Die Analyse der Entwicklung von Zahnkeim Innervation Mit Microfluidic Co-Kultur-Geräte

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Isolierung und Kokultivierung der sich entwickelnden Nervus-trigeminus-Ganglien und Zahnanlagen zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Mikrofluidikgeräte sterilisiert, montiert und beschichtet werden. Der zweite Schritt beinhaltet die Dissektion der Nervus-trigeminus-Ganglien und Zahnanlagen aus einem bestimmten Entwicklungsstadium der betreffenden Maus.

Anschließend werden die Ganglia trigemina und die Zahnanlagen in die mikrofluidischen Vorrichtungen gegeben und gemeinsam kultiviert. Im letzten Schritt werden die Zellen fixiert und mittels Immunfluoreszenz gefärbt. Abschließend wird mit Hilfe der Mikroskopie das Innervationsmuster dargestellt, das sich aus der Kokultur ergibt.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden, wie herkömmlichen Co-Kulturen, besteht darin, dass diese Methode die Co-Kultur verschiedener Organe und Gewebe ermöglicht, wobei jedes in seinem jeweils optimalen Kulturmedium gehalten wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der künstlichen Odontogenese zu beantworten, beispielsweise die Rolle unterschiedlicher Moleküle bei der Zahnbildung sowie die Regelung der Odontogenese in der Zahnbildung. Beginnen Sie damit, die Dissektionswerkzeuge, darunter ein Paar Mikrodissektionspinzetten und eine Schere, im Autoklaven zu sterilisieren.

Als Nächstes sterilisieren Sie eine Charge von 24 Millimeter mal 24 Millimeter großen Glasobjektträgern, indem Sie diese 24 Stunden lang in eine Lösung aus einmolarer Salzsäure auf einem rotierenden Schüttler bei 37 Grad Celsius geben. Danach spülen Sie die Objektträger dreimal mit steriler destillierter Wasser ab, gefolgt von drei Spülgängen mit 99 % Ethanol. Trocknen Sie sie anschließend unter einer sterilen Flusslufthaube; sobald sie trocken sind, schalten Sie das UV-Licht der Haube für 30 Minuten ein. Bewahren Sie die Objektträger danach bis zur Verwendung in 70 % Ethanol auf.

Verwenden Sie anschließend sterile Pinzetten, um die mikrofluidischen Vorrichtungen zur Axonisolation vorsichtig aus der Verpackung zu entnehmen, und platzieren Sie sie mit einer sterilen 1-mm-Biopsie-Stanze in eine sterile Petrischale. Erstellen Sie je eine Öffnung in den Vorrichtungen für jede Probe in Übereinstimmung mit den Kultursammelkammern.

Seien Sie vorsichtig, nicht zu nahe an den Mikrorillen zu stanzen, da diese durch den Druck beschädigt werden könnten. Danach sterilisieren Sie die Geräte, indem Sie sie in 70 % Ethanol eintauchen, wobei darauf geachtet werden muss, dass sämtliche eingeschlossene Luft entfernt wird.

Entfernen Sie anschließend die Geräte aus dem Ethanol und trocknen Sie sie vollständig unter einer sterilen Flusshaube. Entfernen Sie außerdem die Deckgläser aus der 70 %igen Ethanol-Lösung und lassen Sie sie unter der sterilen Flusshaube trocknen. Warten Sie mindestens drei Stunden, bevor Sie fortfahren.

Legen Sie jede Deckglasplatte in eine Vertiefung einer sechslochigen Platte. Bringen Sie dann die mikrofluidische Vorrichtung auf dem Deckglas an und drücken Sie vorsichtig, aber fest mit der Pinzette, um eine vollständige Haftung zwischen der Isolationsvorrichtung und dem Glasdeckchen zu gewährleisten. Geben Sie anschließend 150 Mikroliter von 0,1 Milligramm pro Milliliter Poly-D-Lysin in jede der Kulturkammern.

Danach die mikrofluidischen Vorrichtungen fünf Minuten lang unter Vakuum stellen, um die Luft vollständig aus den Kammern zu entfernen. Falls noch Luft in den Kammern sichtbar ist, die Poly-D-Lysin-Lösung erneut in die Kammern geben.

Inkubieren Sie die Geräte am nächsten Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Poly-Lysin. Waschen Sie die Kammerdreimal mit steriler, destillierter Wasser und füllen Sie anschließend die Kammer mit 150 Mikrolitern einer Laminin-Arbeitslösung mit einer Konzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter. Inkubieren Sie sie dann über Nacht bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie danach das Kulturmedium für die Trigeminusganglien und Zahnlämmerkulturen wie im begleitenden textlichen Protokoll beschrieben vor.

