Lichtgetriebene enzymatische Decarboxylierung

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, enzymatische Reaktionen mit sichtbarem Licht anzutreiben. Bei diesem Ansatz wird Licht verwendet, um Fettsäuren unter milden Reaktionsbedingungen in terminale Alkine umzuwandeln. Die Decarboxylierung erfordert das Aufbrechen von CC-Bindungen.

Und diese Bindung ist sehr stabil, was die Reaktion sehr schwierig macht. Der Einsatz von Licht ist ein nachhaltiger Ansatz, um eine solch schwierige Reaktion zu erreichen. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir versuchten, Wasserstoffperoxid direkt in die Reaktion einzubringen, was zu einer Inaktivierung der Enzyme führte.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine stetige Menge an Wasserstoffperoxid liefert. Zunächst verwendeten wir gereinigtes OleT für die lichtgetriebene Biokatalyse, um unser Enzym zu charakterisieren. Später haben wir auch Rohextrakte getestet, die für die Entwicklung industrieller Anwendungen wichtig sein sollten.

Nach der Klonierung des synthetischen OleT-Gens in den Expressionsvektor und der Umwandlung des Plasmids in E.Coli, wie im Textprotokoll beschrieben, inokulieren die Zellen in zwei Reagenzgläsern, die drei Milliliter LB-Medium enthalten, mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin. Inkubieren Sie die Vorkulturen 15 Stunden lang in einem Shaker. Zwei Milliliter der Kultur werden in 200 Milliliter LB mit Ampicillin in zwei Ein-Liter-Kolben verdünnt.

Inkubieren Sie die Kolben in einem Schüttler bei 37 Grad Celsius und 180 U/min, bis die Kulturen eine optische Dichte bei 600 Nanometern zwischen 0,6 und 0,8 erreichen. Als nächstes fügen Sie den Kulturen 0,5 Millimolar Delta-Aminolävulinsäure hinzu. Und dann induzieren Sie die Zellen, indem Sie Tetracyclin in einer Menge von 0,2 Mikrogramm pro Milliliter in die Kolben geben.

Inkubieren Sie die Kulturen 15 Stunden lang bei 20 Grad Celsius und 180 U/min. Nach der Induktion die Kulturen in Zentrifugenröhrchen umfüllen und die Röhrchen bei 12000 mal G und vier Grad Celsius für 20 Minuten zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand.

Resuspendieren Sie die Pellets, indem Sie 50 Milliliter eiskalten Tris-Puffer einpipettieren und die Suspension in ein konisches Zentrifugenröhrchen überführen. Fahren Sie fort, indem Sie 15 Minuten lang bei 4000 G und vier Grad Celsius zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie jedes Pellet in drei Millilitern Puffer durch wiederholtes Pipettieren.

Lysieren Sie die Zellen durch Beschallung mit drei 30-Sekunden-Zyklen, wobei Sie zwischen den Zyklen eine Minute lang pausieren. Als nächstes zentrifugieren Sie das Lysat bei 15000 mal G und vier Grad Celsius für 20 Minuten und pipettieren Sie dann den zellfreien Extrakt vorsichtig in konische Zentrifugenröhrchen. Zur Aufbereitung des Rohextrakts für die lichtgetriebene Biokatalyse werden drei Milliliter eines zellfreien Extrakts in einen 10-Kilodalton-Zentrifugenfilter überführt und bei 4000 mal G bei vier Grad Celsius zentrifugiert, um kleine Moleküle zu entfernen.

Resuspendieren Sie das Protein in drei Millilitern Tris. Um die Aktivität von OleT in der lichtgetriebenen Biokatalyse zu charakterisieren, muss das Protein gereinigt werden. Um die Proteinreinigung zu starten, laden Sie drei Milliliter des zellfreien Extrakts auf äquilibrierte Nickel-NTA-Spin-Säulen

Verschließen Sie die Säulen mit Bodenstopfen und Schraubverschlüssen. Und schütteln Sie sie leicht, bis das Harz gleichmäßig verteilt ist. Fahren Sie fort, indem Sie die Säulen in einem Überkopfschüttler inkubieren.

Dann zentrifugieren Sie die Säule. Waschen Sie anschließend die Säulen, indem Sie einen Milliliter Waschpuffer hinzufügen und sie zwei Minuten lang bei 700 mal G zentrifugieren. Wiederholen Sie den Waschgang noch zweimal.

