Echtzeit-Imaging von Plant Cell Oberflächen Dynamics mit variabler Winkel Epifluoreszenzmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Bewegung von fluoreszenzmarkierten Proteinen auf pflanzlichen Zelloberflächen mit Hilfe der Epi-Fluoreszenzmikroskopie mit variablem Winkel zu beobachten. Dieses Gefäß kann uns helfen, auf dem Gebiet der Pflanzenzellbiologie voranzukommen, z. B. bei der Frage, wie Proteine auf Plattenzelloberflächen funktionieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die Echtzeitdynamik von fluoreszierenden Angriffsproteinen zu visualisieren, bevor wir mit dem Verfahren beginnen.

Kalibrieren Sie die Laserzentrierung und Fokussierung des Mikroskops gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie dann einen objektivlinsenfreien Lichtgang, um die Mitte der Decke des Mikroskopieraums zu lokalisieren und markieren Sie die Position mit einer farbigen Dichtung. Beleuchten Sie als Nächstes die Decke mit einer Objektivlinse und verschieben Sie den beleuchteten Bereich in die Mittelposition.

Fokussieren Sie dann den Laser und stimmen Sie die Position des Lasers auf die Mitte der Decke ab. Die Zentrierung und Fokussierung des Lasers ist sehr wichtig für eine erfolgreiche Beobachtung mit variablem Winkelmikroskop oder VAEM. Die Benutzer sollten vor Beginn eines Experiments von einer professionellen Mitarbeiterin des Mikroskopherstellers geschult werden.

Wenn das Mikroskop fertig ist, geben Sie 30 Mikroliter Basalpuffer auf die Mitte eines 76 x 26 Millimeter großen Objektträgers. Verwenden Sie dann eine Präparierschere, um ein Co-Leadin von einem sieben Tage alten Sämling zu entfernen, und lassen Sie das Co-Leadin mit der Beobachtungsseite nach oben auf dem basalen Puffertropfen schwimmen. Geben Sie als Nächstes 30 Mikroliter Basalpuffer in die Mitte eines 18 x 18 Millimeter großen

Deckglas ab und drehen Sie das Deckglas auf den Kopf. Sanfte Oberflächenspannung verhindert, dass der Tropfen herunterfällt, indem das Deckglas mit einer Pinzette an einer Kante gehalten wird. Platzieren Sie die gegenüberliegende Kante so auf dem Objektträger, dass sich der Puffer über der Co-Einführung befindet.

Halten Sie dann den Rand des Deckglases auf dem Objektträger. Stellen Sie die Position des Tropfens so ein, dass er sich direkt über der Oleinprobe befindet, und lassen Sie das Deckglas fallen. Wenn keine Luftblasen vorhanden sind, wischen Sie den überschüssigen Puffer mit fusselfreien Tüchern ab und übertragen Sie das Präparat sofort auf das Mikroskop

Wählen Sie mit Hellfeldbeleuchtung die Zellen für die Beobachtung aus. Bestätigen Sie als nächstes, dass das fluoreszierende Protein beobachtet werden kann, und verwenden Sie die Epi-Fluoreszenzbeleuchtung, um die Position der Z-Achse an der Zelloberfläche festzulegen. Um VAEM durchzuführen, verwenden Sie die Controller-Box, um den Eintrittswinkel des Laserstrahls zu neigen.

Überwachen Sie das Live-Bild nach und nach, während Sie es sorgfältig überwachen. Anfangs erscheint das Bild unscharf. Mit zunehmendem Laserwinkel wird das VAEM-Bild weniger verschwommen, so dass schließlich ein klares Bild entsteht.

Hören Sie an dieser Stelle auf, den Laserwinkel zu erhöhen. Jetzt in Ordnung. Stimmen Sie den Lasereintrittswinkel ab, um ein besseres Bild zu erhalten, und passen Sie die optischen und Bildsensorparameter nach Bedarf an.

Nehmen Sie dann mit der handelsüblichen Mikroskopsoftware einen Film als mehrseitige TIFF-Bilddatei auf. Hier zeigt der Film GFP-beschriftete Punkte, die auf der Oberfläche von STA-Modellzellen blinken. Um die mit GFP gekennzeichnete DOT-Verweilzeit mit Fidschi zu quantifizieren, gehen Sie zum Menü zum Öffnen der Datei und öffnen Sie die erworbene mehrseitige Spitzendatei.

Verwenden Sie das Auswahlwerkzeug für gerade Linien, um eine Linie auf der interessierenden Seite zu platzieren. Verwenden Sie als Nächstes das Plugin Image Stacks Dynamic Res Slice, um ein Diagrammbild zu generieren. Wenn sich die Linie ändert, ändert sich das Diagrammbild dynamisch.

Speichern Sie das Bild als TIFF-Datei unter dem Menü Datei, Speichern als TIFF. Um dann eine Rauschunterdrückung durchzuführen, gehen Sie zum Menü "Prozessfilter-Gaußscher Weichzeichner" und wenden Sie einen Gaußschen Filter auf die Chronographenbilder an. Der Parameter Sigma-Radius sollte bei Bedarf angepasst werden.

Segmentieren Sie mit dem Werkzeug zum Anpassen des Bildschwellenwerts die Signalbereiche nach Schwellenwerten und öffnen Sie das Menü "Eingestellte Messungen analysieren". Überprüfen Sie als Nächstes das umgebende Rechteck im Fenster "Maße einstellen" und wählen Sie die minimal mögliche Anzahl von Pixeln aus. Dann im Menü Analysieren Partikel analysieren.

Messen Sie die Zeit des interessierenden Punkts gegen die Y-Achse, überprüfen Sie die Anzeigeergebnisse und fügen Sie sie den Managerfeldern hinzu, um die Datenwerte anzuzeigen. Wählen Sie abschließend im Menü der Ergebnistabelle die Option Datei, Speichern unter und verarbeiten Sie den Datensatz der Punktbilddauern mit der entsprechenden Analysesoftware. Hier sind die Verweilzeiten von 185 GFP-Patrouillen-Punkten aus 12 unabhängigen Tochterzellen in der achten Edin, gemessen mit der CHM-Graph-Analyse, wie in der Grafik dargestellt, dargestellt.

Die angepasste Dichtefunktion zeigte, dass die meisten der GFP-Patrouillen-Eins-Punkte zwischen zwei und 10 Sekunden in einer Nebenzelle verweilten, mit einem Spitzenwert von etwa 3,5 Sekunden. Dies deutet auf eine schnelle Exozytose-Endozytose der Protonenpumpen auf der Oberfläche der Tochterzelle hin. Nachdem Sie dieses Video bearbeitet haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Dynamik von Proteinen vom Typ ary auf der Oberfläche von Pflanzenzellen mit Hilfe der Epi-Fluoreszenzmikroskopie mit variablem Winkel visualisieren und quantifizieren können.