Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry

Das übergeordnete Ziel dieser spektralen Zytometrie besteht darin, verschiedene Fluorochrome anhand ihrer vollständigen Emissionsspektren zu unterscheiden. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll die Nutzung der Autofluoreszenz als unabhängigen Parameter, wodurch eine korrekte Analyse von Zellen, die aus festen Organen isoliert wurden, erzielt werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Immunologie und Entwicklung der Stammzellbiologie zu beantworten, beispielsweise wie seltene Zellpopulationen identifiziert werden können.

Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in ihrer einzigartigen Fähigkeit, eine große Anzahl von Parametern gleichzeitig zu analysieren und die Autofluoreszenz fester Gewebe zu bewältigen. Obwohl diese Methode zur Herstellung einer Einzelzell-Suspension aus Darm und Herz verwendet wird, kann sie auch auf andere Organe angewendet werden, wie Lunge, Skelettmuskel, Leber, Fettgewebe und Niere. Beginnen Sie damit, den Dünndarm eines erwachsenen Mäuses zu isolieren und zu waschen.

Danach das Gewebe auf ein Papiertuch legen und mit einer scharfen Schere vorsichtig die Peyer-Plaques entfernen. Den Darm durch eine Längsschnittöffnung öffnen und in etwa ein Zentimeter lange Stücke schneiden. Anschließend das Gewebe in einen Becher mit 30 Milliliter HBSS, ergänzt durch zehn Prozent FCS, überführen und bei 37 Grad Celsius unter ständigem Rühren 30 Minuten lang inkubieren.

Nach Beendigung der Inkubation die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Kunststoffröhrchen überführen und fünf Minuten lang kräftig vortexen. Anschließend die Suspension zehn Minuten lang auf Eis inkubieren, um die Sedimentation großer, nicht dissoziierter Fragmente zu ermöglichen. Danach das Überstandsvolumen in ein neues Röhrchen übertragen und die Zellen sieben Minuten lang bei 120 × g zentrifugieren.

Nachdem die Zellen pelletiert wurden, resuspendieren wir sie in zehn Milliliter eines einprozentigen FCS in HBSS und zählen sie mithilfe einer Neubauer-Kammer. Vor der Zellfärbung überführen Sie 1 × 10⁶ Darmzellen in ein fünf Milliliter fassendes Röhrchen, um eine negative Kontrolle vorzubereiten. Um eine Probe vorzubereiten, geben Sie 1 × 10⁶ Darmzellen gefolgt von zwei Milliliter HBSS mit einprozentigem FCS in ein neues fünf Milliliter fassendes Röhrchen und zentrifugieren die Suspension bei 120 × g, bei vier Grad Celsius, fünf Minuten lang.

Nach dem Verwerfen des Überstandes suspendieren wir die Zellen in 50 Mikrolitern der Antikörperlösung. Wickeln Sie das Röhrchen in Aluminiumfolie ein und inkubieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, geben Sie zwei Milliliter einprozentiges FCS in HBSS zur Probe hinzu und zentrifugieren sie bei 120 × g, vier Grad Celsius, für fünf Minuten.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern einer Lösung mit 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumjodid. Nachdem Sie einem Mausembryo den Kopf abgetrennt haben, legen Sie seinen Körper in eine Petrischale, die mit einem vorfeuchten Papiertuch ausgelegt und mit 50 Milliliter einer einprozentigen FCS-Lösung in HBSS gefüllt ist. Nehmen Sie unter einem Stereomikroskop einen Schnitt an der rechten Seite des Brustkorbs des Embryos vor und öffnen Sie vorsichtig den Thorax, wobei Sie vermeiden, das Herz zu beschädigen.

Fassen Sie die großen Gefäße und ziehen Sie das mit Lunge und Thymus verbundene Herz heraus. Überführen Sie die Organe in eine 35-Milliliter-Petri-Schale, die mit zwei Millilitern eines einprozentigen FCS in HBSS gefüllt ist. Isolieren Sie dann das Herz von den umgebenden Organen und dem Bindegewebe.

Nach dem Waschen des Herzens wird dieses in ein Milliliter vorgewärmte enzymatische Lösung gegeben und unter einem Stereomikroskop mit feiner Pinzette und einem Skalpell in Stücke von einem Kubikmillimeter zerkleinert. Fügen Sie eine zusätzliche Milliliter vorgewärmte enzymatische Lösung hinzu und überführen Sie das fragmentierte Gewebe in ein verschließbares Fünf-Milliliter-Röhrchen. Inkubieren Sie die Probe in horizontaler Position bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten.

Nach Abschluss der Inkubation wird das Gewebe homogenisiert, indem die Suspension mehrfach mit einer P1000-Pipette auf- und abpipettiert wird. Anschließend werden die Proben, senkrecht stehend, so lange beiseitegestellt, bis sich die Fragmente des undigierten Gewebes abgesetzt haben. Der Überstand wird in einen 50-Milliliter-Probengefäß überführt.

Geben Sie zwei Milliliter zehnprozentiges FCS in HBSS hinzu und stellen Sie die isolierten Zellen auf Eis. Fügen Sie anschließend zwei Milliliter vorgewärmte enzymatische Lösung in das Fünf-Milliliter-Röhrchen mit dem Sediment aus undigiertem Gewebe hinzu und setzen Sie die Gewebeverdauung wie zuvor gezeigt fort, bis kein Gewebe mehr sichtbar ist. Zentrifugieren Sie die erhaltene Zellsuspension bei 120 × g für zehn Minuten.

