Die Analyse der Entwicklung von Zahnkeim Innervation Mit Microfluidic Co-Kultur-Geräte

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu zeigen, wie die sich entwickelnden Trigeminusganglien und Zahnkeime isoliert und co-kultiviert werden können. Dies wird erreicht, indem die mikrofluidischen Geräte zunächst sterilisiert, montiert und beschichtet werden. Der zweite Schritt besteht darin, Trigeminusganglien und Zahnkeime aus einem bestimmten Entwicklungsstadium bei der interessierenden Maus zu präparieren.

Als nächstes werden die Trigeminusganglien und die Zahnkeime in die mikrofluidischen Geräte eingebracht und co-kultiviert. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen zu fixieren und mit Immunfluoreszenz zu färben. Letztendlich wird die Mikroskopie verwendet, um das Innervationsmuster zu zeigen, das das Ergebnis der Co-Kultur ist.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. konventionellen Co-Kulturen, besteht darin, dass diese Methode die Co-Kultur verschiedener Organe und Gewebe ermöglicht, jedes in seiner eigenen optimalen Kultur. Mittel. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der künstlichen Innovation zu beantworten, wie z. B. die Rolle verschiedener Moleküle bei der Zahninnovation und die Innovationsregel bei der Zahnentwicklung. Beginnen Sie mit dem Autoklavieren von Sezierwerkzeugen, zu denen eine Mikrodissektionszange und eine Schere gehören.

Als nächstes sterilisieren Sie eine Charge von 24 Millimeter x 24 Millimeter großen Glasdeckgläsern, indem Sie sie 24 Stunden lang in eine Lösung aus einem molaren Salzsäure auf einem Orbitalschüttler bei 37 Grad Celsius legen. Waschen Sie dann die Einbezugsbezüge dreimal mit sterilem destilliertem Wasser, gefolgt von drei Spülgängen in 99% Ethanol, trocknen Sie sie nach dem Trocknen unter einer sterilen Strömungshaube und schalten Sie das UV-Licht der Haube 30 Minuten lang ein. Lagern Sie dann die Deckgläser in 70%igem Ethanol, bis sie benötigt werden.

Nehmen Sie anschließend mit einer sterilen Pinzette vorsichtig die mikrofluidischen Geräte zur Axonisolierung aus ihrer Verpackung und legen Sie sie mit einem sterilen Ein-Millimeter-Biopsiestanzer in eine sterile Petrischale. Erstellen Sie für jede Probe ein Loch in den Geräten. In Korrespondenz der Kulturkammern.

Achten Sie darauf, nicht zu nah an die Mikrorillen zu stanzen, da diese durch den Druck beschädigt werden könnten. Als nächstes sterilisieren Sie die Geräte, indem Sie sie in 70 % Ethanol umwandeln. Achten Sie darauf, die gesamte eingeschlossene Luft zu entfernen.

Anschließend nehmen Sie die Geräte aus dem Ethanol und trocknen sie vollständig unter einer sterilen Fließhaube. Entfernen Sie außerdem die Deckgläser von der 70%igen Ethanollösung und lassen Sie sie unter der sterilen Durchflusshaube trocknen. Warten Sie mindestens drei Stunden, bevor Sie fortfahren.

Legen Sie jeden Deckeinschub in eine Vertiefung innerhalb einer Platte mit sechs Vertiefungen. Setzen Sie dann das mikrofluidische Gerät auf den Deckglas und drücken Sie mit der Pinzette sanft, aber fest, um eine vollständige Haftung zwischen dem Isolationsgerät und dem Glasdeckglas zu ermöglichen. Als nächstes pipettieren Sie 150 Mikroliter von 0,1 Milligramm pro Milliliter, Poly-D-Lycin in jede der Kulturkammern.

Stellen Sie dann die mikrofluidischen Geräte fünf Minuten lang unter Vakuum, um die gesamte Luft aus den Kammern zu entfernen. Wenn noch Luft in den Kammern zu sehen ist. Die Poly-D-Lysin-Lösung in die Kammern zurückführen.

Inkubieren Sie die Geräte am nächsten Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Poly de Lysin. Waschen Sie die Kammern dreimal mit sterilem destilliertem Wasser und füllen Sie dann die Kammern mit 150 Mikrolitern zu fünf Mikrogramm pro Milliliter, Lamin-Arbeitslösung, und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Als nächstes reparieren Sie Medien für die Trigeminusganglien und Zahnkeimkulturen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.

