Name: Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung viraler Replikationskompartimente aus Adenovirus-infizierten menschlichen Zellen mittels Geschwindigkeitsgradient. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung viraler Genomreplikation.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) und Promep-SEP für R.A.G.; P.H. erhielt ein Stipendium von CONACyT (447442).

1. HFF Zellkultur und Ad-Infektion <ol><li> Ausbreiten Ad5 Virus in Monoschichten von HEK-293 Zellen und Titer als fluoreszierende bildenden Einheiten (FFU) auf HFF-Zellen, wie zuvor. 8 beschrieben </li><li> Wachsen Menschliche Vorhautfibroblasten (HFF) in 10 ml DMEM / 10% fötales Rinderserum (FBS) in sterile Kulturschalen von 100 mm bei 37 ° C und 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator. Bestimmen Sie die Zellzahl unter Verwendung einer Neubauer Kammer durch Zählen der Zellen in den vier 16-Quadratmeter-Sets. Die Zellzahl pro ml wird durch Berechnen der Anzahl der Zellen in den vier 16-Quadrat-Sets und Multiplizieren dieser Zahl mit 10 4 erhalten. Für jeden Zeit nach der Infektion in Schritt 1.3 verwendet, so führen 1 x 10 7 HFF-Zellen. </li><li> Mock-Infektion oder infizieren HFF-Zellen mit Adenovirus Typ 5 (Ad5) Wildtyp (WT) (H5pg4100 8) in 100 mm Gewebekulturschalen mit 1 ml von Ad5 in DMEM pro Schale bei einer MOI von 30 Fokus Erzeugungseinheit oder FFU pro Zelle. Inkubieren für 2 Stunden in ahumidified Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2, sorgfältig rockt die Gerichte alle 15 Minuten, um eine homogene Verteilung des Virusinokulum über die Zellen zu gewährleisten. Nach dieser Zeit, entfernen Sie das Medium und fügen Sie frisches DMEM mit 10% FBS und Inkubation für 16, 24 oder 36 Stunden in einem befeuchteten Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. Fahren Sie mit Schritt 2.1. </li></ol> 2. Herstellung von Sub-Kern Fraktionen mit Adenovirus RC Angereichert <ol><li> Ernte-Ad5-infizierte oder scheininfizierte HFF-Zellen mit einem Zell scrapper und sammeln die Zellen in sterile Zentrifugenröhrchen. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen, wie in Schritt 1.2. Verwenden 1 x 10 7 Zellen für jede Zeit nach der Infektion in Schritt 1.3 angegeben. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 220 × g, 4 ° C für 5 min. </li><li> Zellpellet in eiskaltem PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 und 1,8 mM KH 2 PO 4). Wash Zellpellets 3 mal mit 5 ml eiskaltem PBS pro Waschgang. Zu diesem Zweck Zentrifuge die Zellen bei 220 × g, 4 ° C für 5 min, dekantieren und den Überstand verwerfen (SN) und Zellpellet durch vorsichtiges Pipettieren. </li><li> An der Plasmamembran zu stören, Zellpellet in 700 ul eiskaltem hypotonischen Puffer (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,5 mM DTT, 20 μ g / ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) eine Mischung aus Cystein, Serin, Threonin und Aspartylproteasehemmstoffen einschließlich 10 μ g / ml Rinderpankreas-Trypsininhibitor, 10 μ g / ml Pepstatin A und 10 μ g / ml N-Acetyl-L-Leucyl-L-Leucyl-L -argininal) und lassen Sie die Zellen schwellen auf Eis für 3 Stunden. </li><li> Lyse der Zellen unter Verwendung eines Homogenisators mit einem locker sitzende A-Typ Teflonpistill. Führen Sie 80 Dounce Schlaganfälle und Monitorproben alle 20 Hübe von Hellfeld-Mikroskopie, um sicherzustellen, dass alle Zellen lysiert worden sind, aber das Kerne not beschädigt oder zerrissen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellhomogenat bei 300 × g, 4 ° C für 5 min. Lagern Sie den SN als cytoplasmatische Fraktion bei -20 ºC in einem Zentrifugenröhrchen. </li><li> Um Zelltrümmer aus Keimen in 750 μ l der Lösung 1 (S1) (zu entfernen, das Pellet 0,25 M Saccharose, 10 mM MgCl 2 20 μ g / ml PMSF, eine Mischung aus Cystein, Serin, Threonin und Aspartyl-Protease-Inhibitoren einschließlich 10 μ g / ml Rinderpankreas-Trypsininhibitor, 10 μ g / ml Pepstatin A und 10 μ g / ml N-Acetyl-L-Leucyl-L-Leucyl-L-argininal) und die Schicht über ein gleiches Volumen der Lösung 2 (S2) (0,35 M Saccharose, 0,5 mM MgCl 2, 20 μ g / ml PMSF, eine Mischung aus Cystein, Serin, Threonin und Aspartyl-Protease-Inhibitoren einschließlich 10 μ g / ml Rinderpankreas-Trypsininhibitor, 10 μ g / ml Pepstatin A und 10 μ g / ml N-Acetyl-L-Leucyl-L-Leucyl-L-argininal). Centrifuge bei 1.400 × g, 4 ° C für 5 min. </li><li> Entsorgen Sie die SN mit einer Mikropipette. Vermeiden Sie