoch älter ist vorzuziehen. Von diesem Zeitpunkt an, Nematoden sind abhängig von der oxidativen Phosphorylierung für die Entwicklung bis ins Erwachsenenalter, wie durch einen sehr deutlichen Anstieg der mtDNA Gehalt, Sauerstoffverbrauch und ATP-Spiegel zeigt. 18,19,20 Das vorliegende Protokoll initiiert Ausstellungenure im L4-Stadium. Der Grund für das Aliquotieren von Nematoden auf 96-Well-Platten in diesem Stadium nur (und nicht, wenn sie zum ersten Mal mit der Nahrung im L1 Stufe vorgesehen ist), ist, dass obwohl Platten in feuchten Kammern angeordnet, um Verdampfung zu minimieren, eine Verdampfungsgrad noch auftritt unsere Schüttelinkubator, wie sehr kleine Tröpfchen bilden auf den Deckeln zu sehen (das kann nicht ein Problem mit anderen Schüttelinkubatoren sein). Aliquotieren von Nematoden, Platten unmittelbar vor der Zugabe von Arzneimittel-Standards, dem eigentlichen Wirkstoffkonzentration nicht durch irgendeine kleine Veränderung des Volumens durch Verdunstung beeinflusst wird. Laden eines Nematodenplatte mit dem Vehikel allein ist sinnvoll, zu prüfen, ob Nematoden wurden gleichmäßig zwischen Vertiefungen verteilt. Signifikante Unterschiede für das Fahrzeug nur Schild wäre bezeichnend für schlechte Technik werden bei der Abgabe die Nematoden in die Vertiefungen. Die Belichtungsdauer ist ein wichtiger Faktor zu berücksichtigen. Wenn Auswirkungen auf den Energiestatus unabhängig von Wachstum sind von Interesse, die Pro-Protokoll modifiziert werden, um kürzere Expositionen (fast unmittelbaren Reaktionen auf, zum Beispiel, 2 h) unterzubringen. Auf der anderen Seite, Eintrag von Verbindungen in C. elegans Geweben kann einige Zeit dauern. Beispielsweise 12-24 h erforderlich sind, um maximale innere Konzentrationen von Resveratrol und 5-Fluor-2&#39;-desoxyuridin (FUdR) zu erreichen. 21 daher eine längere Belichtungszeit (18 bis 24 h) kann gerechtfertigt Belichtungspegel zu maximieren. Die Belichtungszeit sollte auf Zeiten, in denen nicht ein erhebliches Maß an Wiedergabe, um Platz in der gut zu nehmen beschränkt werden. Wir empfehlen, dass die Gesamtentwicklungszeit von Nematoden unter 66-67 h gehalten. Obwohl praktisch, sind Nematoden bis dahin trächtig und haben Eiablage begonnen. Dennoch fanden wir Biolumineszenz-Messwerte von Eierzubereitungen vernachlässigbar zu sein (nicht dargestellt). Die sur-5-Promotor gesteuerte Expression des Transgens zuerst erkannt nur zwei bis zweieinhalb Stunden nach der Befruchtung bei der 100-Zellstadium 22 und der chitinous Eierschale ist wahrscheinlich, um den Eintritt von Luciferin zu begrenzen. Andere haben festgestellt, dass embryonierten Eiern nicht wesentlich dazu beitragen, den Stoffwechsel von schwangeren Erwachsenen. 23 jedoch zu vermeidende Bedingungen, die für bedeutende Nachkommen Produktion sind. Falls gewünscht, kann der experimentellen Zeitskala wieder verschoben werden: Wir haben zuvor initiierten Exposition gegenüber einem Umweltgift am späten L3 Larvenstadium (36 hr) und aus Biolumineszenz und GFP-Messungen bei 55 h durchgeführt 2 Alternativ genetischen Hintergründen, die bedingt steril sind. kann verwendet werden, um Nachkommen Produktion zu verhindern, wie zum Beispiel die fer-15 (b16) II; Fem-1 (HC17) IV-Doppelmutante, die bei 15 ° C gehalten werden kann, ist aber sterile bei 25 ° C. 24. Die Verwendung von FUDR zur ​​Sterilität induziert wird nicht empfohlen, da dies kann selbst betreffen Nematodenstoffwechsels. 25. Der Test konnte auch in Stämmen mit permeabler cuticles wie partielle Verlust-Funkt geführt werdenIonen-Bus-8-Mutanten, die Multidrug-sensitive aufgrund Lässigkeit von Medikamenten zu erhöhen. 26 Dies wird kürzere Belichtungen und niedrigere Verbindungskonzentrationen erleichtern. Die Bedingungen für das Hinzufügen von Luciferin zu diesen Nematoden müssen möglicherweise auch Anpassung dh 1% DMSO und 0,05% Triton-X100 in der Lumineszenz-Puffer kann nicht verlangt werden Luciferin Verfügbarkeit zu verbessern. Das Protokoll verwendet 1% DMSO als Vehikel für Verbindung Lieferung. Obwohl nicht tödlich, diese Konzentration des DMSO hat einige biologische Wirkungen, wie wir in einer früheren Veröffentlichung. 3 diskutiert Viele der verfügbaren Medikamentenbibliotheken werden in 100% hergestellt DMSO, bei Konzentrationen, die nach Verdünnung Fahrzeug für zellbasierte Assays sein wird bis 0,1%. Höhere Konzentrationen der Verbindung erforderlich sind, um Antworten in C hervorzurufen elegans, wenn sie mit menschlichen Zellen, so daß es oft nicht möglich, Tests bei weniger als 1% DMSO durchzuführen, verglichen. Wiederum ist die Verwendung von Stämmen mitlässiger Nagelhaut kann auf die Prüfung mit geringeren Konzentrationen von Fahrzeug zu führen. Konzentrationen von DMSO von über 1% sind nicht zu empfehlen. Eine Reihe Inkubationszeit mit Luciferin vor Lesungen sollten eingehalten werden. Seinen Maximalpegel innerhalb der zweiten Minute, wie zuvor gezeigt, erreicht Lumineszenz nach Zugabe von Luciferin, relativ stabil bleibt für die ersten 5 min, gefolgt von einer langsamen Abnahme der Lumineszenz schrittweise über die nächsten 30 min 1. Kinetischen Antworten auf eine bestimmte Chemikalie kann während dieser ersten Phase von 30 min nach der anfänglichen Dosierung von Luciferin durchgeführt werden. Das Protokoll beinhaltet eine Hungersnot Schritt nach der Entnahme von Eiern, um die Synchronisation der Nematodenpopulation zu erreichen. Wir empfehlen Synchronisation von Nematodentest Populationen seit verschiedenen Entwicklungsstadien unterscheiden sich in zellulären ATP-Spiegel und können unterschiedlich auf die Testverbindungen zu reagieren. Durch die Durchführung der Hunger in S KomplettMedium gegenüber M9 werden die Brut Nematoden mit einer Kohlenstoffquelle (Ethanol) 27,28 versehen, so daß Larven entwickeln sich nicht, sind aber nicht vollkommen ausgehungerte. Es hat sich auch gezeigt, dass L1 verhaftet sind für eine schnelle Reaktion auf Lebensmittel grundiert und normale L1 Wachstumsrate wird innerhalb von 3 Stunden nach dem Essen zur Verfügung steht 29 jedoch die Möglichkeit erreicht., es, dass der Hunger-Schritt kann den Stoffwechsel von C. ändern elegans kann nicht ausgeschlossen werden. 30 Aus diesem Grund ist die Länge des Hungers sollte 24 Stunden nicht überschreiten (18 Stunden ist ausreichend für die Synchronisation). Einige Labors haben die Möglichkeit, mit Hilfe eines Copas Biosorter für Alter Synchronisation Umgehung des Hungers Schritt ganz. Andere Laboratorien können eine Präferenz für die Erweiterung des Nematodenpopulation auf festen Medien (NGM-Platten mit OP50) vor dem Bleichen (Schritt 3.1) haben, und das wird auch gut funktionieren. Wir verwenden S Medium während der Verbindung Exposition als Standardmedium für Nematodenkultivierung, however andere Medien ausgewählt werden, zum Beispiel K Medium oder EPA mäßig hartem Wasser werden oft für ökotoxikologische Untersuchungen verwendet. 31,32 Das Protokoll bietet eine Möglichkeit, zu screenen und zu Kandidaten für weitere Untersuchungen im Hinblick auf die Auswirkungen auf die Funktion der Mitochondrien zu identifizieren. Auf der Stufe der primären Screening ist es wahrscheinlich, dass einige Verbindungen wird durch nur eine Konzentration getestet sehen wurden daher Drogen-Bildschirme sollte nicht als erschöpfend betrachtet werden. Zugriffe kann durch die Verwendung von Techniken zur Bewertung verschiedener Aspekte der mitochondrialen Funktion beispielsweise der Sauerstoffverbrauch, C. validieren elegans-Stämme mit GFP-exprimierenden Mitochondrien, Flecke für mitochondriale Membranpotential und / oder ROS-Messungen. 16,33,34 Die größte Bedeutung der Methodik ist es, eine Einrichtung zum Sortieren von großen Anzahl von Verbindungen und / oder Bedingungen an der vielzelligen Organismen Pegel haben, und vor allem in der Lage sein, die Vorteile der th nehmene genetische Lenkbarkeit von C. elegans, um Wirkmechanismen zu untersuchen. Die Technik kann helfen, zu beschleunigen und zu finden, neue Wege zur Entdeckung interessanter Verbindungen und Ziele. Es ist vorgesehen, dass die Kombination des Sensors mit genetischen Hintergründen mit menschlichen Krankheiten für das Screening von Substanzbibliotheken in einem krankheitsrelevanten Kontext zugeordnet wird viel zu bieten haben.

