Isolierung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren durch ein einstufiges und halbautomatisches Heparin-Affinitätschromatographie-Protokoll

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung und Reinigung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren unter Verwendung einer optimierten Heparin-basierten Affinitätschromatographie-Methode. Es stellt einen einfachen, skalierbaren und kostengünstigen Ansatz dar, der die Notwendigkeit einer Ultrazentrifugation eliminiert. Die daraus resultierenden Vektoren weisen eine hohe Reinheit und biologische Aktivität auf, was ihren Wert in präklinischen Studien unter Beweis stellt.

In dieser Arbeit beabsichtigen wir, ein verbessertes Protokoll für die Herstellung, Reinigung und Charakterisierung von Mosaik-Adeno-assoziierten viralen Vektoren zu entwickeln, das sich in präklinischen Studien bewähren könnte. Trotz der Bemühungen, stabile Produzentenzelllinien zu etablieren, ist die transiente Transfektion in Säugetierzellen nach wie vor der vorherrschende Arbeitsablauf für die AAV-Produktion. Anschließend werden die AAVs durch Dichtegradientenzentrifugation mit ultrahoher Geschwindigkeit oder durch Chromatographietechniken, die auf den biochemischen Eigenschaften von Viruspartikeln beruhen, gereinigt.

Die häufig verwendeten Methoden zur Aufreinigung von AAVs verwenden die Cäsiumchlorid- oder Iodixanol-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Trotz ihrer Vorteile haben sie einige Einschränkungen. Sie sind zeitaufwändig, sie sind nur begrenzt skalierbar und sie liefern oft Ergebnisse für einige Vektoren mit geringer Reinheit.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben sich nun mehrere Forscher den Chromatographietechniken zugewandt. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Erzeugung von Mosaik-rAAVs basierend auf der Heparin-Bindungsfähigkeit von AAV2. Diese Methode macht hochreine und biologisch aktive rAAVs in sechs Tagen einsatzbereit und präsentiert sich als halbautomatische, skalierbare und kostengünstige Strategie zur Erzeugung von rAAVs für präklinische Studien.

Nachdem die Anwendbarkeit dieser Methode für die Erzeugung von Mosaik-rAAVs demonstriert wurde, kann das Produktionssystem nun fein abgestimmt werden, um eine bessere Skalierbarkeit und Kosteneffizienz durch die Etablierung einer Produzentenzelllinie zu erreichen. Darüber hinaus versuchen wir, leere Partikel zu entfernen, indem wir einen zweiten Reinigungsschritt zum Polieren einbauen.