das Pellet aufzurühren. </li><li> Das Pellet enthält isolierten Zellkernen in 750 μ l S2. </li><li> Um subnuclear Fraktionen mit Adenovirus RC (RCF) angereichert zu isolieren, beschallen resuspendiert Kerne mit einem Ultraschallbad, mit Hilfe von zwei 5 min Impulse, oder bis alle Kerne werden lysiert, wie durch Hellfeldmikroskopie beobachtet. Gebraucheissätze in Ultraschallbad wie notwendig, um Proben, die bei oder unter 4 ° C zu halten. </li><li> Schichten beschallt Kernen über einem gleichen Volumen der Lösung 3 (S3) (0,88 M Saccharose, 0,5 mM MgCl 2) und Zentrifuge bei 3.000 x g, 4 ° C für 10 min. Bewahren Sie die 1,5 ml Überstand als nukleoplasmatischen Fraktion (NPL) bei -70 ºC. Das Pellet in 700 μ l S2 und speichern als RCF bei -70 ºC. </li></ol> 3. Western-Blot-Analysen der RCF HINWEIS: Western-Blot-Analyse der Npl und RCF Fraktionen set Seite 640 &amp; mgr; l für Npl und 300 μ l RCF aus dem in Stufe 2.11 erhaltenen Gesamtvolumens. <ol><li> Mix 15 μ l jeder subnuclear Fraktion in Laemmli-Puffer 2x (4% SDS, 20% Glycerin, 10% 2-Mercaptoethanol, 0,004% Bromphenolblau, 0,125 M Tris HCl pH 6,8) und Kochen bei 95 ºC für 5 min. Laden der Proben in einem 10% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Denaturierungsgel und separaten Proteinen für 1,5 h bei 20 Milliampere (mA). </li><li> Transferproteine ​​durch Elektroblotting für 1,5 h bei 400 mA auf Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membranen. </li><li> Block Membran für 2 Stunden bei RT mit 3% fettfreier Trockenmilch in PBS. </li><li> Inkubieren O / N bei 4 ºC mit dem primären Antikörper gegen virale E2A DNA-bindendes Protein (B6-8 9) bei einer 1: 500-Verdünnung in PBS / 0,3% fettfreier Trockenmilch. </li><li> Waschen der Membran 3 mal mit PBS / 0,1% Tween 20 für 10 min. </li><li> Inkubieren Sie die Membran mit Maus-anti-IgG-Sekundär ein10.000-Verdünnung in PBS für 2 h bei RT: tibody bei einer 1 bis Meerrettichperoxidase (HRP) gekoppelt. </li><li> 3 mal für 10 min Waschen der Membran mit PBS / 0,1% Tween 20. </li><li> Entwickeln Sie die Membran unter Verwendung verstärkter Chemilumineszenz und Röntgenfilme. </li></ol> 4. Virale DNA-Nachweis in RCF HINWEIS: DNA-Isolierung aus beiden Npl und RCF Fraktionen, verwenden Sie 210 μ l für Npl und 100 μ l für RCF des in Stufe 2.11 erhaltenen Gesamtvolumen. <ol><li> Inkubieren subnuklearer Fraktionen für 1 h bei 55 ° C mit 1 mg / ml Proteinase K und 0,5% Tween 20. </li><li> Proteinase K inaktiviert durch Inkubation der Proben für 10 min bei 95 ° C. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 20000 · g, bei Raumtemperatur für 2 min. </li><li> Sammeln Sie die SN. Ausfällung der DNA mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und einem Volumen Isopropanol, O / N bei 4 ° C. </li><li> Zentrifugieren der Proben bei 20.000 xg bei RT für 10 min. </li><li> Entsorgen Sie die SN usingen ein Mikropipette. Bei 20000 × g, 4 ° C für 5 min Waschen des Pellets mit 70% Ethanol und zentrifugiert. </li><li> Resuspendieren der DNA in 10 μ l 10 mM Tris-HCl pH 7,4 </li><li> Quantifizierung DNA unter Verwendung eines Spektrophotometers durch Messung der optischen Dichte (OD) bei 260 nm. </li><li> Zur Amplifikation viraler DNA, verwenden 100 ng DNA aus jedem subnuclear Fraktion in einer Standard-PCR-Reaktion unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase in 25 μ l-Reaktionsvolumen mit Primern, die die Amplifikation einer Region innerhalb des hauptsächlichen späten Transkriptionseinheit zu ermöglichen, von Nucleotid 7273 bis Nukleotid 7353 (81 bp) (Fw: GAGCGAGGTGTGGGTGAGC; Rv: GGATGCGACGACACTGACTTCA). Verwenden Sie die folgenden Zyklusbedingungen: Initiale Denaturierung für 3 min bei 95 ° C, gefolgt von 20 Amplifikationszyklen (1 min bei 95 ° C, Annealing für 1 min bei 62 ° C und Verlängerung für 30 Sekunden bei 72 ° C) und einem abschließenden Verlängerungsschritt für 3 min bei 72 ° C. </li><li> Führen Sie das PCR-Produkt in 2% Agarose-Gelen, bei 90 V. Stain mit EthidiumBromid bei 0,5 μ g / ml Endkonzentration und visualisieren DNA, virale DNA-Anreicherung in der RCF mauern. Griff Ethidiumbromid mit äußerster Vorsicht und immer darauf achten, Handschuhe zu tragen, da diese Verbindung ist ein potenter mutagen. Entsorgen Ethidiumbromid gemäß gültiger Richtlinien. </li></ol> 5. späten viralen mRNA-Nachweis in RCF HINWEIS: Für die RNA-Isolierung aus beiden Npl und RCF Fraktionen, verwenden Sie 640 μ l für Npl und 300 μ l für RCF