Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine nichtnukleäre Fraktion anzureichern, die Replikationskompartimente aus adenovirusinfizierten Zellen enthält, um deren Zusammensetzung, Ultrastruktur und assoziierte Aktivitäten detailliert untersuchen zu können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der DNA-Virologie zu klären, beispielsweise die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die die virale Genomreplikation und -expression steuern und wiederum von den Replikationskompartimenten zur Regulation der Wechselwirkungen zwischen Virus und Wirtszelle abhängen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass es sich um ein einfaches Verfahren auf Basis eines Geschwindigkeitsgradienten handelt, mit dem ein zellfreies System etabliert wird, das gut geeignet ist, die Mechanismen zu untersuchen, durch die nukleär replizierende DNA-Viren die Kontrolle über die infizierte Zelle übernehmen.

Um diesen Assay durchzuführen, bereiten Sie zunächst Adenovirus Typ 5 oder D5 und humane Foreskin-Fibroblasten (HFF) gemäß dem begleitenden textlichen Protokoll vor. Infizieren Sie 10^7 HFF in 100-mm-Zellkulturschalen mit je einem Milliliter 85 % DMM pro Schale bei einem Multiplizität der Infektion (MOI) von 30 fokusbildenden Einheiten (FFU) pro Zelle. Inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden lang in einem befeuchteten Zellkulturinkubator bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid, wobei die Schalen alle 15 Minuten vorsichtig geschwenkt werden, um eine homogene Verteilung des Virusinokulums über die Zellen zu gewährleisten. Nach der Inkubation entfernen Sie das Medium und geben frisches DMEM hinzu.

Die Zellen mit 10 % FBS versetzen und anschließend 16, 24 oder 36 Stunden inkubieren, wobei ein Zellabstreifer verwendet wird. Die infizierten und Kontrollzellen vorsichtig nach der Infektion gewinnen und die Zellsuspension in sterilen Zentrifugenröhrchen auf Eis sammeln. Die Zellen mit einer Neubauer-Kammer zählen und anschließend bei 220 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.

Als Nächstes das Zellpellet in fünf Milliliter eiskalter PBS resuspendieren, die Zellen dreimal in fünf Milliliter eiskalter PBS waschen und die Waschüberstände verwerfen, um die Zellen zu lysieren. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 700 Mikroliter eiskalter hypotonischer Pufferlösung mit Proteaseinhibitoren und lassen Sie die Zellen auf Eis für drei Stunden anschwellen. Homogenisieren Sie die Zellen mit einem Teflon-Stößel des Typs A durch 10 bis 20 Auf-und-ab-Bewegungen.

Überprüfen Sie das Lysat unter dem Mikroskop regelmäßig alle 20 Stöße, um die Zelllyse zu überwachen. Wiederholen Sie den Vorgang etwa 80-mal, bis alle Zellen erfolgreich aufgebrochen sind. Anschließend zentrifugieren Sie das Homogenat bei 300 mal G und vier Grad Celsius für fünf Minuten.

Den Überstand bei minus 20 Grad Celsius in einem Gefäß als cytoplasmatische Fraktion aufbewahren, um zellulären Debris von den Kernen zu trennen. Den Pellet in 750 µL 0,25 molarer Saccharoslösung suspendieren und 750 µL 0,35 molarer Saccharoslösung zwei in einem Zentrifugenröhrchen geben; anschließend das resuspendierte Homogenat vorsichtig über Lösung zwei schichten. Die Saccharoskissen-Zentrifugation bei 1400 × g und 4 °C fünf Minuten lang durchführen und danach den Überstand verwerfen.

Suspendieren Sie das Pellet in 750 µL Lösung zwei zur Zerstörung der Zellen. Sonifizieren Sie die nukleäre Suspension in einem Ultraschallbad, das bei oder unter vier Grad Celsius gehalten wird, mit zwei Impulsen zu je fünf Minuten. Überprüfen Sie die nukleäre Lyse zwischen den Impulsen am Lichtmikroskop und sonifizieren Sie weiter, bis die Kerne vollständig lysiert sind.

Anschießend pipettieren Sie 750 Mikroliter der 0,88 molaren Saccharoselösung drei in ein Zentrifagenröhrchen und schichten die nukleäre Lysetlösung vorsichtig über Lösung drei. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 3000 × g und 4 °C für 10 Minuten. Das 1,5-Milliliter-Schicht wird als nukleoplasmatische Fraktion bezeichnet und bei −70 °C aufbewahrt.

