Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine nichtnukleäre Fraktion zu erhalten, die mit Replikationskompartimenten angereichert ist, die in Adenovirus-infizierten Zellen gebildet werden, um deren Zusammensetzung, Ultrastruktur und damit verbundene Aktivitäten detailliert zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der DNA-Virologie zu beantworten, wie z. B. die Untersuchung molekularer Mechanismen, die die Replikation und Expression des viralen Genoms steuern, die wiederum von Replikationskompartimenten für die Regulierung von Virus-Wirtszell-Interaktionen abhängen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um ein einfaches Verfahren handelt, das auf dem Geschwindigkeitsgradienten basiert, um ein zellfreies System zu etablieren, das sich für die Untersuchung der Mechanismen eignet, die es nuklear replizierenden DNA-Viren ermöglichen, die Kontrolle über die infizierte Zelle zu übernehmen.

Um diesen Assay durchzuführen, bereiten Sie zunächst das Adenovirus Typ 5 oder ein D fünf und menschliche Vorhautfibroblasten oder HFF vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, vor, um mit der Infektion von 10 bis zum siebten HFF in 100-Millimeter-Gewebekulturschalen unter Verwendung eines Milliliters 85 und DMM pro Schale bei einem MOI von 30 fokusbildenden Einheiten oder FFU pro Zelle zu beginnen, inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden lang in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Schütteln Sie die Schalen alle 15 Minuten vorsichtig, um eine homogene Verteilung des Virusinokulums über die Zellen zu gewährleisten. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und fügen Sie frisches DMEM hinzu.

Ergänzt mit 10% FBS inkubieren Sie die Zellen dann 16, 24 oder 36 Stunden lang mit einem Zellschaber. Ernten Sie die infizierten und kontrollierten Zellen nach der Infektion schonend und sammeln Sie die Zellsuspension in sterilen Zentrifugenröhrchen auf Eis. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Kammer und zentrifugieren Sie die Zellen dann fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 220 mal G.

Als nächstes wird das Zellpellet in fünf Millilitern eiskalter PBS-Zentrifuge resuspendiert und die Zellen dreimal in fünf Millilitern eiskaltem PBS gewaschen, wobei die Waschüberstände verworfen werden, um die Zellen zu läusieren. Reanimation, suspendieren Sie das Zellpellet in 700 Mikrolitern eiskaltem hypotonischem Puffer mit Proteaseinhibitoren und lassen Sie die Zellen drei Stunden lang auf Eis aufquellen. Homogenisieren Sie die Zellen mit einem Teflonstößel vom Typ A mit 10 bis 20 Abwärtshüben.

Überprüfen Sie das Lysat regelmäßig alle 20 Züge unter dem Mikroskop, um die Zelllyse zu überwachen. Wiederholen Sie den Vorgang für etwa 80 Schläge, bis alle Zellen erfolgreich aufgebrochen sind. Anschließend zentrifugieren Sie das Homogenat bei 300 mal G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.

Lagern Sie den Überstand bei minus 20 Grad Celsius in einem Röhrchen als zytoplasmatische Fraktion, um zelluläre Trümmer aus den Nuclei reus zu entfernen. Das Pellet wird in 750 Mikrolitern 0,25 molare Saccharoselösung, eine Pipette, 750 Mikroliter 0,35 molare Saccharoselösung, zwei in einem Zentrifugenröhrchen suspendiert und das resuspendierte Homogenat vorsichtig über die zweite Lösung gelegt. Drehen Sie das Saccharosekissen bei 1400 mal G bei vier Grad Celsius fünf Minuten lang und entsorgen Sie dann den Überstand.

Suspendieren Sie das Pellet in 750 Mikrolitern Lösung zwei gegen Läuse. Die Kerne beschallen die Kernsuspension in einem Ultraschallbad, das in zwei fünfminütigen Impulsen auf oder unter vier Grad Celsius gehalten wird. Überprüfen Sie die Kernlyse unter einem Hellfeldmikroskop zwischen den Pulsen und beschallen Sie weiter, bis die Kerne vollständig liegen.

Als nächstes pipettieren Sie 750 Mikroliter 0,88 molare Saccharoselösung drei in ein Zentrifugenröhrchen, schichten die Kernlysatlösung über Lösung drei. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 3000 mal G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Bei den genannten 1,5 Millilitern S handelt es sich um die nukleoplasmatische Fraktion, die bei minus 70 Grad Celsius gelagert wird.