aus dem in Stufe 2.11 erhaltenen Gesamtvolumen. <ol><li> Isolieren von RNA aus subnuclear Fraktionen unter Verwendung von Trizol nach den Herstelleranweisungen. Resuspendieren RNA in 50 μ l DEPC (diethilpyrocarbonate) behandelten Wasser. </li><li> Quantifizierung der RNA mit einem Spektralphotometer, um die OD bei 260 nm messen (ca. 3 μ g erhalten). Bewahren Sie die RNA in 50 ng / &amp; mgr; l-Aliquots bei -70 ºC. </li><li> Überprüfen gereinigte RNAdie Abwesenheit von DNA-Kontamination durch Durchführung einer PCR-Kontrollreaktion in Abwesenheit von reverser Transkriptase (RT) unter Verwendung von 5 ng Gesamt-RNA und die in Schritt 4.9 beschriebenen Zyklusbedingungen. <ol><li> Wenn DNA-Kontamination fehlt kein Amplikon sollte hergestellt werden. Wenn DNA-Kontamination vorhanden ist, läßt man die Proben mit 10 U DNase I, 10 U RNase-Inhibitor, 0.1 M Tris-HCl pH 8,3, 0,5 M KCl und 15 mM MgCl2 30 Minuten bei 37 ºC. Gehen Sie erneut zu isolieren RNA, wie in Schritt 5.1. </li></ol></li><li> Virale mRNA zu RCF zugeordnet analysieren, verstärken 100 ng RNA aus jeder subnuclear Fraktion durch RT-PCR unter Verwendung von Primern, um adenoviralen späten mRNA aus verschiedenen Genfamilien (Tabelle 1) zu detektieren. <ol><li> Für die reverse Transkription (RT), Verwenden von 100 ng RNA, die voneinander subnuclear Fraktion in einem Standard-RT-Reaktion unter Verwendung von M-MuLV RT-Enzym in 20 μ l Reaktionsvolumen 1 h bei 42 ºC und 10 min bei 70 ºC. </li><li> Zur Verstärkung, benutzen 1μ l der cDNA in der PCR-Reaktionen, wie in Schritt 4.9. Mithilfe der folgenden Zyklusbedingungen: Initiale Denaturierung für 3 min bei 95 ºC, gefolgt von 25 Zyklen der Amplifizierung (1 min bei 95 ºC, Annealing für 1 min bei der in Tabelle 1 und Erweiterung angegeben für 30 Sekunden bei 72 ºC Temperatur) und ein abschließenden Extensionsschritt für 3 min bei 72 ºC. </li></ol></li><li> Führen Sie die RT-PCR-Produkte in 2% Agarose-Gelen, bei 90 V. Stain Gele mit Ethidiumbromid bei 0,5 μ g / ml Endkonzentration und zu visualisieren, um Viren späten mRNA-Assoziation mit dem RCF mauern. Griff Ethidiumbromid wie in Schritt 4.10 angegeben. </li></ol> 6. Immunfluoreszenz Visualisierung von RCF HINWEIS: Carry-out dieses Verfahren unter einer Sterilbank, um eine Kontamination der Proben zu vermeiden, mit jedem Staubpartikel und alle Lösungen auswählen, vor dem Gebrauch. <ol><li> Spot 5 ul der in Schritt 2.10 dire erhalten RCF Bruchctly auf einem Silan-beschichteten Objektträger. </li><li> Lassen Sie die Stelle trocken für ca. 5 min bei RT. </li><li> Re-Hydrat durch langsam und indirekt Pipettieren von 500 μ l PBS in einem Tropfen neben dem RCF Stelle und lässt sie durch Kippen des Schiebe fließen. Lassen Sie das überschüssige PBS von der Seite. </li><li> Block durch Bedecken der Probe mit 500 μ l PBS / 5% Rinderserumalbumin (BSA) für 2 h bei RT. </li><li> 3 Mal vorsichtig und indirekt Pipettieren von 500 μ l PBS auf die Probe zu waschen der Folie. Neigen Sie den Schieber zum Ableiten des überschüssigen PBS. </li><li> Inkubieren der Probe mit dem primären Antikörper gegen an einer 1-Virus E2A DNA-bindendes Protein (B6-8 9): 500 Verdünnung in PBS für 2 h bei RT. Decken Sie die beschmutzte Probe mit 20 μ l der Antikörperlösung und Inkubation in einer feuchten Kammer, um ein Austrocknen zu verhindern. </li><li> 3 Mal Waschen der Probe mit PBS / 0,02% Tween 20 durch leichtes und indirekt Pipettieren von 500 μ l PBS auf die Probe. Neigen Sie den Schieber, um weg von der ex DrainProzesswaschlösung. </li><li> 2.000 Verdünnung in PBS bei 4 ° C, für 1 h: die Proben mit Maus-anti-IgG-Sekundärantikörper mit einem Fluorophor, das bei 488 nm in einem 1 angeregt wird, gekoppelt zu inkubieren. Decken Sie die beschmutzte Probe mit 20 μ l der Antikörperlösung und Inkubation in einer feuchten Kammer, um ein Austrocknen zu verhindern. </li><li> 3 Mal Waschen der Probe mit PBS / 0,02% Tween 20 durch leichtes und indirekt Pipettieren von 500 μ l PBS auf die Probe. Neigen Sie den Schieber zum Ableiten des überschüssigen Waschlösung. </li><li> Decken Sie die beschmutzte Probe auf dem Objektträger mit einem Deckglas mit 2 μ l PBS / 10% Glycerin als Einschlussmittel. Dichtung mit klarem Nagellack und speichern al -20 ºC. </li><li> Analyse der Proben unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops mit einem 63x-Objektiv und einem 1,4 numerischen Apertur (NA) bei einer Wellenlänge von 488 nm. </li></ol>

