Name: Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Lernen Sie die spektrale Durchflusszytometrie zur Analyse von Zellsuspensionen aus festen Geweben. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung von Fluorochromen und die separate Behandlung von Autofluoreszenz.

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Wir erkennen die technischen und theoretischen Beiträge in der spektralen Zytometrie von K. Futamura, die sich kritisch auch das Manuskript überarbeitet. Wir sind auch verpflichtet C. Ait-Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira und P. Pereira für kritisch Sicht des Manuskripts und für endlose technische Beratung und Unterstützung. Wir danken auch P. Pereira für das Geschenk der anti Vγ7-APC und Vδ4-Biotin markierten Antikörper. Wir aknowledge das Centre d&#39;Enseignements von Pasteur-Institut für freundliche und die Dreharbeiten Logistik unterstützen. Diese Arbeit wurde vom Pasteur-Institut, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) unterstützt; die SNF und Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para a Ciência ea Tecnologia - SFRH / BD / 74218/2010 (MV); und Université Paris Diderot, die Agence Nationale de la Recherche (ANR) Projekt Twothyme, die ANR und Programm REVIVE (Investition für die Zukunft) (AC).

<ol><li>Futamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+full-spectral+flow+cytometry+with+multiple+spectrally-adjacent+fluorescent+proteins+and+fluorochromes+and+visualization+of+in+vivo+cellular+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement.</a> Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).</li>
<li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+Cytometry+Has+Unique+Properties+Allowing+Multicolor+Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues.</a> PLoS One. 11 (8), e0159961(2016).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+FACS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter FACS analysis.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 5, Unit 5.8, (2002).</li>
<li>Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seventeen-colour+flow+cytometry%3A+unravelling+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).</li>
<li>Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-gamma+allele-specific+selection+of+V+gamma+1%2FV+delta+4+cells+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium.</a> J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).</li>
<li>Guy-Grand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin%2C+trafficking%2C+and+intraepithelial+fate+of+gut-tropic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells.</a> J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).</li>
<li>Lavoinne, A., Cauliez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BCardiac+troponin+I+and+T%3A+specific+biomarkers+of+cardiomyocyte%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Interne%22%5BJournal%5D)">[Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte].</a> Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).</li>
<li>Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+cardiomyocyte+behavior+reveals+two+distinct+steps+in+ventricular+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation.</a> Development. 141 (3), 585-593 (2014).</li>
<li>Beltrami, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+support+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration.</a> Cell. 114 (6), 763-776 (2003).</li>
<li>Keith, M. C., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22String+theory%22+of+c-kit%28pos%29+cardiac+cells%3A+a+new+paradigm+regarding+the+nature+of+these+cells+that+may+reconcile+apparently+discrepant+results%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">"String theory" of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results.</a> Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).</li>
<li>Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sca-1%2B+cardiac+progenitor+cells+and+heart-making%3A+a+critical+synopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis.</a> Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Herkömmliche FCM auf der Detektion von Photonen basierend emittieren nach Anregung von Fluoreszenzsonden. Die Fluoreszenzemission von einem Fluorochrom in einem Detektor erfaßt ausgelegt, das Signal von einem anderen Fluorochrom zu messen induziert physikalische Überlappung. Diese Spill-over zwischen Emissionsspektren muss durch Kompensationen korrigiert werden. Spectral FCM und Datenverarbeitung durch die Entmischung Entfaltungsalgorithmus erlaubt die Kombination von Fluorochromen mit engen...