Der Zweck dieses Verfahrens ist die schnelle Quantifizierung des Energiestatus von C. elegans in vivo im Hinblick auf die mit dieser als ein Endpunkt in Verbindung Screening. Das Grundprinzip ist bei der transgenen Expression der Luciferase in dem Fadenwurm C. basierend elegans 1-3 über das Plasmid pSLGCV (1 <a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862).</a> Die Luciferase-Enzyms zu dem grün fluoreszierenden Protein GFP fusioniert ist und konstitutiv und ubiquitär im Zytoplasma exprimiert (die Luciferase Peroxisomen-Targeting-Signal entfernt wurde). Dies führt zu einer Lichtemission, wenn das Substrat Luciferin wird exogen bereitgestellt. Da die Schnecken transparent ist, kann das Licht in einem Luminometer als relative Lichteinheiten (RLU) gemessen werden. Zellulären ATP-Kraftstoffe der Biolumineszenzreaktion und seine Verfügbarkeit bestimmt die erzeugte Lichtpegel. Folglich bietet Luminometrie eine convenient Mittel zur Bewertung in Bezug ATP-Spiegel und durch die Erweiterung der mitochondrialen Funktion, da die ATP-Produktion erfolgt hauptsächlich in den Mitochondrien. Eine Verbindung zwischen mitochondrialen Funktion und Biolumineszenz Ebenen zuvor durch das Silencing der mitochondrialen Elektronentransportkette Gene und damit einhergehenden reduzierten Lichtleistung gezeigt. 1 Die Biolumineszenz-Stämme erzeugt wurden PE254 (feIs4) bezeichnet und PE255 (feIs5) 1 (siehe Materialliste) und können untereinander ausgetauscht werden. 3 Eine Reihe von Studien haben diese Sensor-Stämme verwendet werden, um auf die zelluläre ATP-Spiegel in vivo berichten nach Exposition gegenüber verschiedenen xenobiotischen Chemikalien wie Natriumazid 1, Cadmium 2, Abwasser Schlammextrakt 3, 5&#39;-Fluor-2-desoxyuridin 6 und eine tabakspezifische Nitrosamin 7. Die Stämme sind auch nützlich gewesen, um Auswirkungen der Bestrahlung mit UV-C-Strahlung zu überwachen <sbis&gt; 8 und Wirkungen der Störung der mitochondrialen Atmungskette. 1,9 Eine frühe Version Lumineszenzsensor das Luciferase-Gen exprimieren, ohne GFP-Fusion (PE39) wurde ebenfalls in die Untersuchung der Wirkung von Schwermetallen und eines Atmungs verwendet . Entkoppler 10 Stämme PE254 und PE255 tragen das Luciferase: GFP-Fusions und GFP-Fluoreszenz wurde gezeigt, proportional mit Nematodenmasse zu erhöhen und bietet ein bequemes Mittel zur Normalisierung der Lumineszenz-Werte 6,9 Die Auswirkungen der Unterschiedsbetrag von Würmern pro Vertiefung kann auch sein. indem mehrere technische Replikate in dem Test (mindestens 5 Vertiefungen pro Bedingung) berücksichtigt. 3 Das Protokoll bietet die Möglichkeit der in vivo-Überwachung von Energieniveaus (im Gegensatz zu technisch umständlich in vitro ATP Bestimmungen) ermöglicht Wirkstoff-Screenings und Neupositionierung im physiologischen Kontext der gesamten multicellular Organismus. Das Verfahren kann auf eine Vielzahl von genetischen Hintergründen durch Kreuzung der chromosomal integriertes Transgen in verfügbar Mutantenstämme und / oder durch Abschaltung von Genen durch RNA-Interferenz verlängert werden; somit unter voller Nutzung der C elegans als Modellorganismus. Das Verfahren soll helfen, Spätphasenausfall von Wirkstoffkandidaten zu reduzieren durch mitochondriale Toxizität und einen Beitrag zur Verringerung der höheren Tierversuche.