<ol><li>Doucas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+replication+is+coupled+with+the+dynamic+properties+of+the+PML+nuclear+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Dev%22%5BJournal%5D)">Adenovirus replication is coupled with the dynamic properties of the PML nuclear structure.</a> Genes & Dev. 10, 196-207 (1996).</li>
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<li>Wright, J., Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+adenovirus+5+L4+promoter+is+activated+by+cellular+stress+response+protein+p53%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The human adenovirus 5 L4 promoter is activated by cellular stress response protein p53.</a> J. Virol. 87, 11617-11625 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Um die molekularen Mechanismen aufzuklären, die die Regulation zellulärer Aktivitäten durch Virusinfektionen steuern, wäre das Verständnis der Zusammensetzung und der mit RC verbundenen Aktivitäten von entscheidender Bedeutung. Um eine detaillierte Analyse von RC durchzuführen, haben wir daher ein zellfreies System etabliert, das sich die Größe und biochemische Zusammensetzung dieser virusinduzierten Strukturen zunutze macht, um subnukleäre Fraktionen, die mit RC angereichert sind, mit einem einfachen Verfahren zu isolie...

Adenoviren enthält ein doppelsträngiges DNA-Genom, das in den infizierten Zellkern repliziert. Wenn der Virus-DNA in den Zellkern, lokalisiert es neben PML nuclear bodies 1. Folgende virale frühe Genexpression wird die Kernarchitektur erheblich umstrukturiert Induzieren der Bildung von viralen Mikroumgebungen, bezeichnet als virale Replikation Compartments (RC) 2. Seit Adenovirus (Ad) RC sind Websites, auf denen Virusgenom Replikation und Expression der viralen späten Gene stattfinden, bieten sie eine Umgebung für die Rekrutierung von allen notwendigen viralen und zellulären Faktoren, die in diesen Prozessen zu beteiligen. Interessanterweise eine Vielzahl von zellulären Proteinen für die zelluläre antivirale Reaktion verantwortlich ist, wie das die DNA-Reparatur, die angeborene Immunantwort und Tumorsuppression kooptiert zu diesen viralen Orte 2. Daher kann Ad RC berücksichtigt werden regulatorische Hubs, die effiziente virale Replikation zu fördern, während gleichzeitig die Regulierung derzelluläre antivirale Antwort, die anzeigt, dass diese Strukturen sind der Schlüssel zum Verständnis der Virus-Wirt-Zell-Interaktionen. Dennoch sind die molekularen Mechanismen der RC Bildung, ihrer Zusammensetzung und damit verbundenen Tätigkeiten sind weitgehend unverstanden. Adenoviralen RC sowie RC von anderen DNA-Viren, die im Zellkern repliziert sind nicht auf Membranen cytoplasmatische RC 3 zugeordnet ist, im Gegensatz. Darüber hinaus sind diese virusinduzierten Strukturen wahrscheinlich vollständig von Proteinen und Nukleinsäuren aufgebaut sein. RC in Zellen mit RNA-Viren infiziert gebildet (gewöhnlich als viralen Fabrik) isoliert, unter Ausnutzung ihrer zytoplasmatischen Lokalisation und membrangebundenen Status, der ihre detaillierte morphologische, funktionelle und biochemische Charakterisierung 4 erleichtert hat. Nach unserem Kenntnisstand haben Atom viralen RC nicht isoliert wurden, möglicherweise aufgrund der Komplexität der Kernarchitektur und Abwesenheit der intranukleären membranes, die ihre Isolierung erleichtern würde. Ihre Studie wurde stattdessen auf die Immunfluoreszenzmikroskopie, Fisch und Transmissionselektronenmikroskopie verlassen. Doch trotz Komplikationen inhärenten Isolierung subnuclear Strukturen, andere Kernbereichen wie Kernkörperchen und Cajal Bodies haben, bevor 5,6 isoliert. Da Nucleoli und RC beide aus Proteinen und Nukleinsäuren besteht, und haben einen Durchmesser zwischen 0,5 - 5 um, stellten wir die Hypothese, dass RC auch zugänglich Isolation. Deshalb, um genauer zu charakterisieren, die molekulare Zusammensetzung und Funktionen RC verbunden sind, haben wir eine neuartige Methode, um subnuclear Fraktionen mit RC bereichert zu isolieren. Zu diesem Zweck stellten wir Sub-Kernfraktionen mit Geschwindigkeitsgradienten und Saccharose Kissen ähnlich Verfahren verwendet werden, um Kernkörperchen 7 oder sonstigen Kerndomänen 6 zu isolieren und gründete ein zellfreies System, das die Untersuchung der molekularen Zusammensetzung und die damit verbundenen Tätigkeiten erlaubtRC. Diese Technik ist daher das Verständnis der voran Virus-Wirt-Zell-Wechselwirkungen und ist ein mächtiges Werkzeug, das auch die detaillierte Analyse von RC zu erleichtern, sollte aus anderen Viren, die im Zellkern repliziert und induzieren Bildung replikations Abteile ähnliche Abmessungen wie jene in Adenovirus- gebildet infizierte Zellen, wie Herpesviren, Papillomaviren oder Polyomaviren.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td>Warm in 37 &�; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Gibco</td><td>12484-028</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose, Ultra Pure</td><td>Research Organics</td><td>0928S</td><td>Bereiten Sie eine 2,55 M Stammlösung vor und lagern Sie sie bei 4 & ordm; C</td></tr><tr><td>Dounce Homogenisator</td><td>Kontess Glass Company</td><td>884900-0000</td><td></td></tr><tr><td>Branson 1800 Ultraschallbad</td><td>Branson</td><td>Z769533&nbsp; SIGMA</td><td>15 Minuten vor Gebrauch einschalten.</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus IgG1 Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 Konjugat</td><td>Life Technologies</td><td>A-21121</td><td>Verwendung in einer Verdünnung von 1:2.000 in PBS</td></tr><tr><td>Silan-Prep Slides</td><td>Sigma</td><td>S4651-72EA</td><td>Öffnen in einem Laminar-Flow-Schrank</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemilumineszenz-Substrat</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>34080</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung der viralen replikation compartment angereicherte teil nuklearen fraktionen von adenovirus-infizierten normalen menschlichen zellen

