Name: Lichtgetriebene enzymatische Decarboxylierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Erfahren Sie die lichtgetriebene enzymatische Decarboxylierung von Fettsäuren zu terminalen Alkinen mit dem Enzym OleT. Diese Methode nutzt sichtbares Licht zur kontrollierten Wasserstoffperoxid-Freisetzung für nachhaltige Biokatalyse.

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R.K. und F.H. danken der EU-Kommission für die finanzielle Unterstützung im Rahmen der Marie-Skłodowska ITN Biokaskaden (Nr. 634200).

Achtung: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Einige der Chemikalien in diesen Synthesen verwendet werden, sind akut toxisch und krebserregend. Alle Schritte schädlichen organischen Lösungsmitteln beteiligt, insbesondere die Extraktion der Reaktionsprodukte und die Derivatisierung von Fettsäuren müssen mit persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe unter einem Abzug durchgeführt werden ). Alle Transaktionen im Zusammenhang mit gentechnisch veränderten Organismen in dieser Arbeit erfordern Anlagen, die für den Umgang mit gentechnisch veränderten Organismen der Sicherheitsstufe S1 zugelassen sind. 1. Expression des rekombinanten Decarboxylase OLET JE in E. coli <ol><li> Vorbereitung des Produktionsstammes <ol><li> Vorbereiten eines synthetischen Gens von OLET JE aus Jeotgalicoccus und kloniert in den Expressionsvektor pASK-IBA37plus wie beschrieben. 8 </sup&gt; ANMERKUNG: Um den Abbau von Fettsäuren durch Enzyme , die aus den bakteriellen Stoffwechsel vermeiden, E. coli - Stamm JW5020 von der Keio - Sammlung mit einer dysfunktionalen Weg für den Abbau Fettsäure verwendet wurde. </li></ol></li><li> Der Anbau und die Induktion der Enzymexpression <ol><li> Bereiten Sie eine Vorkultur von der E. Impfen coli JW5020 OLET Mutante von einer LB-Platte (mit 100 ug ml -1 Ampicillin) in zwei 3 ml LB-Medium in Reagenzgläser. Pipette Ampicillin (100 ug ml - 1) aus einer Stammlösung in das Medium für die Selektion und inkubieren bei 37 ° C für 15 Stunden in einem Schüttelinkubator bei 180 UpM. </li><li> 2 ml der Vorkulturen auf zwei 200 ml LB-Medium, enthaltend Ampicillin (100 ug ml - 1), in 1 l Schüttelkolben. Inkubation schreitet bei 37 ° C und 180 rpm. </li><li> Überwachen Sie die Änderung in der OD 600nm nach der Inokulation. Wenn die OD 600 erreicht einen Wert zwischen 0,6 eind 0,8 induzieren die Expression von Tetracyclin Zugabe (0,2 ug ml -1). Inkubieren der Kulturen 15 Stunden lang bei 20 ° C und 180 rpm. HINWEIS: Da OLET JE einen Häm - Cofaktor enthält, Zugabe von δ-Aminolävulinsäure (0,5 mM) vor der Induktion benötigt wird, die Kultur mit einem Vorläufer für die Cofaktor - Synthese bereitzustellen. </li></ol></li><li> Zelllyse <ol><li> Führen Sie die folgenden Schritte auf dem Eis. Übertragen Sie die Kulturen durch Abgießen oder Pipettieren in Zentrifugenröhrchen und verwenden Sie eine Skala gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Zentrifugation der Kulturen für 20 min bei 12.000 × g bei 4 ° C. </li><li> Sorgfältig den Überstand verworfen und die Pellets in 50 ml Puffer (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) durch Pipettieren resuspendieren und die Suspension in einem konischen Zentrifugenröhrchen übertragen. </li><li> Nach Zentrifugation für 15 min bei 4.000 × g bei 4 ° C Überstand verwerfen, jedes Pellet in 3 ml Puffer durch Pipettieren resuspendieren. </li><li> Führen Sie die Zelllyse durch sokation, die Lösungen auf Eis (drei Zyklen x 30 sec) eine 1 Minute Pause zwischen den Zyklen zu verlassen. Zentrifuge die Lösungen für 20 min bei 15.000 × g bei 4 ° C die Zelltrümmer zu entfernen, und der Überstand in ein konisches Zentrifugenröhrchen übertragen, ohne das Pellet durch Pipettieren zu stören. Entsorgen Sie das Pellet. HINWEIS: Ein Lösungsmittelanteil wird direkt für die Biokatalyse verwendet werden, nachdem kleine Moleküle entfernt werden. Die zweite Fraktion wird zur Reinigung des His-tagged OLET JE verwendet werden. </li></ol></li><li> Entfernung von kleinen Molekülen von Zellextrakten <ol><li> Vor der Verwendung der Rohextrakt in Biokatalyse kleine Moleküle zu entfernen, die mit Wasserstoffperoxid-Bildung oder Elektronenübertragung stören könnten durch Pipettieren von 3 ml zellfreien Extrakts in ein Zentrifugenfiltereinheit mit einer 10 kDa Membran und Zentrifuge bei 4000 × g bei 4 ° C. Resuspendieren verbleibende Protein in 3 ml Tris-HCl-Puffer. </li></ol></li><li> Reinigung von OLET </strong&gt; <ol><li> Anwenden 3 ml der zweiten Zellextrakt His Pur Ni-NTA Spin-Säulen, die vorher mit Äquilibrierungspuffer (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol) equilibriert wurden. </li><li> Verschließen Sie die Spalten mit den unteren Stopfen und oberen Schraubverschlüsse und schütteln Sie sie leicht, bis das Harz verteilt ist ebenso mit dem zellfreien Extrakt. Inkubiere die geladenen Spalten für 30 min in einem Überkopfschüttler bei 4 ° C. </li><li> Waschen der Säulen mit 1 ml Waschpuffer (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, 20 mM Imidazol, pH 7,4) von bei 700 × g für 2 min zentrifugiert. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. </li><li> Legen Sie die Spalten in eine frische konische Zentrifugenröhrchen und 1 ml Elutionspuffer (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 250 mM, pH 7,4) OLET JE. Zentrifuge bei 700 xg für 2 Minuten und wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. HINWEIS: Imidazole an Nickel binden und somit OLET JE aus der Säule zu entfernen. </li><li> Übertragen Sie die Elution in ein Zentrifugenfiltereinheit (10 kDa membran) und Zentrifuge bei 4000 × g bei 4 ° C Imidazol zu entfernen. </li><li> Überprüfen Sie die Reinheit des Enzyms durch eine SDS-PAGE (15%). 9 Mix 3 ul der Elution mit einem SDS-Puffer (Endkonzentration 1x) und Inkubieren der Lösung bei 95 ° C für 5 Minuten zur Denaturierung. Anschließend gelten die Gesamtmenge auf einem SDS-PAGE. Führen Sie das Gel bei 35 mA Kommerzielle Protein-Standard. Erkennt das Protein bei 50 kDa. </li><li> die Proteinkonzentration verwenden, um einen kommerziell erhältlichen BSA-Kit zu bestimmen. Pipettieren von 50 &amp; mgr; l des verdünnten Proteinproben (1: 100, 1: 200, 1: 500) und BSA - Standard (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg ml -1) in einer 96-Well - Platte . In 200 ul Bradford-Reagenz, messen die Absorption bei 595 nm nach 15 Minuten mit einem Fluorimeter und berechnen die Konzentrationen der Standardkurve. </li></ol></li></ol> 2. Licht-katalysierte Biotransformation <ol><li> Biokatalytischen Reaktionen ohne Wasserstoffperoxid zusätzlich<ol><li> Bereiten Sie eine 10 ml Stammlösung von 10 mM Stearinsäure (M r 284,5 g mol -1) durch Zugabe von 10% (v / v) Tergitol und 0,0284 g Stearinsäure zu destilliertem Wasser. Die Lösung wird in einer Heizkammer auf 60 ° C bis die Fettsäure vollständig gelöst ist. </li><li> Biokatalyse und Probenahme <ol><li> Bereiten zwei 2 ml Reaktionsmischungen enthaltend 50 mM EDTA, 0,01 mM FMN, 0,5 mM Stearinsäure in Tris-HCl-Puffer. Fügen Sie einen magnetischen Rührstab für eine ausreichende Sauerstoffversorgung und legen Sie die Glasrohre in einem Wasserbad erhitzt auf 25 ° C. </li><li> In 200 ug ml -1 von gereinigtem Enzym oder 10% (v / v) zellfreien Extrakt zu jedem der Reaktionsgemische und beleuchten sie mit einem klaren Glas Glühbirne (120 W) in 15 cm Abstand der Reaktionsrohre. </li><li> Nehmen Sie 200 ul-Proben zu bestimmten Zeitpunkten (0, 10, 30, 60 und 120 min und über Nacht) Stoppen der Reaktion mit 20 &amp; mgr; l 37% HCl. In 5 ul Myristinsäure (10 mM Lager, solution) als interner Standard. </li></ol></li></ol></li><li> Analyse der Reaktionsprodukte <ol><li> Für die Extraktion 500 ul Ethylacetat zu den Proben zweimal hinzufügen, kehren die Rohre und Zentrifuge für 1 min bei 13.000 x g. </li><li> Nehmen Sie 400 ul des Überstandes und lassen Sie das Lösungsmittel vollständig verdampfen. </li><li> Derivatisierung der Carbonsäuren in trimethylsilylcarboxylic Säure durch Zugabe von 200 &amp; mgr; l N - Methyl - N - (trimethylsilyl) acetamid Trifluor (MSTFA). Inkubieren der Lösung bei 60 ° C für 30 min, um Hydroxylgruppen zu konvertieren Ethern Trimethylsilyl. </li><li> Bestimmung der Umwandlung durch GC / FID HINWEIS: Bestimmen der Bildung von 1-Heptadecen (RT: 8,34 min), α- und β-Hydroxystearinsäure (RT: 12,05 und 12,1 min) und die Abnahme des Substrats (RT: 11,15 min) unter Verwendung von GC / FID. <ol><li> Stellen Sie das Temperaturprofil unter Set die Einspritztemperatur auf 340 ° C beschrieben. Haltendie anfängliche Ofentemperatur bei 90 ° C für 3,5 min und anschließend mit 45 ° C min -1 erhöhen. Bei 220 ° C, halten Sie die Temperatur