<table><tbody><tr><td>Orion II Mikroplatten-Luminometer</td><td>Berthold Detektionssysteme</td><td></td><td>mit Injektor und der Simplicity 4.2 Software; Übertragung der Daten nach Excel am Ende der Plattenmessung</td></tr><tr><td>FLx800 Fluorimeter&nbsp;</td><td>Biotek</td><td></td><td>mit Gen5 Software; Übertragung der Daten nach Excel am Ende der Plattenmessung</td></tr><tr><td>Ks 130 Basic Schüttelplattform</td><td>Ika</td><td>#0002980000</td><td></td></tr><tr><td>Innova 4349</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Kühlinkubator Schüttler</td></tr><tr><td>Eppendorf Zentrifuge 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>mit Eppendorf Rotor A-4-44&nbsp; (für 50/15&#160; ml Röhrchen)</td></tr><tr><td>Stripette, Costar</td><td>Corning</td><td>#4489</td><td>Serologische Pipette</td></tr><tr><td>Cellstar 50 ml Röhrchen</td><td>Greiner bio-one</td><td>#227661</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 15 ml Röhrchen</td><td>Greiner bio-one</td><td>#188261</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 60 mm Gewebekulturplatten&nbsp;</td><td>Greiner bio-one</td><td>#628160</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Objektträger</td><td>VWR</td><td>#631-0909</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Spatel</td><td>Corning</td><td>#3007; #3004</td><td>zum Wiegen von Chemikalien</td></tr><tr><td>0,22 mM Millex GP Filter</td><td>Millipore</td><td>#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Axygen eppendorf Röhrchen 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MCT-150-R</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 Well Assay Platte</td><td>VWR</td><td>#3603</td><td>Schwarze Platte mit klarem Boden und Deckel</td></tr><tr><td>Nunc 96 Well Assay</td><td>Platte Fisher Scientific</td><td>#236105</td><td>Weiße Platte mit Deckel</td></tr><tr><td>Reservoir Reagenz 60 ml</td><td>Thermo Scientific Finnpipette</td><td>#9510027</td><td>als Trog für Nematoden im Protokoll verwendet Abschnitt 4.4.1</td></tr><tr><td>Vorratsbox/Feuchtigkeitskammer</td><td>Roche Diagnostics</td><td>#10 800 058 001</td><td>174 x 101 x 56,6 mm, wird als Feuchtkammer mit nassen Papiertüchern verwendet; 2x 96-Well-Platten mit Deckel passen in eine, wobei die untere auf einem Mikrotiterplattendeckel sitzt</td></tr><tr><td>Bleichmittel: Natriumhypochloritlösung 4-4,99% Chlorgehalt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#239305</td><td>In Aliquoten bei 4&#160 lagern; &deg; C,&nbsp; Versiegelung mit Parafilm, um Chlorverlust zu verhindern und Abdeckung in Folie</td></tr><tr><td>D-Luciferin, Kaliumsalz</td><td>Biotium Inc</td><td># 10101-2</td><td>Molekulare Sonden können auch als Lieferant verwendet werden; bereiten Sie einen 20 mM Vorrat in ddH2O vor, halten Sie ihn bei -20 & Grad; C in aliquots</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td># P9416</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>CalBiochem</td><td>#317275</td><td>Reinheit 99,99%</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Alfa Aesar</td><td>#A16046</td><td>Diltute bis 10% in ddH2O</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>CalBiochem</td><td>#475914</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans biolumineszierende Stämme</td><td>Eigene Laboratorien</td><td>PE254, PE255</td><td>enthalten integrierte Arrays feIs4 und feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] jeweils auf Chromossom V und X; selektieren für eine homogene und starke Expression von luc::GFP durch Fluoreszenzmikroskopie (z.B. 15 Würmer auswählen) von Zeit zu Zeit.</td></tr><tr><td>E. coli OP50</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allgemeine Chemikalien</td><td>Sigma Aldrich/Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein screenbaren<em&gt; in-vivo-</em&gt; assay für mitochondriale modulatoren verwendung transgener bioluminescent<em&gt; caenorhabditis elegans</em

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Der mehrzellige Modellorganismus Caenorhabditis elegans ist ein kleiner Fadenwurm von etwa 1 mm Größe im Erwachsenenalter, der genetisch und experimentell manipulierbar ist. Es ist wirtschaftlich und einfach in flüssigem Medium zu kultivieren und zu dosieren, wodurch es sich gut für das Screening mit mittlerem Durchsatz eignet. Wir haben bereits die Verwendung von transgenen Luciferase-exprimierenden C. elegans-Stämmen validiert, um eine schnelle In-vivo-Bewertung des ATP-Spiegels des Fadenwurms zu ermöglichen. 1-3 Hier stellen wir die erforderlichen Materialien und Verfahren vor, um Bioassays mit den biolumineszierenden C. elegans-Stämmen PE254 oder PE255 (oder einem ihrer abgeleiteten Stämme) durchzuführen. Das Protokoll ermöglicht den In-vivo-Nachweis subletaler Wirkungen von Arzneimitteln, die eine mitochondriale Toxizität identifizieren können, sowie den In-vivo-Nachweis potenzieller vorteilhafter Arzneimittelwirkungen. Repräsentative Ergebnisse liegen für die Chemikalien Paraquat, Rotenon, Oxalacetat und für vier Glühwürmchen-Luciferase-hemmende Verbindungen vor. Die Methodik kann skaliert werden, um eine Plattform für das Screening von Wirkstoffbibliotheken auf Verbindungen zu bieten, die in der Lage sind, die mitochondriale Funktion zu modulieren. Die präklinische Bewertung der Arzneimitteltoxizität wird häufig an immortalisierten krebsartigen menschlichen Zelllinien durchgeführt, die ATP hauptsächlich aus der Glykolyse gewinnen und oft tolerant gegenüber mitochondrialen Giftstoffen sind. 4,5 Im Gegensatz dazu ist C. elegans auf oxidative Phosphorylierung angewiesen, um die Entwicklung bis ins Erwachsenenalter aufrechtzuerhalten, was eine Parallele zum Menschen zieht und eine einzigartige Gelegenheit zur Bewertung von Verbindungen im physiologischen Kontext eines ganzen lebenden mehrzelligen Organismus bietet.