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Während der Infektion menschlicher Zellen durch Adenoviren (Ad) wird der Wirtszellkern dramatisch reorganisiert, was zur Bildung von nuklearen Mikroumgebungen durch die Rekrutierung von viralen und zellulären Proteinen an Stellen führt, die vom viralen Genom besetzt sind. Diese Stellen, die als Replikationskompartimente (RC) bezeichnet werden, können als viral-induzierte Kerndomänen betrachtet werden, in denen das virale Genom lokalisiert ist und virale und zelluläre Proteine, die an der Replikation, Transkription und posttranskriptionellen Prozessierung beteiligt sind, rekrutiert werden. Darüber hinaus werden zelluläre Proteine, die an der antiviralen Reaktion beteiligt sind, wie z. B. Tumorsuppressorproteine, Komponenten der DNA-Schadensantwort (DDR) und angeborene Immunreaktionsfaktoren, ebenfalls für RC kooptiert. Obwohl RC eine entscheidende Rolle bei der Förderung eines effizienten und produktiven Replikationszyklus zu spielen scheint, wurde keine detaillierte Analyse ihrer Zusammensetzung und der damit verbundenen Aktivitäten durchgeführt. Um die Untersuchung von adenoviralen RC und möglicherweise von anderen DNA-Viren, die sich im Zellkern replizieren, zu erleichtern, haben wir ein einfaches Verfahren auf der Grundlage von Geschwindigkeitsgradienten angepasst, um Ad RC zu isolieren, und ein zellfreies System etabliert, das in der Lage ist, morphologische, funktionelle und zusammengesetzte Studien dieser virusinduzierten subnukleären Strukturen durchzuführen sowie ihre Auswirkungen auf Wirt-Zell-Interaktionen zu untersuchen.