für 2 min. Nach einer wiederholten Anstieg von 45 ° C min -1, für 2 min die Temperatur auf 280 ° C zu halten und dann mit 60 ° C min -1 erhöht. HINWEIS: Die maximale Temperatur von 330 ° C für 1,44 min gehalten. </li><li> Injizieren 4 &amp; mgr; l der Probe, mit einem Teilungsverhältnis von 5 schnelle Verflüchtigung und homogene Vermischung mit dem Trägergas Helium zu erhalten. HINWEIS: In Abhängigkeit von der das Substrat und Produkte geben Sie die Gasphase steigender Temperatur. Die Substanzen werden durch das GC / FID-Detektor detektiert, nachdem die Säule an bestimmten Retentionszeiten vorbei und werden als Spitzen auf dem Bildschirm angezeigt. Beachten Sie die Spitzenbildung auf dem Monitor. </li><li> Berechnen der Konzentration des gebildeten Produkts mit der folgenden Formel: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/&gt; HINWEIS: Der Kalibrierungsfaktor durch Berechnung der Standardkurve, die speziell für diese Spalte für jedes Substrat und Produkt aus bekannten Mengen der derivatisierten Substanzen und ihrer entsprechenden Peakfläche bestimmt wurde. </li></ol></li><li> Identifizieren Olefin und β-Hydroxysäure Spitzen durch GC / MS. <ol><li> Identifizieren Olefin und β-Hydroxysäure Spitzen durch GC / MS. Stellen Sie das Temperaturprofil. Stellen Sie die Einspritztemperatur auf 250 ° C. Halten Sie die Ofentemperatur auf 100 ° C für 5 min und anschließend mit 20 ° C min -1 erhöhen. HINWEIS: Die maximale Temperatur wird für 7,5 min gehalten. </li><li> Stellen Sie das Massenspektrometer Detektortemperatur auf 250 ° C und Scan bei 50 bis 500 m / z in Elektronenstoßmodus. HINWEIS: Elektronenstoß-Ionisation entfernt ein einzelnes Elektron, was zur Bildung eines Radikalkations, die für die Massenanalyse weitergeleitet Vorwärts wird. Aufgrund der hohen intramolar Energie kovalente Bindungen innerhalb derMolekül Bruchfragmente niedriger m / z zu schaffen. Diese Fragmente bilden einen Fingerabdruck spezifisch für eine Substanz ist. </li><li> Injizieren 1 &amp; mgr; l der Probe. Erfassen 1-Heptadecen nach 11,4 min Retentionszeit durch den entsprechenden Fingerabdruck (Abbildung 2). </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die lichtgetriebene Erzeugung von Wasserstoffperoxid kann für eine Reihe Redox - Transformationen angewendet werden, einschließlich peroxygenases 3, chloroperoxidases 10 und P450 Monooxygenasen 5. Es ist eine einfache und praktikable Ansatz. Auf lange Sicht, öffnet sich die Verwendung von sichtbarem Licht, die Perspektive auf Sonnenlicht für chemische Umwandlungen zu verwenden, die eine nachhaltige Alternative für energiereiche Reaktionen ist. Das Verfahren ist anwendbar mit gereinigtem Enzym oder mit zellfreien Extrakt. Während letztere weniger Kosten und Arbeit erfordert, sollte es, dass kleine Moleküle in dem Rohextrakt zu beachten, mit dem Licht katalysierte Umsetzung stören können. Eine praktikable Ansatz ist es, diese kleine Bauteile mit einem Mikro (dh durch Zentrifugation in einer Filterzentrifuge Einheit oder durch Dialyse) zu entfernen. Die Konzentration des lichtsammelnden Molekül FMN bestimmt die Konzentration des Wasserstoffperoxids. Je nach affinity der Oxidoreduktase ist diese Konzentration entscheidend für die Enzymaktivität. Ein weiterer wichtiger Faktor ist die Konzentration des Elektronendonors EDTA. Der wichtigste Parameter ist jedoch die Betriebsstabilität und Aktivität des Enzyms. Die Olefinierung von Fettsäuren ist eine elegante Reaktion zur Umwandlung von biobasiertem Fettsäuren in Olefine, die für die chemische Industrie zu den wichtigsten Rohstoffe gehören. Die lichtgetriebene biokatalytische Decarboxylierung kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden und bei neutralem pH-Wert, die klare Vorteile in Bezug auf Nachhaltigkeit bietet. Unsere Ergebnisse zeigen , dass die in situ Erzeugung von Wasserstoffperoxid eine Strategie ist es, den Cofaktor ohne Beeinträchtigung der Enzymstabilität, was zu einer hohen Umwandlung zu liefern. Gegenwärtige Verfahren für Cofactorregenerierung landwirtschaftliche Erzeugnisse oder Benzin-basierten Chemikalien. Lichtgetriebene Reaktionen sind, sich als erneuerbare Alternative. ZukunftForschung wird für die Substitution des Opferreagenz EDTA durch billigere Moleküle und zur Verringerung der Menge der lichtsammelnden Molekül FMN Methoden gewidmet.