Dann resuspendieren Sie das Pellet in 700 Mikrolitern Lösung zwei. Dabei handelt es sich um die 85-Replikationskompartiment-Fraktion (RCF) des Wirtskerns, die ebenfalls bei minus 70 Grad Celsius gelagert wird. Um mit der Immunfluoreszenzanalyse zu beginnen, geben Sie einen Tropfen von fünf Mikrolitern des RCF auf einen mit Kochsalzlösung beschichteten Objektträger.

Lass die Tropfen an der Luft bei Raumtemperatur trocknen. Geben Sie dann 500 Mikroliter PBS in einem Tropfen neben den Spot und kippen Sie den Schieber, um das PBS über den Spot fließen zu lassen. Lassen Sie das PBS aus der Rutsche ab.

Blockieren Sie anschließend die Probenstelle mit 500 Mikrolitern PBS mit 5 % Rinderserumalbumin für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Um die überschüssige Blockierungslösung zu entfernen, geben Sie 500 Mikroliter PBS vorsichtig zu der auf dem Objektträger entdeckten Probe, ohne direkt auf die Probe zu pipettieren. Führen Sie die Wäsche dreimal durch.

Als nächstes fügen Sie 20 Mikroliter verdünnten Primärantikörper gegen das virale E zwei A DNA-Bindungsprotein auf den Probenspot hinzu. Decken Sie den Objektträger ab, um Verdunstung zu vermeiden, und inkubieren Sie ihn zwei Stunden lang in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur. Waschen Sie nun die Probe dreimal vorsichtig mit PBS mit 0,02 % Tween 20.

Vermeiden Sie es, nach diesen Waschgängen direkt auf die Probe zu pipettieren. Geben Sie 20 Mikroliter Fluoro-Sekundärantikörper mit vier gekoppelten Mäusen direkt auf die Probe und inkubieren Sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Geben Sie in einer befeuchteten Kammer 500 Mikroliter PBS mit 0,02 % Tween 20 zu den Objektträgern, wobei ein direktes Pipettieren auf die Probe vermieden wird.

Geben Sie dann zwei Mikroliter Einbettlösung hinzu und drehen Sie einen Deckschirm über die Probe. Versiegeln Sie die Seiten der Deckgläser mit Nagellack. Betrachten Sie den Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem 63-fach-Objektiv bei der gewünschten Wellenlänge, spezifisch für das verwendete Fluor four, ein Ergebnis der Immunfluoreszenz des adenoviralen E zwei A DNA-bindenden Proteins oder DBP, ist hier dargestellt.

Die DBP-haltigen Strukturen sind subnukleäre virale rc, beachten Sie, dass das E two A DBP innerhalb des RC lokalisiert ist und grün erscheint. Zusätzlich wurde die Anreicherung der viralen DNA in der RCF durch PCR bestätigt, bei der die RCF mit der Nukleoplasmafraktion (NPL) 24 und 36 Stunden nach der Infektion verglichen wurde. Die virale GNA wurde selektiv in der RCF und nicht in der NPL-Beratung gefunden.

Der Begleittext für zusätzliche Nachweise von adenoviraler MNA in der RCF: Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in sechs Minuten von der Ernte der infizierten Zellen bis zur Isolierung der RCF durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Proben immer auf Eis zu halten und die Homogenisierungsschritte des Kerns, der Isolierung, der Beschallung und der Isolierung der subnuklearen Fraktion durch Hellfeldmikroskopie zu überwachen. Befolgen Sie dieses Verfahren.

Andere Methoden wie R-T-P-C-R und Transmissionselektronenmikroskopie können durchgeführt werden, um die Regulation der viralen Genexpression in Verbindung mit den viralen Replikationskompartimenten und der Ultrastruktur dieser Partikel zu untersuchen. Diese Technik hat das Potenzial, Forschern auf dem Gebiet der DNA-Tumorvirologie den Weg zu ebnen, um molekulare Mechanismen zu erforschen, die die Regulation des Zellzyklus verändern und die Virusreplikation in menschlichen Zellen fördern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie virale Replikationskompartimente aus infizierten Zellkernen isoliert werden können, um morphologische, funktionelle und zusammengesetzte Studien dieser virusinduzierten Strukturen durchzuführen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem SAN-Indikator gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Perkussionen wie das Tragen von Ohrmündern getroffen werden sollten.