Ein flüssiger Multiwell-Assay für das Screening von C. elegans-Knockdowns

Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit Agar-Medien, die mit RNAi-Bakterien vorgespottet sind, mit oder ohne genspezifisches Insert, das auf ein C. elegans-Gen abzielt.

Säen Sie synchronisierte Würmer im L1-Stadium in die Vertiefungen und inkubieren Sie sie, um die RNAi-Bakterien fressen zu können.

Das Insert produziert interferierende RNA, die auf bestimmte Wurmgene abzielt und einen genspezifischen Knockdown-Phänotyp erzeugt.

Geben Sie Puffer in die Vertiefungen und suspendieren Sie die Würmer vorsichtig wieder.

Übertragen Sie die Suspension auf eine Deep-Well-Platte und lassen Sie die Würmer sich durch die Schwerkraft absetzen.

Entfernen Sie den Überstand und behalten Sie etwas Puffer bei.

Waschen Sie die Würmer mit Puffer, entsorgen Sie dann den Überstand und lassen Sie eine kleine Menge Puffer übrig.

Nehmen Sie als Nächstes eine Multi-Well-Assay-Platte mit pathogenen Bakterien.

Geben Sie eine definierte Anzahl von Bekämpfungs- und Knockdown-Würmern in ihre jeweiligen Vertiefungen, um Wirt-Pathogen-Interaktionen zu ermöglichen. Die pathogenen Bakterien sezernieren Verbindungen, die das Absterben von Würmern auslösen.

Vergleichen Sie die Wurmmortalität, um die Auswirkungen des genspezifischen Knockdowns auf das Überleben von Würmern zu bewerten.

Fügen Sie einen Milliliter S Basal pro Vertiefung einer 24-Well-Platte hinzu, die 300 Würmer pro Vertiefung enthält. Rühren Sie die Würmer vorsichtig durch Schütteln der Platte und geben Sie die Würmer dann auf eine leere, sterile 24-Deep-Well-Platte.

Lassen Sie die Würmer sich durch die Schwerkraft ansiedeln, etwa fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand, lassen Sie etwa einen Milliliter pro Vertiefung übrig, und fügen Sie dann 7 Milliliter S Basal in jede Vertiefung hinzu. Wiederholen Sie die Wäsche noch zwei weitere Male und saugen Sie dann nach der letzten Wäsche alle bis auf etwa 400 Mikroliter Überstand an.

Nachdem Sie die Bakterien in 384-Well-Platten pipettiert haben, um Hunger zu vermeiden, sortieren Sie mit der Resampler-Funktion des Wurmsortierers 22 Würmer in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte. Fügen Sie schließlich nach dem Sortieren kleine Moleküle oder andere experimentspezifische Materialien hinzu.