In den letzten Jahrzehnten, Durchflusszytometrie (FCM) wurde Studien ein verbreitetes Analysemethode essentiell für Zell Phänotypisierung. Es wurde eine wesentliche Erhöhung der verfügbaren Fluoreszenzfarbstoffe waren, insbesondere durch den violetten Laser angeregt Fluorochrome (405 nm) (zB Brilliant Violet und neue Q-Punkt - Farbstoffe). Allerdings erhöht das Wachstum der verfügbaren Fluoreszenzfarbstoffe das Risiko von überlappenden Emissionen und erfordert arbeitsintensive Kompensations Matrizen. FCM wurde weit verbreitet Zellsuspensionen aus festem Gewebe zu analysieren, aber die Anwesenheit von auto-fluoreszierenden Zellen begrenzt die Diskriminierung von spezifisch markierten Populationen. Die Grundprinzipien der spektralen FCM werden ausführlich in Futamura et al. 1, 2. Kurz gesagt, hier verwendet, um die spektrale FCM (die Tabelle von Materialien sehen) ist mit 405, 488, und 638 nm-Laser ausgestattet. Die spektrale FCM erfasst alle emittierten fluorescence als Spektren in einem 32-Kanal-Linear-Array PMT (32CH PMT) für 500 nm bis 800 nm und 2 unabhängigen PMTs für 420 nm bis 440 nm und 450 nm bis 469 nm bzw. die die herkömmlichen Bandpassfilter ersetzt werden. Die 488 und die 405/638-nm-Laserspots sind räumlich voneinander getrennt, während die 405 nm und 638 nm Laserspots co-linear ist. Für jeden einzelnen Partikel, die spektralen FCM Maßnahmen bis zu 66 Kanäle von Fluoreszenzdaten angeregt durch die 405 nm und 488 nm Laser. Wenn Zellen durch den 638-nm-Laser angeregt werden, misst die spektrale FCM 58 Kanäle von Fluoreszenzdaten, da eine Maske, um den 638-nm-Laser von glänzenden in die PMT zu verhindern, eingeführt wird. Spectral FCM analysiert die erfassten Vollspektrumdaten mit einem Algorithmus auf der Grundlage der gewichteten Methode der kleinsten Quadrate (WLSM), die die Trennung von überlappenden Spektren Fluoreszenz ermöglicht. Spektren abgeleitet von single-gefärbten und ungefärbten Proben werden als Basisreferenzspektren erkannt. Multi-gefärbten Proben werden eine mathematisch ausgestattetUngemischt, und das Spektrum einer Probe mit gemischten fluoreszierenden Markierungen wird in eine Sammlung ihrer konstituierenden Spektren zerlegt. Die Entmischung in der Spektraltechnologie 3 , 4 ersetzt die Kompensation, die das Signal von allen Detektoren entfernt, mit Ausnahme derjenigen, die einen gegebenen Farbstoff mißt. In dieser Studie kombinierten und testeten wir 19 Fluorochrome in einer einzigen, 21-Parameter-Analyse, die die wichtigsten hämatopoetischen Teilmengen in der Maus Milz charakterisiert charakterisiert. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die spektrale Zytometrie das Auto-Fluoreszenz-Signal steuern kann, wodurch die Charakterisierung der intestinalen intraepithelialen Lymphozyten und des embryonalen Herzens verbessert wird. In diesen Geweben erlaubte das Auto-Fluoreszenz-Management die Zuordnung von spezifischer Fluoreszenz zu Zellen, die aus der Analyse in herkömmlichem FCM ausgeschlossen würden.

<table><tbody><tr><td>Mäuse</td><td>Janvier Labs</td><td>CD45.2</td><td>Quelle der Zellen</td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>Sterilisation</td></tr><tr><td>DPBS (Ca2+, Mg2+)</td><td>GIBCO ThermoFisher</td><td>14040-174</td><td>Embryonensammlung</td></tr><tr><td>Hanks' ausgewogene Salzlösung (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+)</td><td>GIBCO Life ThermoFisher</td><td>14025092</td><td>Dissoziations-, Aufschluss- und Färbelösungen</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-)</td><td>GIBCO Life ThermoFisher 14175095</td><td></td><td>Dissoziations-, Aufschluss- und Färbelösungen</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>Dissoziations-, Aufschluss- und Färbelösungen</td></tr><tr><td>Kollagenase</td><td>Sigma</td><td>C2139</td><td>Enzymatische Lösung</td></tr><tr><td>90 x 15 mm, Petrischalen für plastische Gewebekulturen.</td><td>TPP</td><td>T93100</td><td>Entnahme von Embryonen und Herzen</td></tr><tr><td>, 35 x 15 mm, Petrischalen aus Kunststoffgewebekultur.</td><td>TPP</td><td>T9340</td><td>Hearts collection</td></tr><tr><td>Feine Irisschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>Sezierwerkzeuge</td></tr><tr><td>Grobpinzette (Pinzette mit schmalem Muster, gebogen 12 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-12</td><td>Sezierwerkzeuge</td></tr><tr><td>Feine Pinzette (Dumont Nr. 7 Pinzette)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td>Sezierwerkzeuge</td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>VWR</td><td>21909-668</td><td>Präparierwerkzeuge</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 Präpariermikroskop</td><td>LEICA</td><td>MZ6 10445111</td><td>Probenahme; Okular W-Pl10x/23</td></tr><tr><td>Kaltlampenquelle</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 compact</td><td>Probenahme; Zwei an Schwanenhalsfasern</td></tr><tr><td>angepasste FACS-Röhrchen</td><td>VWR</td><td>60819-310</td><td>Aufschlusszellen</td></tr><tr><td>96 Well-Platte (runder Boden)</td><td>VWR</td><td>10861-564</td><td>Färbezellen</td></tr><tr><td>Nylonnetz-Verschraubungstuch sterilisiert, 50/50 mm Stücke.</td><td>SEFAR NITEX</td><td>SEFAR NITEX</td><td>Zellfiltration</td></tr><tr><td>UltrasComp eBeads</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmarkierte Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>Katalognummer siehe Tabelle unten</td><td>Färben von Zellen</td></tr></tbody></table>

analyse von zellsuspensionen isoliert von festen geweben von spectral flow cytometry