Repräsentative Ergebnisse, um das Verfahren zu veranschaulichen wurden Rotenon (Abbildung 1), Paraquat (Abbildung 2), Oxalacetat (Abbildung 3) und 4-Verbindungen, die sich als Leuchtkäfer-Luciferase-Hemmer im Screening einer Medikamentenbibliothek 13 (Figur 4) aufgenommen wurden erhalten. Das Medikament Exposition wurde auf der L4-Stadium in allen Fällen begonnen, aber die Paraquat Exposition Experimente wurden bei 41 h begann nach dem Essen als erster Nematoden zur Verfügung gestellt im Vergleich zu 45-46 Stunden für die anderen Verbindungen. Das Protokoll ermöglicht eine Flexibilität bei der Auswahl der Zeit für die Initiierung der Exposition und der Belichtungslänge. Zu Screening-Zwecken, Untergangszeiten sollten eingehalten werden, wenn ausgewählt, für die Reproduzierbarkeit zwischen den Experimenten werden. Endpunkte sollte von 66-67 h Entwicklungszeit, um umfangreiche Eiablage und Schlüpfen der Nachkommen in den Vertiefungen zu verhindern, gemessen werden. Richtlinien für die Zeitpunkte sind in T bereitgestelltLage 1. Rotenon, einem mitochondrialen Komplex I-Inhibitor, verringert Biolumineszenz, nachdem beide relativ kurz (2 h) und längere Belichtungszeiten (24 h), um einen Bereich von Konzentrationen (Abbildung 1). In diesem Fall wurden keine GFP Messungen vorgenommen, aber die Anzahl der technische Replikate verwendet (n = 6) ist ausreichend zu glätten irgendwelche Unterschiede in Wurmzahlen zwischen Wells 3. Die 24-Stunden-Exposition ist ein Fenster der Zeit, über die Nematoden zu wachsen, und langsamere Entwicklung als Folge der komplexen I Hemmung wurde erwartet, dass sie auf den Rückgang der Biolumineszenz beizutragen. Dies wurde durch visuelle Beobachtung unter Stereoskop mit verzögerter Entwicklung angesehen, insbesondere bei Konzentrationen von 20 uM und darüber bestätigt; zusätzlich einige Letalität von 40 &amp; mgr; M bemerkt (qualitative Beobachtungen nicht quantifiziert). Kein Letalität wurde nach 2 h Exposition beobachtet, die jedoch Auswirkungen auf die Schneckenbewegung beobachtet. Ein starker Rückgang der Biolumineszenz relativ zu Kontrollen OCCUbei der niedrigsten Konzentration von Rotenon Rred getestet 2,5 um, für die Effekte wurden nicht einfach durch schnelle visuelle Beobachtung bei 2 St. Exposition erkannt. Dieser Rückgang der Biolumineszenz ist konsistent mit reduzierten zellulären ATP. Maximale Hemmung wurde mit der niedrigsten Konzentration von Rotenon verwendet (2,5 uM), die anzeigt, dass alle nachfolgenden Experimente gezielt Rotenon sollte zwischen 0 und 5 &amp; mgr; M [der Konzentrationsbereich 0-160 uM durchgeführt werden erzielt wurde als Teil eines Vergleichs mit anderen Arzneimitteln ausgewählt zunächst als erhebliche Auswirkungen bei 10 uM identifiziert (an anderer Stelle veröffentlicht)]. Das Herbizid Paraquat wirkt mitochondrialen Funktion durch Erhöhung von reaktiven Sauerstoffspezies. Hier, auf Biolumineszenz von C. zeigen wir seine Wirkung elegans Stamm PE254 nach Exposition gegenüber einem Bereich von Konzentrationen über 24 Stunden (Abbildung 2). Als der Stamm trägt eine luc :: GFP-Fusions, GFP-Fluoreszenz wurde also als Mittel zur Normalisierung gemessen. 6,9 Paraquat verringert Biolumineszenz GFP-Fluoreszenz und normalisiert Biolumineszenz bedeutend. Dunnet die post-hoc-Test zeigte, daß die Konzentrationen von Paraquat mit signifikanten Unterschieden in Bezug auf die Fahrzeugsteuerung wurden 4 und 8 mm für Biolumineszenz und normalisiert Biolumineszenz sowie 2 mM für normierte Biolumineszenz. Die einzige Konzentration GFP-Fluoreszenz signifikant reduziert war 8 mm, eine Konzentration, bei der Wachstumseffekte und die gelegentliche toten Wurm wurden (qualitative Beobachtungen) zu sehen. Die Abnahme der Biolumineszenz (und normalisiert Biolumineszenz) größer war als die der Fluoreszenz, die mit verringerten mitochondrialen Funktion und Auswirkungen auf die ATP-Produktion. Der Zitronensäurezyklus Zwischen Oxalacetat auf C getestet elegans-Stamm PE254 bei einer einzigen Konzentration von 8 mM, führte zu einer Zunahme der Biolumineszenz (Abbildung 3). Kein GFP fluoreszierennce Messungen erhalten wurden oder zusätzliche visuelle Beobachtung durchgeführt wird; aber solche Reaktion auf einen einzigen Zusammenschluss weitere bestätigende Exposition gegenüber einem Bereich von Konzentrationen, und detailliertere Beobachtungen von Effekten zu verdienen. Eine Verbesserung der Biolumineszenz durch diese Verbindung ist nicht überraschend, da sie postuliert, dass eine größere Aktivität des Zitronensäurezyklus führen, wobei letztendlich größere Produktion von ATP (werden dennoch wäre es ratsam, für alle Auswirkungen auf die Luciferase-Niveaus durch die Beurteilung GFP-Fluoreszenz zu steuern In nachfolgenden Experimenten). Die angegebenen Oxalacetat Datensätze zeigen das Ausmaß der Variabilität in Reaktion auf Luciferase-basierte Experimente gesehen. Nach unserer Erfahrung diese Variabilität ist eine Funktion des Testsystems vor allem für weniger schädlich Expositionsbedingungen. Die Glühwürmchen-Luciferase-Inhibitorverbindungen DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 und DDD00023047 wurden sowohl in vitro, indem du Auswirkungen auf den pu getestetrified Enzym und in vivo unter Verwendung des C. elegans luc: GFP-Stamm,. Es gab keinen Beweis, daß irgendeiner der getesteten Verbindungen verursachte Nematoden Tod unter den Belichtungsbedingungen. Alle 4 Verbindungen beeinflußt, die die Luciferase-Aktivität in vitro auf die 2 Konzentrationen getestet 25 und 100 um (4A). DDD00001434 tötete die Aktivität des gereinigten Luciferase fast vollständig, die eine glaubwürdige Begründung für die große Rückgang der in vivo Biolumineszenz (4B) zur Verfügung gestellt. Obwohl die in vitro und in vivo-Tests nicht direkt vergleichbar sind, die Antwort auf DDD00023047 war in beiden Assays. DDD0001477 und DDD00000635 verursacht einen größeren Rückgang in vivo als in in vitro. Diese Verbindungen wurden in den lebenden Würmer 22 Stunden vor dem Luciferin-Substrat bereitgestellt, und die Ergebnisse können zu reflektieren, dass sie nicht leicht aus der Luciferase aktiven