Da virale Replikation Abteile (RC) sind subnuclear viral induzierten Strukturen von Proteinen und Nukleinsäuren, ähnlich zu anderen Kerndomänen zusammengesetzt, erwiesen sie zugänglich Isolierung zu sein durch Geschwindigkeitsgradienten basierend auf biochemischen Funktionen. Kritischen Schritte bei der Fraktionierung Protokolls sind in Abbildung 1. Bei jedem dargestellten Schritt die Proben müssen durch Hellfeldmikroskopie überwacht, um die Integrität der verschiedenen subzellulären Fraktionen sicherzu...

Wir bieten eine neuartige Strategie zur Isolierung von viralen Replikationskompartimenten (RC) aus Adenoviren (Ad)-infizierten menschlichen Zellen an. Dieser Ansatz stellt ein zellfreies System dar, das dazu beitragen kann, die molekularen Mechanismen aufzuklären, die die Replikation und Expression des viralen Genoms sowie die Regulation der am RC etablierten Virus-Wirt-Interaktionen regulieren.

Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine nichtnukleäre Fraktion anzureichern, die Replikationskompartimente aus adenovirusinfizierten Zellen enthält, um deren Zusammensetzung, Ultrastruktur und assoziierte Aktivitäten detailliert untersuchen zu können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der DNA-Virologie zu klären, beispielsweise die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die die virale Genomreplikation und -expression steuern und wiederum von den Replikationskompartimenten zur Regulation der Wechselwirkungen zwischen Virus und Wirtszelle abhängen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass es sich um ein einfaches Verfahren auf Basis eines Geschwindigkeitsgradienten handelt, mit dem ein zellfreies System etabliert wird, das gut geeignet ist, die Mechanismen zu untersuchen, durch die nukleär replizierende DNA-Viren die Kontrolle über die infizierte Zelle übernehmen.Um diesen Assay durchzuführen, bereiten Sie zunächst Adenovirus Typ 5 oder D5 und humane Foreskin-Fibroblasten (HFF) gemäß dem begleitenden textlichen Protokoll vor. Infizieren Sie 10^7 HFF in 100-mm-Zellkulturschalen mit je einem Milliliter 85 % DMM pro Schale bei einem Multiplizität der Infektion (MOI) von 30 fokusbildenden Einheiten (FFU) pro Zelle. Inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden lang in einem befeuchteten Zellkulturinkubator bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid, wobei die Schalen alle 15 Minuten vorsichtig geschwenkt werden, um eine homogene Verteilung des Virusinokulums über die Zellen zu gewährleisten. Nach der Inkubation entfernen Sie das Medium und geben frisches DMEM hinzu.Die Zellen mit 10 % FBS versetzen und anschließend 16, 24 oder 36 Stunden inkubieren, wobei ein Zellabstreifer verwendet wird. Die infizierten und Kontrollzellen vorsichtig nach der Infektion gewinnen und die Zellsuspension in sterilen Zentrifugenröhrchen auf Eis sammeln. Die Zellen mit einer Neubauer-Kammer zählen und anschließend bei 220 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.Als Nächstes das Zellpellet in fünf Milliliter eiskalter PBS resuspendieren, die Zellen dreimal in fünf Milliliter eiskalter PBS waschen und die Waschüberstände verwerfen, um die Zellen zu lysieren. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 700&nbsp;Mikroliter eiskalter hypotonischer Pufferlösung mit Proteaseinhibitoren und lassen Sie die Zellen auf Eis für drei Stunden anschwellen. Homogenisieren Sie die Zellen mit einem Teflon-Stößel des Typs A durch 10 bis 20 Auf-und-ab-Bewegungen.Überprüfen Sie das Lysat unter dem Mikroskop regelmäßig alle 20 Stöße, um die Zelllyse zu überwachen. Wiederholen Sie den Vorgang etwa 80-mal, bis alle Zellen erfolgreich aufgebrochen sind. Anschließend zentrifugieren Sie das Homogenat bei 300 mal G und vier Grad Celsius für fünf Minuten.Den Überstand bei minus 20 Grad Celsius in einem Gefäß als cytoplasmatische Fraktion aufbewahren, um zellulären Debris von den Kernen zu trennen. Den Pellet in 750 µL 0,25 molarer Saccharoslösung suspendieren und 750 µL 0,35 molarer Saccharoslösung zwei in einem Zentrifugenröhrchen geben; anschließend das resuspendierte Homogenat vorsichtig über Lösung zwei schichten. Die Saccharoskissen-Zentrifugation bei 1400 × g und 4 °C fünf Minuten lang durchführen und danach den Überstand verwerfen.Suspendieren Sie das Pellet in 750 µL Lösung zwei zur Zerstörung der Zellen. Sonifizieren Sie die nukleäre Suspension in einem Ultraschallbad, das bei oder unter vier Grad Celsius gehalten wird, mit zwei Impulsen zu je fünf Minuten. Überprüfen Sie die nukleäre Lyse zwischen den Impulsen am Lichtmikroskop und sonifizieren Sie weiter, bis die Kerne vollständig lysiert sind.Anschießend pipettieren Sie 750 Mikroliter der 0,88 molaren Saccharoselösung drei in ein Zentrifagenröhrchen und schichten die nukleäre Lysetlösung vorsichtig über Lösung drei. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 3000 × g und 4 °C für 10 Minuten. Das 1,5-Milliliter-Schicht wird als nukleoplasmatische Fraktion bezeichnet und bei −70 °C aufbewahrt.Suspenderen Sie das Pellet anschließend in 700 µL Lösung zwei. Dies ist die 85-Replikationskompartiment-Fraktion oder RCF des Wirtskerns, die ebenfalls bei minus 70 Grad Celsius gelagert wird. Beginnen Sie die Immunfluoreszenzanalyse, indem Sie einen Tropfen von fünf µL der RCF auf einen mit Salin beschichteten Objektträger geben.Lassen Sie den Tropfen bei Raumtemperatur trocknen. Geben Sie dann 500 Mikroliter PBS als Tropfen neben die Stelle und kippen Sie den Objektträger, um PBS über die Stelle fließen zu lassen. Entfernen Sie das PBS vom Objektträger.Blockieren Sie anschließend die Probenstelle mit 500 µL PBS, der 5 % Rinderserumalbumin enthält, zwei Stunden bei Raumtemperatur. Um überschüssige Blockierungslösung zu entfernen, geben Sie vorsichtig 500 µL PBS zur auf dem Objektträger aufgetragenen Probe, ohne direkt auf die Probe aufzupipettieren. Führen Sie die Wäsche dreimal durch.Fügen Sie als Nächstes 20 µL verdünnter primärer Antikörper gegen das virale E2A-DNA-Bindungsprotein auf die Probenstelle hinzu. Decken Sie den Objektträger ab, um Verdunstung zu vermeiden, und inkubieren Sie ihn zwei Stunden bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer. Waschen Sie die Probe nun dreimal vorsichtig mit PBS, der 0,02 % Tween 20 enthält. Vermeiden Sie es, nach diesen Waschschritten direkt auf die Probe zu pipettieren. Geben Sie 20 Mikroliter fluoro-gekoppeltes sekundäres Antikörper-Konjugat der Maus direkt auf die Probe, inkubieren Sie eine Stunde bei vier Grad Celsius. In einer befeuchteten Kammer geben Sie 500 Mikroliter PBS mit 0,02 % Tween 20 auf die Objektträger, wobei erneut vermieden werden sollte, direkt auf die Probe zu pipettieren.Dann zwei Mikroliter Eindecklösung hinzufügen und eine Deckglas über die Probe stülpen. Die Ränder der Deckgläser mit Nagellack versiegeln. Die Probe unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einer 63x-Objektivlinse bei der gewünschten Wellenlänge, die spezifisch für den verwendeten Fluorophor ist, betrachten. Ein Ergebnis der Immunfluoreszenz von adenoviralem E2A-DNA-Bindungsprotein oder DBP wird hier gezeigt.Die DBP-haltigen Strukturen sind subnukleäre virale Replikationskomplexe; beachten Sie, dass die E2A-DBP innerhalb des Replikationskomplexes lokalisiert ist und grün erscheint. Zusätzlich wurde eine Anreicherung viraler DNA im RCF durch PCR bestätigt, bei der der RCF mit der nucleoplasmatischen Fraktion (NPL) 24 und 36 Stunden nach der Infektion verglichen wurde. Die virale DNA wurde selektiv im RCF und nicht in der NPL nachgewiesen.Der begleitende Text enthält zusätzliche Nachweise für adenovirale MNA im RCF. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in sechs durchgeführt werden, von der Zeitpunkt, zu dem infizierte Zellen geerntet werden, bis zur Isolierung des RCF, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, stets daran zu denken, die Proben auf Eis zu halten und die Schritte der Homogenisierung, Nukleolisierung, Isolierung, Beschallung und Isolierung der subnukleären Fraktion mittels Hellfeldmikroskopie zu überwachen. Nach diesem Verfahren.Andere Methoden wie R-T-P-C-R und die Transmissionselektronenmikroskopie können durchgeführt werden, um die Regulation der viralen Genexpression, die mit den viralen Replikationskompartimenten assoziiert ist, sowie die Ultrastruktur dieser Partikel zu untersuchen. Diese Technik könnte es Forschern auf dem Gebiet der DNA-Tumorvirologie ermöglichen, molekulare Mechanismen zu erforschen, die die Regulation des Zellzyklus verändern und die virale Replikation in menschlichen Zellen fördern. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man virale Replikationskompartimente aus infizierten Zellkernen isoliert, um morphologische, funktionelle und zusammensetzungsbezogene Untersuchungen dieser virusinduzierten Strukturen durchzuführen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem SAN-Indikator gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Gehörschutz sollten stets beachtet werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Das Genom der Influenza A-Virus besteht aus acht separaten Komplexen von RNA und Proteinen, genannt virale Ribonukleoproteinkomplexe (vRNPs). Dieses Papier beschreibt die Glycerin Gradientenreinigung und Transmissionselektronenmikroskopie Visualisierung von Influenza-A-vRNPs.