Reinigen Sie den Präparierbereich und das Stereoskop mit Ethanol 70% und platzieren Sie die Präparierinstrumente nach der Opferung. Präparieren Sie die Haut um den Unterbauch einer trächtigen Maus mit Mausembryonen der Stadien E 14,5 bis E 17,5. Öffne dann vorsichtig mit einer Schere den Bauch.

Lokalisieren Sie die Gebärmutter, entfernen Sie sie und legen Sie sie in eine mit Eis gefüllte Röhre. Kaltes PBS präpariert die Embryonen und legt sie einzeln in eine neue Petrischale, die mit eiskaltem PBS gefüllt ist. Sobald alle Embryonen aus dem überschüssigen embryonalen Gewebe entnommen wurden, enthaupten Sie sie mit einer Schere.

Trennen Sie den Unterkiefer mit einer Mikrodissektion oder einer Schere vom Rest des Kopfes und achten Sie darauf, die Trigeminusganglien nicht zu beschädigen. Nehmen Sie dann den Kopf und legen Sie ihn auf eine gekühlte Petrischalen aus Sezierglas. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut und den Schädel zu entfernen.

Legen Sie dann eine Pinzette unter das Cephalon und heben Sie sie an. Um das Cephalon und das Kleinhirn zu entfernen, lokalisieren Sie die Trigeminusganglien und verwenden Sie die Pinzette und die Dissektionsnadeln, um die Trigeminusganglien von den Trigeminusnerven zu trennen und die Ganglien zu reinigen. Bewahren Sie sie in kaltem PBS mit Seziernadeln als Messer auf.

Entferne die Zunge und die Haut, die den Kiefer umgibt. Trennen Sie die linke und die rechte Halbkiefer, indem Sie entlang der Mittellinie des Kiefers schneiden. Lokalisieren Sie dann die Zahnkeime und isolieren Sie diese mit Präpariernadeln nach Dissektion der Trigeminusganglien und Zahnkeime, entfernen Sie das Laminin aus den mikrofluidischen Geräten und füllen Sie die Kammern mit 200 Mikrolitern des jeweiligen Mediums.

Übertragen Sie mit einer Pinzette die präparierten Trigeminusganglien und Zahnkeime vorsichtig in die mit einem Biopsiestempel geschaffenen Löcher. Achten Sie darauf, dass die Zahnkeime nicht schwimmen und bis zum Kontakt mit dem Deckglas absinken. Kultivieren Sie die Proben in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.

Wechseln Sie das Kulturmedium 10 Tage lang alle 48 Stunden, um das Medium zu wechseln. Entfernen Sie zunächst das Medium, indem Sie die Pipette auf die Außenseite der Vertiefungen richten. Dann das frische Vorwärmmedium auf die Seite der Wels geben, die sich während der Kulturzeit gegenüber den Kammern befindet.

Bilden Sie die Co-Kulturen jederzeit mit Hilfe der Lichtmikroskopie. Waschen Sie die Kammern nach der Kulturperiode, indem Sie 150 Mikroliter PBS in eine Vertiefung pro Kammer pipettieren und PBS durch die Kammern fließen lassen. Wiederholen Sie die Wäsche nach der letzten Wäsche insgesamt dreimal.

Entfernen Sie das PBS und fixieren Sie die Proben, indem Sie 150 Mikroliter 4%Paraform-Aldehyd in PBS in eine Vertiefung pro Kammer pipettieren und in die andere Kammer fließen lassen. Inkubieren Sie das Gerät 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Kammern zweimal mit PBS und fahren Sie mit weiteren Analysen wie Immunfluoreszenzfärbung und Bildgebung des Auswuchses fort.

Bei der Kohlekultur verzweigen sich Neuriten aus den Trigeminusganglien aus ihrem Kulturkompartiment und dehnen sich in Richtung des sich entwickelnden Zahnkeims aus. Bei einer höheren Vergrößerung kann man die Neuriten sehen, die sich durch die axonalen Kammern erstrecken, und die Mikrorillen in der mikrofluidischen Vorrichtung. Der Fortschritt des Nervenwachstums kann im Zeitverlauf verfolgt werden, um die Innovationsentwicklung zu beschreiben.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie RNA oder PROTEINISIERUNG durchgeführt werden, um beispielsweise Veränderungen der Genexpression oder der Proteinsekretion in den Zielgeweben nach Innovationen zu untersuchen.