Stelle verschoben, wenn Luciferin wurde avaiEtikett vorzeigen. Alternativ DDD0001477 und DDD00000635 kann eine zusätzliche Wirkung auf die zelluläre ATP-Spiegel. Dies müsste durch die Glühwürmchen-Luciferase an keine beurteilen. Bemerkenswert war die starke Verbesserung der GFP-Signal in Live-Würmer DDD00000635 Verbindung ausgesetzt. Dies wird nachfolgend erörtert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die mitochondriale Komplex I-Inhibitor Rotenon verringert den Energiestatus von C. elegans durch Biolumineszenz-Stamm PE254 gemessen. Synchronized L4-Stadium Würmer (45-46 Stunden nach dem Essen um Larven L1 vorgesehen) auf 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 und 160 uM Rotenon in 1% DMSO für 2 frei hr (kurz) oder 24 Stunden (Langzeitbelichtung) vor Lesungen der Biolumineszenz jeweils in 48 und 69 h Schnecken Entwicklung nach dem Essen zur Verfügung gestellt. Biolumineszenz (Einheit relativen Lichteinheiten, RLU) wurde als Prozentsatz des Fahrzeugs (1% DMS exprimiertWerte O). Fehlerbalken zeigen SEM technischer Wiederholungen an jedem Rotenon Konzentration (n = 6). Alle getesteten Konzentrationen führte zu einer statistisch hochsignifikant Differenz zur Vehikelkontrolle (p &lt;0,001). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig2.jpg" /> Abbildung 2. oxidativen Stressor Paraquat verringert den Energiestatus von C. elegans-Stamm PE254 in einer konzentrationsabhängigen Weise (durch Biolumineszenz gemessen). Synchronized L4-Stadium Würmer (der Einfachheit halber im vorliegenden Fall auf 41 Stunden nach dem Essen um L1-Larven zur Verfügung gestellt) wurden auf 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 oder 8 ausgesetzt mM Paraquat 24 h. GFP-Fluoreszenz (Einheit relativen Fluoreszenzeinheiten, RFU) wurde verwendet, um Biolumineszenz-Daten (Einheit RLU), beide Endpunkte bei 65 Personalentwicklung erhalten normalisieren. Daten sind als Prozentsatz der Kontrollgruppe (1% DMSO) ausgedrückt. Fehlerbalken zeigen SEM von technischen Replikaten(n = 5 für verschiedene Konzentrationen; n = 18 für die Kontrollen). Einweg-ANOVA: *** p &lt;0,001 in Bezug auf Fahrzeugsteuerung. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die Zitronensäurezyklus Zwischen Oxalacetat (8 mm) verstärkte die Biolumineszenz von C. elegans Stamm PE254. Synchronized L4-Stadium Würmer (45-46 h nach Nahrung zu L1-Larven zur Verfügung gestellt) ausgesetzt waren frisch zubereitet 8 mM Oxalacetat 18 h ± 30 min. Biolumineszenz (Einheit RLU) wurde bei einer Entwicklungszeit von 63,5 h ± 1 h lesen und wurde als Prozentsatz der Kontrolle ausgedrückt Fahrzeug (ddH 2 O). Verschiedene Spalten stellen verschiedene Datensätze von 8 technische Replikate auf verschiedene Platten mit 96 Vertiefungen in dem gleichen Experiment zugeordnet. Fehlerbalken zeigen SEM technischer Wiederholungen (n = 8). 2-Wege-ANOVA mit &quot;set&quot; und &quot;Konzentration&quot; als Faktoren: ̵6; Set &#39;p&gt; 0.05, &quot;Konzentration&quot; p &lt;0,001 und Interaktionsterm p&gt; 0.05. EIN <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4ahighres.jpg" width="650" /> B <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4bhighres.jpg" width="650" /> Abbildung 4. Prüfung der Antworten auf 4 Verbindungen aus der Dundee Wirkstoffforschung Verbindungsbibliothek 13 (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 und C4: DDD00023047) mit bekannter Hemmaktivität auf Glühwürmchen-Luciferase-Lumineszenz. (A) Wirkung von Verbindungen auf die Aktivität der gereinigten Glühwürmchenluciferase (gemessen als Lichteinheiten, RLU), ausgedrückt als Prozentsatz der Fahrzeugsteuerung. Der ATP-Biolumineszenz CLSII Kit (Roche, Mannheim, Deutschland) gemäß den Anweisungen mit der gleichen Menge an Luciferase-Enzym in die Vertiefungen (weiße 96-w aliquotiert verwendetell Mikrotiterplatten). ATP wurde zu einer Endkonzentration von 10 uM und 1 ul der Verbindung vorgesehen (Endkonzentration angegeben) oder DMSO (1%) zugegeben. Lumineszenzsignal wurde 10 sec integriert. Fehlerbalken zeigen SEM technischer Wiederholungen (n = 4). Analyse: one-way ANOVA; * p &lt;0,05 bzw. *** p &lt;0,001 in Bezug auf Fahrzeugsteuerung. Unterschiede zwischen 25 und 100 &amp; mgr; M von großer Bedeutung für C1 (DDD00001434; p &lt;0.001) und eine signifikante für C2 und C3 (jeweils DDD0001477 und DDD00000635; p &lt;0,05). (B) In-vivo-Messungen der Biolumineszenz, Biolumineszenz normiert auf GFP-Fluoreszenz und GFP-Fluoreszenz von C elegans Stamm PE254 mit 67 h Entwicklungszeit nach Exposition mit Testverbindungen für 22 Std. Fehlerbalken zeigen SEM technischer Wiederholungen (n = 8). Die statistische Analyse (Ein Weg-ANOVA) durchgeführt auf gepoolten Daten aus drei Datensätzen (3 xn = 8). * p &lt;0,05 bzw. *** p &lt;0,001 in Bezug auf jeweilige Fahrzeugsteuerung. Differences zwischen 25 und 100 uM nur statistisch signifikant (p &lt;0,05) für normierte Biolumineszenz nach Einwirkung C4 (DDD00023047). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Uhrzeit </td><td> Tag 1 </td><td> Tag 2 </td><td> Tag 3 </td><td> Tag 4 </td><td> Tag 5 </td><td> Tag 6 </td><td> Tag 7 </td><td> Tag 8 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Schritt 5 </td></tr><tr><td> 10-11 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Schritt 5 </td></tr><tr><td> 11-12 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Schritt 4 </td><td> Schritt 5 </td></tr><tr><td> 12-13 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Schritt 4 </td><td></td></tr><tr><td> 13-14 </td><td&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14-15 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15-16 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 16-17 </td><td> Schritt 1 </td><td></td><td></td><td></td><td> Schritt 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 17-18 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 18-19 </td><td></td><td></td><td></td><td> Schritt 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Übersicht über die Protokollschritte, die an jedem Tag der Nematoden Experimenten (Abschnitt 3) durchgeführt werden und schlug Timings.