Reinigung und Visualisierung von Influenza A Virus Ribonukleoproteinkomplexe

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Isolation und genetische Manipulation von Adult Herzmuskelzellen für konfokale Imaging

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Hier beschreiben wir ein Protokoll nur auf Zellinfektion, was die Effizienz von rekombinanten Parvovirus-Produktion um mehr als 100-fach im Vergleich zu anderen Protokolle verwendet verbessert bezogen. Dieses Protokoll basiert auf der Verwendung einer neuartigen Adenovirus-5-basiertes Hilfsprogramm mit dem Parvovirus VP Transkriptionseinheit (Ad-VP).

Effiziente rekombinanten Parvovirus Produktion mit Hilfe von Adenovirus-abgeleiteten Systemen

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Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Adenovirale Gentransfer in naiven CD4-T-Zellen mit transgenen Expression des Coxsackie Adenovirus-Rezeptor ermöglicht die molekulare Analyse von regulatorischen...

Adenovirale Transduktion von Naive CD4 T-Zellen zu Treg Differenzierung Studieren

Es wird ein Protokoll zur Erzeugung von adenoviralen Vektoren mit hoher Kapazität vorgestellt, bei denen alle viralen kodierenden Sequenzen fehlen. Die Klonierung von Transgenen, die im Vektorgenom enthalten sind, basiert auf Homing-Endonukleasen. Die Virusamplifikation in Produzentenzellen, die als adhärente Zellen und in Suspension gezüchtet werden, beruht auf einem Helfervirus, das virale Gene in trans bereitstellt.

Klonierung und großtechnische Produktion von High-Capacity Adenovirusvektoren Auf der Grundlage des humanen Adenovirus Typ 5

Hier stellen wir ein Protokoll für die Adenovirus-Produktion mit dem pAdEasy-System vor. Die Technologie umfasst die Rekombination der Plasmide pAdTrack und pAdEasy-1, die Adenovirus-Verpackung und -Verstärkung, die Reinigung der adenoviralen Partikel aus Zelllysat und Kulturmedium, die virale Titration und die funktionelle Prüfung des Adenovirus.

Eine effiziente Methode für die Adenovirus-Produktion

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Herstellung und Aufreinigung von Suspensionskulturen von Adeno-assoziierten Viren durch Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation für In-vivo-Anwendungen

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung und Reinigung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren unter Verwendung einer optimierten Heparin-basierten Affinitätschromatographie-Methode. Es stellt einen einfachen, skalierbaren und kostengünstigen Ansatz dar, der die Notwendigkeit einer Ultrazentrifugation eliminiert. Die daraus resultierenden Vektoren weisen eine hohe Reinheit und biologische Aktivität auf, was ihren Wert in präklinischen Studien unter Beweis stellt.

Isolierung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren durch ein einstufiges und halbautomatisches Heparin-Affinitätschromatographie-Protokoll

Erfahren Sie die Isolierung viraler Replikationskompartimente aus Adenovirus-infizierten menschlichen Zellen mittels Geschwindigkeitsgradient. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung viraler Genomreplikation.

Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen (Video) | JoVE Journal

Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen

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