Suspenderen Sie das Pellet anschließend in 700 µL Lösung zwei. Dies ist die 85-Replikationskompartiment-Fraktion oder RCF des Wirtskerns, die ebenfalls bei minus 70 Grad Celsius gelagert wird. Beginnen Sie die Immunfluoreszenzanalyse, indem Sie einen Tropfen von fünf µL der RCF auf einen mit Salin beschichteten Objektträger geben.

Lassen Sie den Tropfen bei Raumtemperatur trocknen. Geben Sie dann 500 Mikroliter PBS als Tropfen neben die Stelle und kippen Sie den Objektträger, um PBS über die Stelle fließen zu lassen. Entfernen Sie das PBS vom Objektträger.

Blockieren Sie anschließend die Probenstelle mit 500 µL PBS, der 5 % Rinderserumalbumin enthält, zwei Stunden bei Raumtemperatur. Um überschüssige Blockierungslösung zu entfernen, geben Sie vorsichtig 500 µL PBS zur auf dem Objektträger aufgetragenen Probe, ohne direkt auf die Probe aufzupipettieren. Führen Sie die Wäsche dreimal durch.

Fügen Sie als Nächstes 20 µL verdünnter primärer Antikörper gegen das virale E2A-DNA-Bindungsprotein auf die Probenstelle hinzu. Decken Sie den Objektträger ab, um Verdunstung zu vermeiden, und inkubieren Sie ihn zwei Stunden bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer. Waschen Sie die Probe nun dreimal vorsichtig mit PBS, der 0,02 % Tween 20 enthält.

Vermeiden Sie es, nach diesen Waschschritten direkt auf die Probe zu pipettieren. Geben Sie 20 Mikroliter fluoro-gekoppeltes sekundäres Antikörper-Konjugat der Maus direkt auf die Probe, inkubieren Sie eine Stunde bei vier Grad Celsius. In einer befeuchteten Kammer geben Sie 500 Mikroliter PBS mit 0,02 % Tween 20 auf die Objektträger, wobei erneut vermieden werden sollte, direkt auf die Probe zu pipettieren.

Dann zwei Mikroliter Eindecklösung hinzufügen und eine Deckglas über die Probe stülpen. Die Ränder der Deckgläser mit Nagellack versiegeln. Die Probe unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einer 63x-Objektivlinse bei der gewünschten Wellenlänge, die spezifisch für den verwendeten Fluorophor ist, betrachten. Ein Ergebnis der Immunfluoreszenz von adenoviralem E2A-DNA-Bindungsprotein oder DBP wird hier gezeigt.

Die DBP-haltigen Strukturen sind subnukleäre virale Replikationskomplexe; beachten Sie, dass die E2A-DBP innerhalb des Replikationskomplexes lokalisiert ist und grün erscheint. Zusätzlich wurde eine Anreicherung viraler DNA im RCF durch PCR bestätigt, bei der der RCF mit der nucleoplasmatischen Fraktion (NPL) 24 und 36 Stunden nach der Infektion verglichen wurde. Die virale DNA wurde selektiv im RCF und nicht in der NPL nachgewiesen.

Der begleitende Text enthält zusätzliche Nachweise für adenovirale MNA im RCF. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in sechs durchgeführt werden, von der Zeitpunkt, zu dem infizierte Zellen geerntet werden, bis zur Isolierung des RCF, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, stets daran zu denken, die Proben auf Eis zu halten und die Schritte der Homogenisierung, Nukleolisierung, Isolierung, Beschallung und Isolierung der subnukleären Fraktion mittels Hellfeldmikroskopie zu überwachen. Nach diesem Verfahren.

Andere Methoden wie R-T-P-C-R und die Transmissionselektronenmikroskopie können durchgeführt werden, um die Regulation der viralen Genexpression, die mit den viralen Replikationskompartimenten assoziiert ist, sowie die Ultrastruktur dieser Partikel zu untersuchen. Diese Technik könnte es Forschern auf dem Gebiet der DNA-Tumorvirologie ermöglichen, molekulare Mechanismen zu erforschen, die die Regulation des Zellzyklus verändern und die virale Replikation in menschlichen Zellen fördern. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man virale Replikationskompartimente aus infizierten Zellkernen isoliert, um morphologische, funktionelle und zusammensetzungsbezogene Untersuchungen dieser virusinduzierten Strukturen durchzuführen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem SAN-Indikator gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Gehörschutz sollten stets beachtet werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.