Es wird ein Protokoll für den in vivo Nachweis der Wirkungen von mitochondrialen Inhibitoren im Modellorganismus Caenorhabditis elegans und für die Identifizierung potenziell verstärkender Verbindungen beschrieben. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Arzneimittelbibliotheken auf Verbindungen zu untersuchen, die die mitochondriale Funktion modulieren.

Ein screenbaren<em&gt; In-vivo-</em&gt; Assay für Mitochondriale Modulatoren Verwendung transgener Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mitochondriale Toxizität oder positive Wirkungen von Wirkstoffen mithilfe des Modellorganismus C. elegans zu identifizieren. Dies wird durch die in-vivo-Quantifizierung von ATP-Spiegeln in transgenen C. elegans-Stämmen erreicht, die das Feuerfaden-Enzym Luciferase, das mit dem grün fluoreszierenden Protein fusioniert ist, exprimieren.Das Fusionsgen verleiht Nematoden zwei unterschiedliche Eigenschaften. Die erste besteht darin, dass die Nematoden bei Zugabe des Substrats Luciferin Licht im sichtbaren Bereich emittieren, und zwar proportional zu ihren zellulären ATP-Reserven. Die zweite ist, dass sie bei Bestrahlung mit der geeigneten Wellenlänge intensive grüne Fluoreszenz zeigen.Die Fluoreszenz ist unabhängig von den TP-Spiegeln der Nematoden und proportional zu ihrer Masse oder Anzahl. Daher kann sie zur Normierung der Biolumineszenzmessungen verwendet werden. Während eines typischen Assays wird eine Entwicklung synchronisierter Würmer bis zum L4-Larvenstadium kultiviert.Die Nematoden werden anschließend über einen bestimmten Zeitraum mit den Testwirkstoffen behandelt, bevor sowohl die Fluoreszenz als auch die Biolumineszenz gemessen werden. Die Ergebnisse zeigen eine potenzielle Arzneimitteltoxizität. Wenn die Biolumineszenz vermindert ist, deutet ein verstärktes Signal auf einen Treffer hin, der für weitere Tests hinsichtlich positiver Wirkungen auf die mitochondriale Funktion untersucht werden sollte.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Wirkstoffprüfung an kultivierten Zellen besteht darin, dass die Untersuchung im physiologischen Kontext eines ganzen, lebenden, vielzelligen Organismus erfolgt, der den Menschen hinsichtlich der genetischen Augenheilkunde bis zu 50 % ähnlich ist. Ebenso wie beim Menschen benötigt der Fadenwurm tatsächlich eine mitochondriale oxidative Phosphorylierung, um sich zum Erwachsenen zu entwickeln, und seine Mitochondrien teilen mit den Mitochondrien von Säugetieren viele Merkmale bezüglich Struktur, Funktion und Bioenergetik. Zu den kritischen Parametern innerhalb des Protokolls gehören der Entwicklungsstand, zu dem die Exposition beginnt, die Dauer der Exposition des Nematoden gegenüber der Substanz von Interesse, das Aussäen einer vergleichbaren Anzahl von Nematoden in jede der Vertiefungen sowie natürlich die Vermeidung von Kontaminationen. Am ersten Tag überführen Sie unter sterilen Bedingungen Nematoden von einer sechs Zentimeter großen Nematoden-Wachstumsmedium-Platte in zwei Milliliter S-vollständigem Medium in ein Reagenzglas mit 30 Gramm pro Liter E. coli.OP 50 im S-kompletten Medium, anschließend den Kolben am vierten Tag unter Schütteln inkubieren, die Kultur der GR-Nematoden mit Bleichmittel behandeln, um die Eier zu gewinnen und die Wurmpopulation zu synchronisieren. Danach die Eier über Nacht in einem Glaskolben mit 15 Milliliter S-komplettem Medium unter Schütteln inkubieren; am nächsten Tag, dem fünften Tag, befinden sich die Nematoden im gleichen Wachstumsstadium. Um die Anzahl der geschlüpften Würmer zu bestimmen, jedes Mal mit einer sauberen Pipettenspitze drei Aliquots zu je 100 Mikroliter Nematoden in separate Mikroröhrchen überführen, die jeweils 900 Mikroliter Medium enthalten, ergänzt mit 0,01 % Tween 20, und mehrmals auf- und abpipettieren, um eventuell an der Spitze haftende Würmer freizusetzen.Anschließend zählen Sie die Nematoden in vier getrennten Tropfen à 10 Mikroliter aus jedem der drei Verdünnungsgefäße und berechnen Sie das Volumen der Nematodensuspension, das benötigt wird, um zwei 20-Milliliter-Kulturen mit 10 Nematoden pro 10 Mikroliter anzusetzen. Geben Sie die ungefähren Volumina in zwei vorher gewogene kegelförmige 15-Milliliter-Röhrchen. Wiegen Sie die Röhrchen, um das tatsächlich zugegebene Volumen zu bestimmen. Anschließend vorsichtig verwirbeln, um die Zielvolumina einzustellen, und überschüssiges Volumen entfernen.Waschen Sie die Nematoden nun insgesamt mit 14 Milliliter frischem S-complete-Medium pro Röhrchen und resuspendieren Sie die Pellets in fünf Milliliter S-complete-Medium mit 30 Gramm pro Liter Equali OP50. Überführen Sie die Nematoden in kegelförmige Glasflaschen, die 15 Milliliter S-complete-Medium mit 30 Gramm pro Liter Equali enthalten.OP 50 auf ein Gesamtvolumen von 20 Millilitern pro Kolben auffüllen und die Zeit der Fütterung aufzeichnen. Die Anzahl der Nematoden in neun Tropfen zu je 10 Mikroliter mitteln, um zu bestätigen, dass die Kulturen auf 10 Nematoden pro 10 Mikroliter verdünnt sind. Die Kulturen für 42 bis 44 Stunden in den Inkubator stellen.Am siebten Tag werden die Nematodenkulturen