Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry

Das übergeordnete Ziel dieser spektralen Zytometrietechnik ist es, verschiedene Fluorochrome anhand ihrer gesamten Emissionsspektren zu unterscheiden. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll die Implementierung der Autofluoreszenz als unabhängigen Parameter, was eine korrekte Analyse von Zellen ermöglicht, die aus festen Organen isoliert wurden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Immunologie und Entwicklung der Stammzellbiologie zu beantworten, z. B. wie man seltene Zellpopulationen identifiziert.

Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre einzigartige Fähigkeit, eine große Anzahl von Parametern gleichzeitig zu analysieren und die Autofluoreszenz von festem Gewebe zu steuern. Obwohl diese Methode zur Herstellung einer Einzelzellsuspension aus Darm und Herz verwendet wird, kann sie auch auf andere Organe wie Lunge, Skelett, Muskeln, Leber, Fett und Niere angewendet werden. Isolieren und waschen Sie zunächst den Dünndarm einer erwachsenen Maus.

Legen Sie dann das Taschentuch auf ein Papiertuch und entfernen Sie mit einer scharfen Schere vorsichtig die Peyer-Pflaster. Öffnen Sie den Darm, indem Sie ihn in Längsrichtung durchschneiden und in einen Zentimeter große Stücke teilen. Dann geben Sie das Gewebe in ein Becherglas, das mit 30 Millilitern HBSS gefüllt ist, das mit zehn Prozent FCS angereichert ist, und inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius unter ständigem Rühren für 30 Minuten.

Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, geben Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Kunststoffröhrchen und wirbeln Sie es fünf Minuten lang kräftig ein. Dann inkubieren Sie die Suspension zehn Minuten lang auf Eis, damit große, nicht dissoziierte Fragmente sedimentieren können. Übertragen Sie anschließend den Überstand in ein neues Röhrchen und drehen Sie die Zellen sieben Minuten lang mit dem 120-fachen G.

Nach dem Pelletieren suspendieren wir die Zellen in zehn Millilitern mit einem Prozent FCS in HBSS und zählen sie mit einer Neubauer-Kammer. Vor der Zellfärbung wird die sechste Darmzelle einmal zehn in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen überführt, um eine Negativkontrolle vorzubereiten. Um eine Probe vorzubereiten, geben Sie einmal zehn bis zum Sechstel der Darmzellen, gefolgt von zwei Millilitern HBSS mit einem Prozent FCS in ein neues Fünf-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Suspension bei 120 mal G, bei vier Grad Celsius, fünf Minuten lang.

Nach dem Verwerfen des Überstands suspendieren wir die Zellen in 50 Mikrolitern der Antikörperlösung. Wickeln Sie die Tube in Alufolie ein und inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, fügen Sie der Probe zwei Milliliter eines Prozents FCS in HBSS hinzu und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 120 mal G, vier Grad Celsius.

Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern Propidiumiodidlösung von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter. Nachdem Sie einen Mausembryo enthauptet haben, weichen Sie seinen Körper in einer Petrischale ein, die mit einem vornassen Papiertuch ausgelegt und mit 50 Millilitern einem Prozent FCS in HBSS gefüllt ist. Machen Sie unter einem Stereomikroskop einen Schnitt auf der rechten Seite der Brust des Embryos und öffnen Sie vorsichtig den Brustkorb, um eine Schädigung des Herzens zu vermeiden.

Ergreifen Sie die großen Gefäße und ziehen Sie das Herz heraus, das mit der Lunge und dem Thymus verbunden ist. Übertragen Sie die Organe in eine 35-Milliliter-Petrischale, die mit zwei Millilitern einem Prozent FCS in HBSS gefüllt ist. Isolieren Sie dann das Herz von den umliegenden Organen und dem Bindegewebe.

Nachdem Sie das Herz gewaschen haben, weichen Sie es in einem Milliliter vorgewärmter enzymatischer Lösung ein und zerkleinern Sie das Organ mit einer feinen Pinzette und einem Skalpell unter einem Stereomikroskop in ein Kubikmillimeter große Stücke. Fügen Sie zusätzlich einen Milliliter vorgewärmte enzymatische Lösung hinzu und geben Sie das fragmentierte Gewebe in ein verschlossenes Fünf-Milliliter-Röhrchen. Inkubieren Sie die Probe in horizontaler Position bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten.

Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, homogenisieren Sie das Gewebe durch wiederholtes Pipettieren der Suspension mit einer P1000-Pipette. Legen Sie dann die Proben vertikal positioniert beiseite, bis die Fragmente des unverdauten Gewebes sedimentieren. Den Überstand in ein 50-Milliliter-Röhrchen umfüllen.

Fügen Sie zwei Milliliter zehn Prozent FCS in HBSS hinzu und halten Sie die isolierten Zellen auf Eis. Als nächstes geben Sie zwei Milliliter vorgewärmte enzymatische Lösung in das Fünf-Milliliter-Röhrchen, das das unverdaute Gewebesediment enthält, und fahren Sie mit der Verdauung des Gewebes wie zuvor gezeigt fort, bis kein verbleibendes Gewebe mehr beobachtet wird. Die erhaltene Zellsuspension wird zehn Minuten lang bei 120-fachem G zentrifugiert.