Der Klimawandel und die absehbare Erschöpfung der erneuerbaren Ressourcen stellt eine ernsthafte Bedrohung für unsere Gesellschaft. In diesem Zusammenhang stellt der Enzymkatalyse eine noch nicht voll ausgeschöpft Potenzial für die Entwicklung nachhaltiger und &quot;grüner&quot; Chemie 1. Oxidoreduktasen haben die Fähigkeit , die Einführung und Modifizierung von funktionellen Gruppen unter milden Reaktionsbedingungen zu katalysieren und 2 zu den wichtigsten Biokatalysatoren gehören. Die meisten redox Transformationen erfordern die Zufuhr von externer von Cofaktoren wie NAD (P) H. Verfahren zur Cofaktor-Regenerierung wurden in der industriellen Maßstab angewendet. Allerdings führen sie immer noch in hohen Prozesskosten, die ihre Anwendung vor allem auf hochwertige Produkte begrenzt. Interessanterweise akzeptieren mehrere Peroxidasen 3,4 und P450 Monooxygenasen 5 Elektronen von Wasserstoffperoxid über den so genannten Peroxid - Shunt. Während H 2 O 2 eine günstige Co-Reagenz ist, ist es angeblich harmful für viele Enzyme. Eine stetige in - situ - Bildung von niedrigen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid ist eine praktikable Vorgehensweise, die Reaktion anzutreiben, ohne die Betriebsstabilität des Enzyms zu beeinträchtigen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig1.jpg" /> Abbildung 1. Versuchsaufbau der photobiocatalytic Decarboxylierung von Fettsäuren durch OLET JE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Die Verwendung von Licht als Energiequelle für die chemische und biologische Prozesse erhalten hat zunehmende Aufmerksamkeit in den letzten Jahren 6. Lichtgetriebene Erzeugung von Wasserstoffperoxid wurde als einfache und robuste Methode entstanden zu Wasserstoffperoxid für Redox - Transformationen (Abbildung 1) liefern. Ein photokatalytischer wie Flavin-Adenin-mononucleotide (FMN) ermöglicht die Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid, das dann als Cofaktor für die enzymatische Oxyfunktionalisierung Reaktion verwendet wird. Mögliche Elektronendonoren sind Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Ascorbat oder die preiswerte Formiat. Das Verfahren ist allgemein anwendbar für die H 2 O 2 -abhängige Enzyme, einschließlich Peroxidasen 3,4 und P450 Monooxygenasen 5. Wir haben untersucht , kürzlich die Anwendung einer neuen bakteriellen Decarboxylase 7 für die Transformation von natürlichen Fetten in Olefine 8. Dies wäre eine nachhaltige Weg zur Synthese von weit verbreiteten Plattform Chemikalien aus einem bio-basierte Quelle sein. Die Decarboxylase OLET JE aus dem gram-positiven Bakterium Jeotgalicoccus sp. katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Fettsäuren und bildet 1-Alkenen als Produkte. OLET JE ist eng mit bakteriellen P450 Monooxygenasen bezogen und muss Elektronen from Wasserstoffperoxid für die Reaktion. Leider führte die Zugabe von H 2 O 2 zu einer Lösung von Substrat und Enzym in geringen Umsätze und eine schlechte Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, vermutlich aufgrund einer schädlichen Wirkung von Wasserstoffperoxid auf die Stabilität von OLET JE. Die Erzeugung eines Fusionsproteins mit der NADPH-Reduktase RhFred machte eine NADPH-abhängige Decarboxylierung möglich. 9 Dennoch ist der hohe Preis von NADPH und der derzeit begrenzten Möglichkeiten für eine kosteneffiziente Regeneration veranlasste uns , billiger Elektronendonoren zu untersuchen. Inspiriert durch die Ähnlichkeit der OLET JE mit P450 Monooxygenasen, haben wir das Licht katalysierte Erzeugung von H 2 O 2. Wir waren sehr zufrieden hohe Umsätze zu erhalten (bis zu&gt; 95%) unter Verwendung von zellfreien Extrakten oder gereinigten Enzymlösungen. Am Beispiel der Fettsäure Decarboxylierung präsentieren wir ein allgemeines Protokoll für die lichtgetriebene enzymTransformationen atic redox Verwendung FMN als Photokatalysator und Wasserstoffperoxid als Cofaktor. Die vorgestellten Verfahren umfassen die Herstellung des Enzyms in einer rekombinanten Zelle von E. coli, Reinigung des Enzyms, die Anwendung für die Synthese von 1-Alkenen und die Analyse der Reaktionsprodukte.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagenz</td><td>Roth</td><td>K015.1</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90604-29-8</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethylacetat</td><td>Fisher Chemical</td><td>141-78-6</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin-5-monophosphat-Natriumsalzhydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>130-40-5</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloridsäure 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>&delta;-Aminolävulinsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5451-09-2</td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-N-(Trimethylsilyl)trifluoracetamid (MSTFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>24589-78-4</td><td></td></tr><tr><td>Myristinsäure >99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208-875-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Stearinsäure >99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57-11-4</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60-54-8&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD01779855&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Gerät</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Schüttler G-25CK</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ecotron</td><td>Infors HT</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugation</td><td>Labofuge 400R</td><td>Heraeus</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RC 5B Plus</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fresco 17</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugationsrotoren</td><td>SS34</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SLA</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td>Clean bench</td><td>Envirco</td><td>Ceag Schirp Reinraum technik</td><td></td></tr><tr><td>Säule GC-FID&nbsp;</td><td>CP-Sil 5CB (30 m x 0,25&nbsp; mm x 0,25 &Mikro; m)&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Säule GC-MS</td><td>FactorFour Kapillarsäule (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)&nbsp;</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>GC-FID</td><td>GC-2010 plus</td><td>Shimadzu</td><td></td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>IST-40</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührer</td><td>RCT classic</td><td>IKA</td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td>SevenEasy</td><td>Mettler toledo</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Branson Sonifier 250</td><td>Branson</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affinitätschromatographie-Säule</td><td>His Pur Ni-NTA Spin-Säule</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Centricon</td><td>Vivaspin turbo 15</td><td>VWR International</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten</td><td>96 Well Multiply&reg; PCR-Platten</td><td>Sarstedt</td><td></td></tr></tbody></table>