Reinigen Sie den Präparationsbereich und das Stereomikroskop mit 70 %igem Ethanol und legen Sie die Präparationsinstrumente bereit, nachdem das Tier getötet wurde. Präparieren Sie die Haut um den Unterbauch einer trächtigen Maus mit Embryonen im Stadium E 14,5 bis E 17,5. Öffnen Sie anschließend vorsichtig den Bauchraum mit einer Schere.

Ortung der Gebärmutter, Entfernung und Einlegen in ein mit Eis gefülltes Röhrchen. Bei kaltem PBS die Embryonen freilegen und einzeln in eine neue Petrischale mit eiskaltem PBS geben. Sobald alle Embryonen von den extraembryonalen Geweben befreit wurden, mit einer Schere enthaupten.

Trennen Sie den Unterkiefer mit einer mikrochirurgischen Schere vorsichtig vom restlichen Kopf, wobei darauf zu achten ist, dass die Ganglien des Nervus trigeminus nicht beschädigt werden. Anschließend wird der Kopf auf eine gekühlte Glasschale (Petrischale) gelegt. Entfernen Sie mit einer Pinzette Haut und Schädel.

Danach die Pinzette unterhalb des Cephalons ansetzen und anheben. Um das Cephalon und das Kleinhirn zu entfernen, lokalisiert man die Ganglia trigeminalia und trennt diese mithilfe der Pinzette und Dissektionsnadeln von den Nervi trigeminalis, wobei die Ganglien gereinigt werden. Man bewahrt sie unter Verwendung der Dissektionsnadeln als Schneidewerkzeug in kaltem PBS auf.

Entfernen Sie die Zunge und die Haut, die den Kiefer umgibt. Trennen Sie den linken und den rechten Hemi-Kiefer, indem Sie entlang der Kiefermittellinie schneiden. Lokalisieren Sie anschließend die Zahnanlagen und isolieren Sie diese mithilfe von Dissektionsnadeln. Nach der Dissektion der Ganglion trigeminale und der Zahnanlagen entfernen Sie das Laminin aus den mikrofluidischen Vorrichtungen und füllen die Kammern mit jeweils 200 Mikrolitern des entsprechenden Mediums.

Mit einer Pinzette die dissezierten Ganglia trigeminales und Zahnanlagen vorsichtig in die mit einer Biopsie-Stanze erzeugten Löcher überführen. Sicherstellen, dass die Zahnanlagen nicht schwimmen und absinken, bis sie die Deckgläser berühren. Die Proben im Brutschrank bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid kultivieren.

Ersetzen Sie das Kulturmedium alle 48 Stunden über einen Zeitraum von 10 Tagen. Entfernen Sie zunächst das Medium, indem Sie die Pipette auf die äußere Seite der Vertiefungen ausrichten. Geben Sie dann das frische vorgewärmte Medium auf die Seite der Vertiefungen, die während der Kulturperiode gegenüber den Kammern liegt.

Die Kokulturen jederzeit mittels Lichtmikroskopie abbilden. Nach der Kultivierungszeit die Kammern durch Pipettieren von 150 Mikrolitern PBS in ein Loch pro Kammer spülen, sodass das PBS durch die Kammern fließt. Die Spülung insgesamt dreimal wiederholen, wobei nach dem letzten Spülvorgang erneut gespült wird.

Entfernen Sie das PBS und fixieren Sie die Proben, indem Sie 150 Mikroliter 4 % Paraformaldehyd in PBS in ein Loch pro Kammer pipettieren und durch die andere Kammer fließen lassen. Inkubieren Sie das Gerät 15 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Kammern anschließend zweimal mit PBS und fahren Sie mit weiteren Analysen wie immunfluoreszenzbasierter Färbung und Abbildung des Auswuchses fort.

Während der Kultur auf Kohle verzweigen sich Neuriten aus dem Ganglion trigeminale aus dessen Kulturkompartiment und wachsen in Richtung des sich entwickelnden Zahnschirms. Bei höherer Vergrößerung lassen sich die Neuriten erkennen, die durch die axonalen Kammern und die mikroskopischen Rillen in der mikrofluidischen Vorrichtung verlaufen. Das Fortschreiten des Nervenwachstums kann über die Zeit verfolgt werden, um die Entwicklung der Innervation zu beschreiben.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie RNA- oder PROTEINISIERUNG durchgeführt werden, um beispielsweise Veränderungen der Genexpression oder der Proteinausschüttung in den Zielgeweben nach Innovation zu untersuchen.