Verwerfen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter von einem Prozent FCS in HBSS, frei von Calcium- und Magnesiumkationen. Um die Herzzellen zu färben, werden 200 Mikroliter der Zellsuspension in Vertiefungen mit einer 96-Well-Platte mit rundem Boden überführt. Die Platte wird eine Minute lang bei 480-fachem G zentrifugiert und der Überstand verworfen.

Als nächstes resuspendieren Sie die Herzzellen in 100 Mikrolitern der Antikörperlösung. Wickeln Sie die Platte in Alufolie ein und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, waschen Sie die Herzzellen mit 200 Mikrolitern eines Prozents FCS in calcium- und magnesiumfreiem HBSS und zentrifugieren Sie die Suspension eine Minute lang bei 480 mal G.

Dann resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern von einem Prozent FCS in HBSS, frei von Kalzium- und Magnesiumionen, und übertragen Sie die Suspension in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen, das mit 200 Mikrolitern eines Prozent FCS in calcium- und magnesiumfreiem HBSS vorgefüllt ist. Zum Schluss fügen Sie 400 Mikroliter eines Prozents FCS in HBSS frei von Calcium- und Magnesiumkationen hinzu, die 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumiodid enthalten, und filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikronylon-Netz. Um die Zellen zu visualisieren, laden Sie die gefärbte Probe in eine Durchflusszytometrie und klicken Sie auf Vorschau, dann zeichnen Sie bis zu zwei mal zehn bis zum sechsten Ereignis in der Probe auf, indem Sie auf "Erfassen" klicken.

Öffnen Sie auf der Registerkarte "Analyse" das Fenster der Farbpalette und registrieren Sie alle untersuchten Parameter, indem Sie das Fluorochrom zusammen mit dem entsprechenden Marker hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass Sie Autofluoreszenz- und Viabilitätsparameter einbeziehen. Analysieren Sie im Kontrollfenster in der Röhrchenliste die erste einzelne gefärbte Probe mit Kompensationsperlen.

Klicken Sie dann im Arbeitsblatt auf das Polygondesign-Werkzeug, und begrenzen Sie die Raupenpopulation im FSC SSC-Diagramm. Doppelklicken Sie auf das Tor, um ein Tochterdiagramm der Gated Beads zu erstellen. Und dann die positiven und negativen Perlen getrennt voneinander gaten.

Überprüfen Sie die ausgewählte Tochterpopulation durch sukzessives Gating und Eliminierung von Ausreißern in jedem positiven und negativen Bruch. Laden Sie dann die negativen und positiven Gates in das Un-Mixing-Fenster hoch. Wählen Sie als Nächstes die ungefärbte Zellprobe in der Röhrchenliste aus und entwerfen Sie separate Gates für autofluoreszierende und nicht-autofluoreszierende Küvetten.

Sobald die negativen und positiven Gates für alle Parameter, einschließlich Autofluoreszenz und Viabilität, definiert sind, klicken Sie auf Berechnen. Nehmen Sie dann die Entmischung auf die analysierten Proben an. Um die Daten zu analysieren, gaten Sie die Zellen in einem Diagramm von SSC versus FSC und schließen Sie mit Propidiumiodid gefärbte tote Zellen aus.

Bestimmen Sie abschließend die Gates für alle Populationen von Interesse. Hier werden Ergebnisse der Durchflusszytometrie und der spektralen Zytometrie von Zellen vorgestellt, die aus dem fetalen Herzen isoliert und mit Anti-TER119-, Anti-CD45- und anti-Sca-1-Antikörpern gefärbt wurden. Eine Untergruppe von Autofluoreszenzzellen wurde mit zwei konventionellen Zytometern nachgewiesen, während diese Zellen in der spektralen Zytometrie nicht als autofluoreszierend definiert wurden und in der CD45 TER119 negativen Population enthalten waren.

Die Zellen, die durch konventionelle Durchflusszytometrie als autofluoreszierende, aber nicht als CD31-positive Zellen identifiziert wurden, wurden dann auf die Expression der für Kardiomyozyten spezifischen Transkripte analysiert. In der Population der autofluoreszierenden Zellen wurden hohe Konzentrationen von kardialem Troponin und atrialen Myozyten wie Zugtranskripten gefunden, was bestätigt, dass eine große Untergruppe der Kardiomyozyten in der konventionellen Durchflusszytometrie übersehen wird. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa acht Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig vorgeformt ist.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass alle Schritte auf Eis und rechtzeitig durchgeführt werden müssen, um sicherzustellen, dass die Zellen lebensfähig bleiben. Im Anschluss an dieses Verfahren können intrazelluläre Proteine und Analysen von zusätzlichen Oberflächenmarkern durchgeführt werden, um Fragen zu spezifischen molekularen Signalwegen zu beantworten. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Immunologie und Entwicklungs- oder Stammzellbiologie den Weg, seltene Populationen aus verschiedenen Organen zu erforschen und zu isolieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen aus zellulärem Gewebe isoliert und färbt und wie man die Expression von Oberflächenmarkern durch spektrale Durchflusszytometrie analysiert, die die durch die Autofluoreszenz von Zellen verursachten Einschränkungen überwindet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Propidiumiodid äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von PSA getroffen werden sollten.