lichtgetriebene enzymatische decarboxylierung

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Oxidoreduktasen gehören zu den am häufigsten angewandten industriellen Enzymen. Dennoch müssen sie externe Elektronen, deren Versorgung ist oft teuer und schwierig. Recycling der Elektronendonoren NADH oder NADPH erfordert die Verwendung von zusätzlichen Enzymen und Opfersubstraten. Interessanterweise akzeptieren mehrere Oxidoreduktasen Wasserstoffperoxid als Elektronendonor. Während kostengünstig sind, reduziert dieses Reagenz oft die Stabilität von Enzymen. Eine Lösung dieses Problems ist die in situ Erzeugung des Cofaktors. Die kontinuierliche Zufuhr des Cofaktors bei niedriger Konzentration treibt die Reaktion ohne die Enzymstabilität zu beeinträchtigen. Dieses Papier zeigt ein Verfahren für die Licht-katalysierten in situ - Erzeugung von Wasserstoffperoxid mit dem Beispiel des Häm-abhängigen Fettsäure Decarboxylase OLET JE. Die Fettsäure-Decarboxylase OLET JE wurde aufgrund seiner einzigartigen Fähigkeit , entdeckt zu langkettigen 1-Alkene aus Fettsäuren produzieren, eine bisher unbekannte enzymatischeReaktion. 1-Alkene sind weit Additive für Weichmacher und Gleitmittel verwendet. OLET JE hat sich gezeigt , Elektronen von Wasserstoffperoxid zum oxidativen Decarboxylierung zu akzeptieren. Während die Zugabe von Wasserstoffperoxid schädigt das Enzym und führt zu geringen Ausbeuten, umgeht in situ - Erzeugung des Cofaktors dieses Problem. Das photobiocatalytic System zeigt deutliche Vorteile in Bezug auf die Enzymaktivität und Ausbeute, was zu einer einfachen und effizienten System für die Fettsäure Decarboxylierung.

