Analyse der Wechselwirkungen zwischen Zahnkeimen und Trigeminusganglien mit Hilfe eines mikrofluidischen Co-Kultursystems

Nehmen wir ein mikrofluidisches Gerät, das mit einem synthetischen Polymer und einem Adhäsionsprotein beschichtet ist.

Das Gerät besteht aus Vertiefungen und miteinander verbundenen Kulturkammern, die durch Mikrorillen getrennt sind.

Die Kammern enthalten gestanzte Löcher für die Gewebeplatzierung.

Gewinnen Sie die Trigeminusganglien, eine Ansammlung von Trigeminus-Neuronenzellkörpern, und Zahnkeimen, pränatale Strukturen, die sich zu erwachsenen Zähnen entwickeln, aus einem Mausembryo.

Legen Sie die Gewebe in die Löcher und fügen Sie die entsprechenden Nährmedien hinzu.

Nährstoffe und Vitamine in den Zahnkeimmedien erleichtern das Überleben der Zahnkeime während der Kultivierung.

Die beschichtete Geräteoberfläche und Wachstumsfaktoren in den Trigeminusganglien begünstigen das Auswachsen von Neuriten und Axonen.

Die Axone gelangen durch die Mikrorillen in die Zahnkeimkammer.

Die von den Zähnen abgeleiteten Signale führen zu einer neuronalen Abstoßung, die es den Axonen ermöglicht, den Zahnkeim zu umgeben, ohne ihn zu innervieren.

Waschen Sie die Kulturkammern mit Puffer und fixieren Sie das Gewebe mit einem Fixiermittel.

Die Co-Kultur ist nun bereit für weitere Analysen.

Nach der Dissektion der Trigeminusganglien und Zahnkeime entfernen Sie das Laminin aus den mikrofluidischen Geräten und füllen die Kammern mit 200 Mikrolitern des jeweiligen Mediums. Übertragen Sie mit einer Pinzette die präparierten Trigeminusganglien und Zahnkeime vorsichtig in die mit einem Biopsiestempel geschaffenen Löcher. Achten Sie darauf, dass die Zahnkeime nicht schwimmen und bis zum Kontakt mit den Deckgläsern absinken.

Kultivieren Sie die Proben in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Wechseln Sie das Kulturmedium 10 Tage lang alle 48 Stunden. Um das Medium zu wechseln, entfernen Sie zuerst das Medium, indem Sie die Pipette auf die Außenseite der Vertiefungen richten. Geben Sie dann das frische, vorgewärmte Medium auf die Seite der Vertiefungen, die sich gegenüber den Kammern befinden.

Während der Kulturperiode können Sie die Co-Kulturen jederzeit lichtmikroskopisch abbilden. Waschen Sie die Kammern nach der Kulturperiode, indem Sie 150 Mikroliter PBS in eine Vertiefung pro Kammer pipettieren und PBS durch die Kammern fließen lassen. Wiederholen Sie die Wäsche insgesamt dreimal.

Entfernen Sie nach dem letzten Waschen PBS und fixieren Sie die Proben, indem Sie 150 Mikroliter 4 % Paraformaldehyd in PBS in eine Vertiefung pro Kammer pipettieren und in die andere Kammer fließen lassen. Inkubieren Sie das Gerät 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Kammern zweimal mit PBS und fahren Sie mit weiteren Analysen fort, wie z. B. Immunfluoreszenzfärbung und Bildgebung des Auswuchses.