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Die Durchflusszytometrie wurde in den letzten 40 Jahre zu definieren und den Phänotyp der lymphatischen und anderen hämatopoetischen Zellen zu analysieren. Zunächst beschränkt sich auf die Analyse einiger Fluorochrome, derzeit gibt es Dutzende von unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen und bis zu 14 bis 18 verschiedene Farbstoffe können zu einer Zeit kombiniert werden. Beeinträchtigen jedoch mehrere Einschränkungen noch die analytischen Fähigkeiten. Aufgrund der Vielzahl von Fluoreszenzsonden, hat die Datenanalyse immer komplexer geworden aufgrund der Notwendigkeit von großen, multiparametrisches Kompensations Matrices. Außerdem mutierten Maus-Modelle fluoreszierende Proteine ​​tragen zu detektieren und zu spezifischen Zelltypen in verschiedenen Geweben Spuren verfügbar worden, so dass die Analyse (durch Durchflusszytometrie) von Auto-Fluoreszenz-Zellsuspensionen von festen Organen erhielten erforderlich ist. Durchflusszytometrie Spektral-, welche die Formen von Emissionsspektren entlang einer Vielzahl von kontinuierlichen Wellenlängen unterscheidet, werden einige dieser Probleme. Die Daten werden analysiert, with einen Algorithmus, die Kompensations Matrizen und behandelt Autofluoreszenz als unabhängigen Parameter ersetzt. Somit sollte spektraler Durchflusszytometrie Fluorochrome fähig sein mit ähnlichen Emissionspeaks des Unterscheidens und kann eine Multiparameteranalyse ohne Kompensations Anforderungen. Dieses Protokoll beschreibt die spektrale Analyse der Durchflusszytometrie, so dass für eine 21-Parameter (19 Fluoreszenzsonden) Charakterisierung und die Verwaltung eines Autofluoreszenzsignals, eine hohe Auflösung in kleinere Population Detektion bereitstellt. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die spektralen Durchflusszytometrie Vorteile bei der Analyse von Zellpopulationen aus Geweben schwierig präsentiert in herkömmlicher Durchflusszytometrie, wie Herz und Darm zu charakterisieren. Spectral Durchflusszytometrie so zeigt die Multiparameteranalysekapazität von hochleistungsfähigen Zytometrie herkömmlicher Strömung ohne das Erfordernis für Ausgleichs- und ermöglicht Autofluoreszenz-Management.

21-Parameter-Spektraldaten FCM Panel Splenozyten zu analysieren Abbildung 1 zeigt die erhaltenen Ergebnisse mit dem 19-fluoreszierendes-Antikörper - Panel Milz- Zellen angewendet, die verschiedene Antikörper Untergruppen von T, B, NK, dendritische und myeloiden Zellen zu erkennen, während alle hämatopoetischen CD45 kernhaltiger Zellen markiert. Die Platte enthält auch einen Lebensfähigkeitsfarbstoff (PI), sowie d...

Dieser Artikel beschreibt, spektrale Zytometrie, einen neuen Ansatz in der Durchflusszytometrie, die die Formen von Emissionsspektren verwendet Fluorochromen zu unterscheiden. Ein Algorithmus ersetzt Kompensationen und kann Auto-Fluoreszenz als unabhängigen Parameter behandeln. Dieser neue Ansatz ermöglicht die korrekte Analyse von soliden Organen isolierten Zellen.

Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Das übergeordnete Ziel dieser spektralen Zytometrie besteht darin, verschiedene Fluorochrome anhand ihrer vollständigen Emissionsspektren zu unterscheiden. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll die Nutzung der Autofluoreszenz als unabhängigen Parameter, wodurch eine korrekte Analyse von Zellen, die aus festen Organen isoliert wurden, erzielt werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Immunologie und Entwicklung der Stammzellbiologie zu beantworten, beispielsweise wie seltene Zellpopulationen identifiziert werden können.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in ihrer einzigartigen Fähigkeit, eine große Anzahl von Parametern gleichzeitig zu analysieren und die Autofluoreszenz fester Gewebe zu bewältigen. Obwohl diese Methode zur Herstellung einer Einzelzell-Suspension aus Darm und Herz verwendet wird, kann sie auch auf andere Organe angewendet werden, wie Lunge, Skelettmuskel, Leber, Fettgewebe und Niere. Beginnen Sie damit, den Dünndarm eines erwachsenen Mäuses zu isolieren und zu waschen.Danach das Gewebe auf ein Papiertuch legen und mit einer scharfen Schere vorsichtig die Peyer-Plaques entfernen. Den Darm durch eine Längsschnittöffnung öffnen und