Während die Zugabe von Wasserstoffperoxid zu dem Reaktionsgemisch in niedrigen Umwandlungen führte zu moderieren (&lt;10%), erhöht in situ Erzeugung von Wasserstoffperoxid die Umwandlung bis zu 80% Umsatz. Die Analyse durch GC / MS zeigt die Bildung von Olefinen aus Fettsäuren (Abbildung 2). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig2.jpg" /> Abbildung 2 (A) Temperaturprofil für die GC / MS - Messungen. (B) Fingerabdruck des 1-Heptadecen eluierenden nach 11,4 min. (C) Charakteristische sekundären C n H 2n-1 Fragment - Ionen von Terminal exemplarischen Olefinen für 1-Heptadecen gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> E. coli. Eine gereinigte Enzymlösung zeigte eine klare Korrelation zwischen Enzymkonzentration und Umwandlung. Eine Erhöhung der Konzentration des lichtsammelnden Molekül FMN führen zu höheren Umsätzen. Jedoch die Erhöhung der Konzentration von mehr als 10 mM nicht weiter um die Reaktionen zu beschleunigen, was darauf hinweist, dass die Menge an Wasserstoffperoxid ausreichend vorhanden ist und nicht mehr der begrenzende Faktor. Zusätzlich zu der Decarboxylierung von Fettsäuren, OLET JE katalysiert auch eine Hydroxylierung in β-Position. Bei der Umwandlung von Stearinsäure, ist die Decarboxylierung etwa dreimal schneller als die Hydroxylierung. In einem typischen Experiment wurde eine Lösung von 0,5 mM Stearinsäure und 10 &amp; mgr; M FMN, 99% des Substrats unter Verwendung wurden zu einer Mischung aus 1-Heptadecen umgewandelt und 2-Hydroxystearinsäure mit einem Verhältnis von8 1 (3): 3.3. Eine Untersuchung des Substratspektrums der Biokatalyse lichtgetriebenen zeigte , dass Fettsäuren mit längeren Acylketten, OLET JE bevorzugt die Decarboxylierung katalysiert, während die relative Menge an Hydroxyl-Fettsäuren in der Produktmischung mit kürzerer Kettenlänge erhöht. Fettsäuren kürzer als Myristinsäure (C14) hat unterzogen werden nicht Decarboxylierung. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die gaschromatographische Analyse OLET JE -vermittelten Decarboxylierung von Stearinsäure (11.15 min) in 1-Heptadecen (8,4 min), α-Hydroxystearinsäure (12,04 min) β-Hydroxystearinsäure (12,1 min). Die Veränderung der Peakflächen von Proben über einen zeitlichen Verlauf von 2 h genommen wird angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">um</a> die <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">vie</a>wa größere Version dieser Figur. Überraschenderweise zeigen die erfindungsgemäßen ungesättigten Säuren Ölsäure (C18: 1D9 cis) und Linolsäure (C18: 2d9d12) wurden nicht als Substrate akzeptiert, was darauf hinweist , dass die verdrillten Konfiguration cis - Doppelbindungen nicht in einem produktiven Bindungsmodus in dem Enzym untergebracht werden. Zugabe von Ölsäure (10%) verhindert auch die Umwandlung von Stearinsäure. Interessanterweise Stearinsäure: wurde (C18 1D9 trans) durch OLET JE umgewandelt, doch mit etwas geringeren Aktivität dann Stearinsäure.

Wir beschreiben ein Protokoll für die Licht-katalysierte Erzeugung von Wasserstoffperoxid - einen Cofaktor für oxidative Umwandlungen.