unter kontinuierlichem, sanftem Schwenken in einen einzigen Kolben überführt. Anschließend übertragen Sie drei vier-Milliliter-Aliquote von Nematoden in eine einzelne sterile 60-Milliliter-Wanne. Verwenden Sie eine Acht-Kanal-Pipette, um 25 Mikroliter suspendierte Nematoden pro Vertiefung in eine 96er-Platte zu pipettieren.Schwarze Mikrotiterplatten mit flachen, transparenten Böden. Danach die Deckel wieder auf die Platten setzen und die Platten beiseite stellen. Jedes Mal, wenn zwei Platten beimpft wurden, zwei weitere Aliquots von jeweils 2,5 Milliliter Nematoden in den Vorratsbehälter überführen, um das verlorene Volumen zu ersetzen.Nachdem 13 bis 14 Platten mit Nematoden beimpft wurden, 74 Mikroliter S-vollständiges Medium in jedes Brunnen hinzufügen und die Platten in eine feuchte Kammer und einen schüttelnden Inkubator überführen, bis die Medikamentengabe erfolgt, während die Platten geschüttelt werden. Zwei 96-Well-Medikamentenplatten zum Testen auftauen. Anschließend unter Verwendung einer Mehrkanalpipette arbeiten und die Spitzen jedes Mal wechseln.Übertragen Sie ein Mikroliter aus der ersten Spalte der ersten Wirkstoffplatte in die Spalten eins bis fünf einer Nematodenplatte. Übertragen Sie ein weiteres Mikroliter aus der zweiten Spalte der Wirkstoffplatte in die Spalten acht bis 12 der Nematodenplatte. Geben Sie anschließend je ein Mikroliter Fahrzeuglösung in die Spalten sechs und sieben der Nematodenplatte.Verwenden Sie die verbleibenden Spalten in der Drug-Platte, um die restlichen Nematoden-Platten auf die gleiche Weise zu behandeln, wobei darauf zu achten ist, auch zwei ausschließlich mit Vehicle behandelte Platten einzuschließen. Danach kehren Sie alle Platten für weitere 20 bis 22 Stunden am achten Tag in die feuchten Kammern im schüttelnden Inkubator zurück. Um eine Hintergrundkontrollplatte für die Fluoreszenzmessungen vorzubereiten, kombinieren Sie den Inhalt der Vertiefungen einer ausschließlich mit Vehicle behandelten Nematoden-Platte und lassen Sie die Nematoden zwei bis drei Minuten lang absetzen.Sammlen Sie anschließend die Bakterien enthaltende snat und geben Sie 100 Mikroliter-Proben in jede Vertiefung einer schwarzen Mikroplatte mit transparentem Boden. Untersuchen Sie die Platte unter dem Mikroskop und notieren Sie die Vertiefungen, in denen die Nematoden sichtbar sind, um diese Vertiefungen von der fluoreszenzintensitätsbasierten Hintergrundschätzung auszuschließen. Messen Sie danach abschließend die Fluoreszenz, um die Biolumineszenz für jede Platte zu bestimmen.Geben Sie jeweils 50 Mikroliter frisch zubereiteten Lumineszenzpuffer in jedes Loch, stellen Sie die Platte auf eine schüttelnde Plattform und starten Sie die Stoppuhr nach drei Minuten. Messen Sie die Lumineszenz mit einer Sekunde pro Messung. In diesem ersten repräsentativen Experiment verringerte Rotenon, ein Inhibitor des mitochondrialen Komplexes I, die Lichtemission der Nematoden nach sowohl relativ kurzen als auch längeren Expositionen über einen Bereich von Konzentrationen hinweg.In diesem Experiment wurde gezeigt, dass das Herbizid Paraquat die Biolumineszenz, die GFP-Fluoreszenz und die normalisierte Biolumineszenz des C-Stamms PE 2 54 signifikant verringert. Außerdem war der Rückgang der Biolumineszenz stärker als der der Fluoreszenz, was mit den bekannten Effekten einer verminderten mitochondrialen Funktion und einer reduzierten ATP-Produktion übereinstimmt, die durch den Wirkstoff hervorgerufen werden. Dieses Diagramm veranschaulicht ein Beispiel für eine Substanz, die die Biolumineszenz des Fadenwurms verstärkt, nämlich Oxalacetat, ein Zwischenprodukt des Citratzyklus, in einer einzelnen Konzentration von acht Millimolar.Beachten Sie, dass die zwischen diesen Wiederholungen beobachtete experimentelle Variabilität bei Luciferase-basierten Experimenten nicht ungewöhnlich ist. Hier zeigten sich hemmende Verbindungen der Firefly-Luciferase, die die in-vitro-Luciferase-Aktivität bei 25 Mikromolar und 100 Mikromolar beeinflussten, wobei die DDD-Verbindung eine nahezu vollständige Abschwächung der Aktivität bewirkte. Obwohl die Bedingungen nicht direkt vergleichbar sind, wurde auch in vivo nach Behandlung mit Luciferase-hemmenden Verbindungen ein signifikanter Rückgang der Biolumineszenz beobachtet.Es wird gezeigt, dass Änderungen der Biolumineszenz auf die Wirkung von Luciferase-Enzyminhibitoren zurückzuführen sein können, anstatt auf Veränderungen der in-vivo-ATP-Spiegel. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu berücksichtigen, dass Verbindungen die Aktivität des Glühwürmchen-Luciferase-Enzyms direkt beeinflussen können, anstatt den Energiestatus des Wurms zu verändern. Daher können Sub-Heats mit verschiedenen Techniken zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion validiert werden, wie beispielsweise der Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs, der Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials, der Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies oder der Visualisierung der Mitochondrien in Stämmen von C. elegans.Mit GFP-Markierung, Mitochondrien.