Entfernen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter eines einprozentigen FCS in HBSS, frei von Calcium- und Magnesiumkationen. Um die Herzzellen zu färben, überführen Sie 200 Mikroliter der Zellsuspension in die Vertiefungen einer Rundboden-96-Well-Platte. Zentrifugieren Sie die Platte bei 480 × g für eine Minute und entfernen Sie den Überstand.

Als Nächstes resuspendieren Sie die Herzzellen in 100 Mikroliter der Antikörperlösung. Wickeln Sie die Platte in Aluminiumfolie ein und inkubieren Sie sie bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Nach Abschluss der Inkubation waschen Sie die Herzzellen mit 200 Mikroliter einer einprozentigen FCS-Lösung in kalzium- und magnesiumfreiem HBSS und zentrifugieren die Suspension bei 480 ×g für eine Minute.

Anschließend die Zellen in 200 Mikroliter eines einprozentigen FCS in HBSS, frei von Calcium- und Magnesiumionen, resuspendieren und die Suspension in ein fünf Milliliter fassendes Röhrchen überführen, das vorab mit 200 Mikroliter eines einprozentigen FCS in calcium- und magnesiumfreiem HBSS befüllt wurde. Schließlich 400 Mikroliter eines einprozentigen FCS in HBSS, frei von Calcium- und Magnesiumkationen, zugeben, das 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumiodid enthält, und die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Nylon-Mesh filtern. Zum Visualisieren der Zellen die angefärbte Probe in einen Durchflusszytometer laden, auf „Vorschau“ klicken und anschließend bis zu zwei mal zehn hoch sechs Ereignisse in der Probe erfassen, indem auf „Erfassen“ geklickt wird.

Öffnen Sie im Analyse-Tab das Farbpalette-Fenster und registrieren Sie alle untersuchten Parameter, indem Sie das Fluorochrom zusammen mit dem entsprechenden Marker hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass Autofluoreszenz- und Vitalitätsparameter eingeschlossen sind. Analysieren Sie im Kontrollfenster innerhalb der Röhrenliste die erste einfach angefärbte Probe, die Kompensationsperlen enthält.

Klicken Sie anschließend im Arbeitsblatt auf das Polygon-Design-Werkzeug und umschließen Sie die Bead-Population im FSC-SSC-Diagramm. Doppelklicken Sie auf das Gate, um ein Tochterdiagramm der selektierten Beads zu erstellen. Anschließend werden positive und negative Beads separat gegated.

Überprüfen Sie die ausgewählte Tochterpopulation durch schrittweises Gating und Ausschluss von Ausreißern in jedem positiven und negativen Anteil. Laden Sie anschließend die negativen und positiven Gates im Entmischungsfenster hoch. Wählen Sie danach die nicht angefärbte Zellprobe in der Röhrenliste aus und erstellen Sie separate Gates für autofluoreszierende und nicht-autofluoreszierende Zellen.

Nachdem die negativen und positiven Tore für alle Parameter, einschließlich Autofluoreszenz und Vitalität, definiert wurden, klicken Sie auf „Berechnen“. Anschließend wenden Sie die Entmischung auf die analysierten Proben an. Zur Datenanalyse werden die Zellen in einem Plot von SSC gegen FSC selektiert und die mit Propidiumiodid gefärbten toten Zellen ausgeschlossen.

Bestimmen Sie abschließend die Gates für alle Populationen von Interesse. Dargestellt sind hier die Ergebnisse von Durchflusszytometrie- und spektraler Zytometrie-Analysen der aus dem fötalen Herzen isolierten Zellen, die mit Antikörpern gegen TER119, CD45 und Sca-1 gefärbt wurden. Eine Teilmenge autofluoreszierender Zellen wurde von zwei herkömmlichen Zytometern erfasst, während diese Zellen in der spektralen Zytometrie nicht als autofluoreszierend identifiziert wurden und zur CD45-TER119-negativen Population gehörten.

Die durch konventionelle Durchflusszytometrie als autofluoreszierend identifizierten, aber nicht CD31-positiven Zellen wurden anschließend auf die Expression von Transkripten untersucht, die spezifisch für Kardiomyozyten sind. Hohe Konzentrationen an cardialem Troponin und Transkripten, die atrialen Myozyten ähneln, wurden in der Population autofluoreszierender Zellen nachgewiesen, was bestätigt, dass ein großer Teil der Kardiomyozyten bei der konventionellen Durchflusszytometrie übersehen wird. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in etwa acht Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass alle Schritte auf Eis und zügig durchgeführt werden müssen, um sicherzustellen, dass die Zellen lebensfähig bleiben. Im Anschluss an dieses Verfahren können intrazelluläre Proteine untersucht und zusätzliche Oberflächenmarker analysiert werden, um Fragen zu spezifischen molekularen Signalwegen zu beantworten. Diese Technik ebnete den Weg für Forschende im Bereich der Immunologie sowie der Entwicklungs- oder Stammzellbiologie, seltene Zellpopulationen aus verschiedenen Organen zu untersuchen und zu isolieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen aus Zellgeweben isoliert und einfärbt und wie man die Expression von Oberflächenmarkern mittels spektraler Durchflusszytometrie analysiert, wodurch die Einschränkungen durch Autofluoreszenz der Zellen überwunden werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Propidiumiodid äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von PSA, wenn Sie dieses Verfahren durchführen.