Lichtgetriebene enzymatische Decarboxylierung

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, enzymatische Reaktionen mithilfe von sichtbarem Licht anzutreiben. Bei diesem Ansatz wird Licht genutzt, um Fettsäuren unter milden Reaktionsbedingungen in terminale Alkine umzuwandeln. Die Decarboxylierung erfordert das Brechen von C-C-Bindungen.Und diese Bindung ist sehr stabil, was diese Reaktion äußerst schwierig macht. Die Verwendung von Licht stellt einen nachhaltigen Ansatz dar, um eine derart anspruchsvolle Reaktion durchzuführen. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir versuchten, Wasserstoffperoxid direkt der Reaktion zuzusetzen, was zur Inaktivierung der Enzyme führte.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine gleichmäßige Menge an Wasserstoffperoxid liefert. Zunächst verwendeten wir gereinigtes OleT für die lichtgetriebene Biokatalyse, um unser Enzym zu charakterisieren. Später testeten wir auch rohe Extrakte, was für die Entwicklung industrieller Anwendungen wichtig wäre.Nachdem das synthetische OleT-Gen wie im Textprotokoll beschrieben in den Expressionsvektor kloniert und das Plasmid in E. coli transformiert wurde, impfieren Sie die Zellen in zwei Reagenzgläser mit jeweils drei Milliliter LB-Medium, das 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthält. Inkubieren Sie die Vorkulturen 15 Stunden lang in einem Schüttelinkubator. Verdünnen Sie zwei Milliliter der Kultur in je 200 Milliliter LB-Medium mit Ampicillin in zwei Ein-Liter-Flaschen.Inkubieren Sie die Flaschen in einem Schüttelinkubator bei 37 Grad Celsius und 180 U/min, bis die Kulturen eine optische Dichte bei 600 Nanometern zwischen 0,6 und 0,8 erreichen. Fügen Sie anschließend 0,5 Millimolar Delta-Aminolävulinsäure zu den Kulturen hinzu. Induzieren Sie dann die Zellen, indem Sie Tetracyclin in einer Konzentration von 0,2 Mikrogramm pro Milliliter zu den Flaschen hinzufügen.Inkubieren Sie die Kulturen 15 Stunden lang bei 20 Grad Celsius und 180 U/min. Nach der Induktion gießen Sie die Kulturen in Zentrifugenröhrchen um und zentrifugieren diese bei 12000 ×g und 4 Grad Celsius für 20 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand.Suspendieren Sie die Pellets durch Pipettieren in 50 Milliliter eiskalte Tris-Pufferlösung und überführen Sie die Suspension in ein kegelförmiges Zentrifugenröhrchen. Fahren Sie fort, indem Sie bei 4000 × g und 4 °C über 15 Minuten zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie jedes Pellet erneut in drei Milliliter Puffer durch mehrfaches Pipettieren.Lysieren Sie die Zellen durch Beschallung mit drei Zyklen zu je 30 Sekunden, wobei zwischen den Zyklen eine Minute Pause eingelegt wird. Zentrifugieren Sie danach das Lysat bei 15000 × g und 4 °C für 20 Minuten und pipettieren Sie anschließend vorsichtig den zellfreien Extrakt in kegelförmige Zentrifugenröhrchen. Zur Herstellung des Rohextrakts für die lichtgetriebene Biokatalyse übertragen Sie drei Milliliter eines zellfreien Extrakts auf einen 10-Kilodalton-Zentrifugenfilter und zentrifugieren bei 4000 × g und 4 °C, um kleine Moleküle zu entfernen.Suspendieren Sie das Protein in drei Milliliter Tris erneut. Um die Aktivität von OleT in der lichtgetriebenen Biokatalyse zu charakterisieren, muss das Protein gereinigt werden. Beginnen Sie die Proteinreinigung, indem Sie drei Milliliter des zellfreien Extrakts auf equilibrierte Nickel-NTA-Spin-Säulen auftragen.Die Säulen mit unteren Stopfen und Schraubkappen verschließen und leicht schütteln, bis das Harz gleichmäßig verteilt ist. Danach die Säulen in einem Überkopfschüttler inkubieren. Danach die Säule zentrifugieren. Anschließend die Säulen reinigen, indem man einen Milliliter Waschpuffer hinzufügt und zwei Minuten bei 700 ×g zentrifugiert. Den Waschschritt insgesamt dreimal durchführen.Nach dem Waschen die Säulen in kegelförmige Zentrifugenröhrchen geben und je einen Milliliter Elutionspuffer zu jeder Säule hinzufügen. Die Röhrchen zwei Minuten lang mit 700 × g zentrifugieren