a-screenable-vivo-assay-for-mitochondrial-modulators-using-transgenic

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein Verfahren zur Flüssig-Kultivierung und die Abgabe...

High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme

Quelle: Anderson, Q. L. et al. Ein Pathosystem von C. elegans mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt auf Flüssigkeitsbasis. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt eine Hochdurchsatz-Screening-Methode mit Caenorhabditis elegans , um Gen-Knockdowns während Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen. Es beschreibt das Verfahren zur Aufbereitung von Knockdown-Würmern und deren Übertragung auf Testplatten, um die Auswirkungen der erregerinduzierten Wurmabtötung zu bewerten.

Ein flüssiger Multiwell-Assay für das Screening von C. elegans-Knockdowns

Dieses Video zeigt einen in vivo Assay zur Untersuchung der Mitophagie bei Caenorhabditis elegans. Nach Exposition der Nematoden gegenüber einem Mitophagie-induzierenden Medikament wird das Auftreten von Mitophagie durch Kolokalisation zwischen DCT-1, einem Mitophagierezeptor auf den geschädigten Mitochondrien, und dem autophagosomalen Membranprotein LGG-1 bewertet.

Ein In-vivo-Assay zum Nachweis von Mitophagie in transgenen Nematoden

Mit seinem kleinen transparenten Körper, gut dokumentierte Neuroanatomie und einer Vielzahl von zugänglicher genetischen Techniken und...

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

Die Prionen-ähnliche Vermehrung von Proteinaggregaten hat sich in letzter Zeit als an vielen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu beschreiben, wie der Fadenwurm C. elegans als Modellsystem zur Überwachung der Proteinausbreitung und zur Untersuchung prionenähnlicher Phänomene verwendet werden kann.

Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine ​​Mit dem Metazoan Modellorganismus<em&gt; C. elegans</em

Genetisch kodierte Histon-miniSOG induziert genomweite vererbbare Mutationen in einem blauen Licht abhängig. Diese Mutagenese-Methode ist einfach, schnell, frei von giftigen Chemikalien und gut geeignet für vorwärts genetisches Screening und Transgen-Integration.

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Mitophagy, den Prozess der Clearing beschädigt Mitochondrien ist für mitochondriale Homöostase und Gesundheit Wartung notwendig. Dieser Artikel stellt einige der neuesten Mitophagy Nachweismethoden in menschlichen Zellen, Caenorhabditis Elegansund Mäuse.

In Vitro und In Vivo Nachweis von Mitophagy in menschlichen Zellen, C. Elegansund Mäuse

Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Herstellung von schnell Hunderte von Nematoden Wachstum Medien Agar, 96-Well-Kultur-Platten mit einer konsistenten Anzahl von Caenorhhabditis Elegans pro Bohrloch. Diese Kulturen sind nützlich für das phänotypische Screening von ganzen Organismen. Wir konzentrieren uns hier auf dieser Kulturen zu Bildschirm Chemikalien für pro-Langlebigkeit-Effekte verwenden.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Diese Studie präsentiert Protokolle für zwei halbautomatische Ansätze zur Analyse der Bewegungsaktivität in C. elegans Komplex I Krankheit Gas-1(fc21) Würmer, nämlich ZebraLab (ein Mitteldurchsatz-Assay) und WormScan (ein Hochdurchsatz-Assay) und bieten vergleichende Analysen unter einer Vielzahl von Forschungsmethoden zur Quantifizierung des Nematodenverhaltens und der integrierten neuromuskulären Funktion.

Vergleichende Analyse experimenteller Methoden zur Quantifizierung der Tieraktivität bei Caenorhabditis elegans Modellen der mitochondrialen Erkrankung

Darmmikroben können die Gesundheit ihres Wirts über spezifische oder konservierte Mechanismen positiv oder negativ beeinflussen. Caenorhabditis elegans ist eine bequeme Plattform, um nach solchen Mikroben zu suchen. Das vorliegende Protokoll beschreibt das Hochdurchsatz-Screening von 48 Bakterienisolaten auf Auswirkungen auf die Nematoden-Stressresistenz, die als Proxy für die Gesundheit von Würmern verwendet werden.

Hochdurchsatz-Screening mikrobieller Isolate mit Auswirkungen auf die Gesundheit von Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Ansatz für die Abbildung der mitochondrialen Morphologie in mehreren Geweben von C. elegans während des Alterns.

Bildgebung und Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie bei C. elegans während des Alterns

Erfahren Sie einen In-vivo-Assay zur Identifizierung mitochondrialer Modulatoren mit transgenen Caenorhabditis elegans. Diese Methode ermöglicht das Screening von Arzneimittelbibliotheken zur Quantifizierung zellulärer ATP-Reserven.

Ein screenbaren

Weitere Videos entdecken