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Biologie

Die Identifizierung von Gehirntumor initiierende Zellen (BTICs), die seltenen Zellen innerhalb einer heterogenen Tumor besitzt Stammzell-Eigenschaften, liefert neue Einblicke in das menschliche Gehirn Tumor Pathogenese. Wir haben spezifische Kulturbedingungen verfeinert für BTICs bereichern, und wir routinemäßig Durchflusszytometrie weiter bereichern diese Populationen. Selbsterneuerung Assays und Transkript Analyse durch einzelne Zelle RT-PCR kann anschließend auf diesen isolierten Zellen...

Verarbeitung von primären Hirntumoren Tissue für Stem Cell Assays und Flow Sortierung

Ein neuartiges Protokoll für die mechanische Aufbereitung von Hoden Zellsuspensionen von Nagetier Material, die Vermeidung Enzyme und Reinigungsmittel, beschrieben. Das Verfahren ist sehr einfach, schnell, reproduzierbar und macht gute Qualität Zellsuspensionen, die sich für Durchfluss Sortier-und RNA-Extraktion sind.

Einfache und effiziente Technik zur Herstellung von Hodenkrebs Zellsuspensionen

Wir bieten eine detaillierte Beschreibung eines Protokolls für die durchflusszytometrische Analyse von Oberflächenantigenen und/oder intrazellulären Antigenen in neuralen Zelltypen. Kritische Aspekte der Versuchsplanung, methodische Schritte und grundlegende Prinzipien der Durchflusszytometrie werden erläutert, um Neurobiologen in die Lage zu versetzen, diese leistungsstarke Technologie zu nutzen.

Flow Cytometry Protokolle für Oberflächen- und intrazelluläre Antigen Analysen Neuronale Zelltypen

Durchflusszytometrischen Analyse hat für die Untersuchung von Reinkulturen und Überwachung der mikrobiellen Gemeinschaft Dynamik bewährt. Wir präsentieren jeweils drei umfassende Arbeitsabläufe, von der Probenahme zur Datenanalyse, Reinkulturen und komplexen Gemeinschaften in klare Medium ebenso wie anspruchsvolle Matrizen.

Kennzeichnenden Microbiome Dynamik – Durchflusszytometrie basierten Workflows von Reinkulturen zu natürlichen Gemeinschaften

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um einzelne Zellen von murinen Thymus, Pankreas Entwässerung Lymphknoten und Milz, weiter zu studieren diese Zellen mittels Durchflusszytometrie vorzubereiten. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll verwendet zur Bestimmung der Teilmengen von regulatorischen T-Zellen mit Durchflusszytometrie.

Ermittlung der regulatorischen T Zelle Teilmengen in murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz mit Durchflusszytometrie

Vorgestellt wird eine komfortable, schnelle und kostengünstige Methode zur Messung des Anteils von Seitenpopulationszellen in soliden Tumorzelllinien.

Analyse der Seitenpopulation in soliden Tumorzelllinien

Die Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie kann wesentlich zum Verständnis des Musters der Immunantwort gegen Implantate beitragen. In dieser Arbeit wird eine präzise Methode zur Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Färbung für die durchflusszytometrische Analyse beschrieben.

Hochdimensionale Durchflusszytometrie zur Immunfunktionsanalyse von präpariertem Implantatgewebe

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Dissoziation von Sputum in eine einzelne Zellsuspension und die anschließende Charakterisierung zellulärer Untergruppen auf Standard-Durchflusszytometrieplattformen.

Qualitätskontrollierte Sputumanalyse mittels Durchflusszytometrie

Distanziert Zellen aus bestimmten Gewebearten erfordert spezifische Parameter für Gewebe aggitation zu einem hohen Volumen von lebensfähigen, kultivierbaren Zellen zu erhalten. Die Miltenyi gentleMACS Dissociator optimiert diese Aufgabe mit einem einfachen, praktischen Protokoll. In dieser Veröffentlichung wird die Verwendung dieser Vorrichtung auf nerual Gewebe erklärt.

Generierung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Nervengewebe

Die IP-FCM-Methode vorgestellt, die eine sensible, robust, biochemische Beurteilung der nativen Protein-Protein-Interaktionen ermöglicht, ohne dass Gentechnik oder große Stichproben.

IP-FCM: Immunpräzipitation mittels Durchflusszytometrie Detected

Lernen Sie die spektrale Durchflusszytometrie zur Analyse von Zellsuspensionen aus festen Geweben. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung von Fluorochromen und die separate Behandlung von Autofluoreszenz.

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