und die Elution insgesamt dreimal wiederholen. Die vereinigten Säuleneluate in einen Zentrifugenfilter mit 10 Kilodalton Porengröße geben und bei 4000 × g und 4 °C zentrifugieren, um das für die Elution verwendete Imidazol vom Enzym zu trennen.Bestimmen Sie abschließend die Proteinreinheit und -konzentration, wie im Textprotokoll angegeben. Um die Bio-Transformationsprozedur zu beginnen, geben Sie zunächst 10 % eines Tensids wie Tergitol und 28,4 Milligramm Stearinsäure zu destilliertem Wasser, um 10 Milliliter einer 10-Millimolar-Stammlösung herzustellen. Erhitzen Sie die Lösung in einer Heizkammer bei 60 Grad Celsius, bis die Stearinsäure vollständig gelöst ist.Verwenden Sie diese Lösung, um gemäß dem folgenden Protokoll ein Reaktionsgemisch herzustellen. Geben Sie FMN, EDTA, Puffer und Stearinsäure in zwei klare Glasröhrchen und rühren Sie in einem Wasserbad bei 25 °C um. Fügen Sie anschließend 200 µg/mL des gereinigten Enzyms oder des Rohextrakts den Röhrchen hinzu.Und beleuchten Sie sie mit einer klaren LED-Lampe aus einer Entfernung von zwei Zentimetern. Nehmen Sie anschließend 200 µL-Proben zu bestimmten Zeitpunkten in Röhrchen, die vorab mit 20 µL 37 %iger Salzsäure gefüllt wurden, um die Reaktionen zu stoppen. Fügen Sie danach fünf µL einer 10 mmolaren Myristinsäure-Lösung als internen Standard zu jeder Probe hinzu.Um die Reaktionsprodukte zu analysieren, geben Sie zweimal jeweils 500&nbsp;Mikroliter Ethylacetat zu den Röhrchen hinzu. Drehen Sie die Röhrchen vorsichtig um, um sie zu mischen, und zentrifugieren Sie sie eine Minute lang bei 13.000&nbsp;×&nbsp;g. Danach überführen Sie 400&nbsp;Mikroliter der Überstände in Mikrozentrifugenröhrchen und verdampfen sie vollständig, indem Sie vorsichtig mit Druckluft auf die Röhrchen blasen. Geben Sie anschließend 200&nbsp;Mikroliter MSTFA zu den Röhrchen hinzu.Anschießend die Mischung 30 Minuten lang bei 60 Grad Celsius inkubieren, um die Proben vor der Analyse zu derivatisieren. Die Reaktionsprodukte analysieren, indem eine vier Mikroliter Probe in ein mit einem Flammenionisationsdetektor ausgestattetes Gaschromatographiegerät injiziert wird, das dem im Textprotokoll beschriebenen Temperaturprofil folgt. Danach das Verhältnis von Heptadecan und gebildeter Beta-Hydroxysäure in jeder Reaktionsprobe mittels Gaschromatographie gekoppelt mit einem Massenspektrometer bestimmen.Verwenden Sie die im Textprotokoll beschriebenen Ofentemperatur- und Massenspektrometer-Einstellungen. Injizieren Sie je ein Mikroliter jeder Probe in den Gaschromatographen und nehmen Sie das Chromatogramm auf. Überwachen Sie abschließend die GC-MS-Chromatogramme jeder Probe und analysieren Sie diese gemäß dem Herstellerprotokoll.Die molaren Massen der Produkte aus den enzymatischen Reaktionen wurden mittels eines mit einem Massenspektrometer gekoppelten Gaschromatographen bestimmt. Bei Fettsäuren mit längeren Acylketten katalysiert das Enzym OleT bevorzugt deren Decarboxylierung zu Olefinen unterschiedlicher Länge. Proben aus der Biotransformationsreaktion wurden mittels eines mit einem Flammen-Ionisationsdetektor ausgestatteten Gaschromatographen analysiert.Die Decarboxylierung der Stearinsäure erfolgte dreimal schneller als die Hydroxylierungsreaktion, wobei 99 % der Stearinsäure in ein Gemisch aus Heptadecan und 2-Hydroxy-Stearinsäure im Verhältnis 3,3:1 umgesetzt wurden. Sobald die lichtgetriebene Biokatalyse beherrscht ist, kann sie innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Lichtkatalyse besteht die Herausforderung darin, nützliche Reaktionen mit der Lichtnutzung zu verknüpfen.In unserem Fall haben wir das Licht innerhalb des Moleküls FMN als Photosensibilisator und verbinden es mit unserem Enzym über ein Transfermolekül, das Wasserstoffperoxid ist.

Research

Forschung

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Chemistry

Chemie

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Lichtgetriebene enzymatische Decarboxylierung

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