Echtzeit-Imaging von Plant Cell Oberflächen Dynamics mit variabler Winkel Epifluoreszenzmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Bewegung fluoreszenzmarkierter Proteine auf Pflanzenzell-Oberflächen mittels Epifluoreszenzmikroskopie mit variablen Winkeln zu beobachten. Dieses Verfahren kann uns Fortschritte im Bereich der Pflanzenzellenbiologie ermöglichen, beispielsweise beim Verständnis, wie Proteine auf Pflanzenzell-Oberflächen funktionieren. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie uns die Visualisierung der dynamischen Vorgänge fluoreszenzmarkierter Proteine in Echtzeit erlaubt, noch bevor das Verfahren beginnt.

Kalibrieren Sie die Zentrierung und Fokussierung des Lasers am Mikroskop gemäß den Herstelleranweisungen. Verwenden Sie dann einen objektivfreien Lichtweg, um die Mitte der Decke des Mikroskopieraums zu lokalisieren, und markieren Sie die Position mit einem farbigen Aufkleber. Beleuchten Sie anschließend die Decke mit einem Objektiv und verschieben Sie den beleuchteten Bereich in die Mittelposition.

Danach fokussieren Sie den Laser und justieren fein die Position des Lasers auf die Mitte der Decke. Die Zentrierung und Fokussierung des Lasers ist sehr wichtig für eine erfolgreiche Beobachtung mittels variabler Winkel-Epi-Fluoreszenzmikroskopie (VAEM). Benutzer sollten vor Beginn eines Experiments von einem fachkundigen Mitarbeiter des Mikroskopherstellers geschult werden.

Wenn das Mikroskop bereit ist, pipettieren Sie 30 Mikroliter Basalpuffer auf die Mitte eines 76 mal 26 Millimeter großen Objektträgers. Anschließend entfernen Sie mit einer Schere ein Cotyledon von einer sieben Tage alten Sämling und legen das Cotyledon mit der Beobachtungsseite nach oben auf den Tropfen Basalpuffer. Danach geben Sie 30 Mikroliter Basalpuffer auf die Mitte eines 18 mal 18 Millimeter großen Deckgläschens.

Deckglas abdecken und das Deckglas umdrehen. Die Oberflächenspannung hält den Tropfen sanft fest, wobei das Deckglas mit einer Pinzette an einer Kante gehalten wird. Legen Sie die gegenüberliegende Kante auf den Objektträger, sodass der Puffer über dem Co-Einlauf steht.

Danach die Kante des Deckglases auf dem Objektträger belassen. Die Position des Tropfens so einstellen, dass er sich direkt über der Ölsäureprobe befindet, und das Deckglas ablegen. Befinden sich keine Luftblasen, überschüssige Pufferlösung mit fusselfreien Tüchern abwischen und die Präparation sofort auf das Mikroskop übertragen.

Unter Verwendung der Hellfeldbeleuchtung die Zellen für die Beobachtung auswählen. Anschließend bestätigen, dass das fluoreszierende Protein beobachtet werden kann, und mit epifluoreszenter Beleuchtung die Z-Achsen-Position an der Zelloberfläche einstellen. Um die VAEM durchzuführen, die Einstellbox verwenden, um den Eintrittswinkel des Laserstrahls zu neigen.

Allmählich, während das Live-Bild sorgfältig überwacht wird. Anfangs erscheint das Bild unscharf. Wenn der Laserwinkel zunimmt, wird das VAEM-Bild schärfer und erzeugt schließlich ein klares Bild.

Zu diesem Zeitpunkt die Erhöhung des Laserwinkels stoppen. Nun feinabstimmen. Den Eintrittswinkel des Lasers anpassen, um ein besseres Bild zu erhalten, und dabei die optischen und Bildsensor-Parameter gegebenenfalls justieren.

Danach mithilfe der kommerziellen Mikroskop-Software einen Film als mehrseitige TIFF-Bilddatei aufnehmen. Hier zeigt der Film GFP-markierte Punkte, die auf der Oberfläche von STA-Modellzellen blinken. Um die Verweilzeit der GFP-markierten Punkte mit Fiji zu quantifizieren, gehen Sie zum Menü „Datei öffnen“ und öffnen Sie die aufgenommene mehrseitige TIFF-Datei.

Verwenden Sie das Werkzeug für gerade Linien, um eine Linie auf der gewünschten Seite zu platzieren. Verwenden Sie anschließend das Plugin „Image Stacks Dynamic Res Slice“, um ein Diagrammbild zu erzeugen. Während sich die Linie verändert, wird sich das Diagrammbild dynamisch ändern.

Speichern Sie das Bild als TIFF-Datei über den Menüpunkt „Datei speichern unter“ im TIFF-Format. Führen Sie anschließend eine Rauschreduktion durch, indem Sie zum Menü „Prozess → Filter → Gaußscher Weichzeichner“ gehen und einen Gauß-Filter auf die Chronogrammbilder anwenden. Der Parameter für den Sigma-Radius sollte nach Bedarf angepasst werden.

Unter Verwendung des Werkzeugs „Schwellenwert für Bildanpassung“ signalgebende Bereiche durch Schwellenwertanalyse segmentieren und das Menü „Messungen festlegen“ unter „Analysieren“ öffnen. Anschließend im Fenster „Messungen festlegen“ das Begrenzungsrechteck aktivieren und die geringstmögliche Anzahl von Pixeln auswählen. Danach im Menü „Analysieren“ den Punkt „Partikel analysieren“ aufrufen.

Messen Sie die Zeitpunkt des gewünschten Punktes an der Y-Achse ab und überprüfen Sie die angezeigten Ergebnisse; fügen Sie diese zur Ansicht der Datenwerte in die Manager-Felder hinzu. Schließlich wählen Sie im Menü der Ergebnistabelle „Datei“ und „Speichern unter“ und verarbeiten Sie den Datensatz der Punkt-Bilddauern mit der geeigneten Analyse-Software. Hier sind die Verweilzeiten von 185 GFP-Patrouille-eins-Punkten aus 12 unabhängigen Tochterzellen in der achten Edin, wie mittels CHM-Graph-Analyse gemessen, entsprechend der Abbildung im Diagramm dargestellt.

Die angepasste Dichtefunktion zeigte, dass sich die meisten GFP-Patrol-One-Punkte zwischen zwei und zehn Sekunden in einer Nebenzelle aufhielten, mit einem Maximum von etwa 3,5 Sekunden. Dies deutet auf eine schnelle Exocytose und Endocytose der Protonenpumpen an der Oberfläche der Nebenzelle hin. Nach der Bearbeitung dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Dynamik von Ary-Typ-Proteinen an der Oberfläche von Pflanzenzellen mithilfe der Epifluoreszenzmikroskopie mit veränderbarem Winkel sichtbar machen und quantifizieren kann.