Legen Sie die Säulen nach dem Waschen in konische Zentrifugenröhrchen und geben Sie einen Milliliter Elutionspuffer in jede Säule. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 700-fachem G für zwei Minuten und wiederholen Sie die Elution noch zweimal. Geben Sie die kombinierten Säulenextrakte in einen 10-Kilodalton-Zentrifugenfilter und zentrifugieren Sie ihn bei 4000 G und vier Grad Celsius, um das für die Elution verwendete Imidazol vom Enzym zu trennen.

Bestimmen Sie abschließend die Reinheit und Konzentration des Proteins, wie im Textprotokoll angegeben. Um den Bioumwandlungsprozess zu starten, fügen Sie zunächst 10 % eines Tensids wie Tergitol und 28,4 Milligramm Stearinsäure zu destilliertem Wasser hinzu, um 10 Milliliter einer 10 Millimolare Stammlösung herzustellen. Erhitzen Sie die Lösung in einer Heizkammer bei 60 Grad Celsius, bis sich die Stearinsäure vollständig aufgelöst hat.

Verwenden Sie diese Lösung, um ein Reaktionsgemisch gemäß dem nächsten Protokoll herzustellen. FMN, EDTA, Puffer und Stearinsäure in zwei Klarglasröhrchen geben und in einem Wasserbad bei 25 Grad Celsius einrühren. Fahren Sie fort, indem Sie 200 Mikrogramm pro Milliliter des gereinigten Enzyms oder Rohextrakts in die Röhrchen geben.

Und beleuchten Sie sie mit einer klaren LED-Glühbirne in einem Abstand von zwei Zentimetern. Nehmen Sie anschließend 200 Mikroliter Proben zu bestimmten Zeitpunkten in Röhrchen, die mit 20 Mikrolitern 37%iger Salzsäure vorgefüllt sind, um die Reaktionen zu stoppen. Geben Sie dann fünf Mikroliter einer 10 millimolaren Myristinsäurelösung als internen Standard zu jeder Probe.

Um die Reaktionsprodukte zu analysieren, geben Sie zweimal 500 Mikroliter Ethylacetat in die Röhrchen. Drehen Sie die Röhrchen um, um sie zu mischen, und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 13.000 mal G. Übertragen Sie anschließend 400 Mikroliter der Überstände in Mikrozentrifugenröhrchen und verdampfen Sie sie vollständig, indem Sie die Röhrchen vorsichtig mit Druckluft anblasen. Geben Sie 200 Mikroliter MSTFA in die Röhrchen.

Und inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei 60 Grad Celsius, um die Proben vor der Analyse zu derivatisieren. Analysieren Sie die Reaktionsprodukte, indem Sie eine vier Mikroliter große Probe in einen Gaschromatographen injizieren, der mit einem Flammenionisationsdetektor ausgestattet ist, wobei das im Textprotokoll beschriebene Temperaturprofil verwendet wird. Als nächstes wird das Verhältnis von einem Heptadecan und einer Beta-Hydroxysäure, die in jeder Reaktionsprobe gebildet werden, mit einem Gaschromatographen bestimmt, der mit einem Massenspektrometer gekoppelt ist.

Verwenden Sie die Einstellungen für die Ofentemperatur und das Massenspektrometer, wie im Textprotokoll beschrieben. Injizieren Sie einen Mikroliter jeder Probe in den Gaschromatographen und zeichnen Sie das Chromatogramm auf. Überwachen Sie abschließend die GCMS-Chromatogramme für jede Probe und analysieren Sie sie gemäß dem Protokoll des Herstellers.

Die Molekulargewichte der Produkte aus den enzymatischen Reaktionen wurden mit Hilfe eines Gaschromatographen bestimmt, der mit einem Massenspektrometer gekoppelt war. Bei Fettsäuren mit längeren Acylketten katalysiert das Enzym OleT bevorzugt deren Decarboxylierung zu Olefinen unterschiedlicher Länge. Die Proben aus der Biotransformationsreaktion wurden mit einem Gaschromatographen analysiert, der mit einem Flammenionisationsdetektor ausgestattet war.

Es wurde gezeigt, dass die Decarboxylierung der Stearinsäure dreimal schneller abläuft als die Hydroxylierungsreaktion, wobei 99 % der Stearinsäure in ein 3,3:1-Gemisch aus einem Heptadecan und 2-Hydroxystearinsäure umgewandelt werden. Einmal gemeistert, kann die lichtgetriebene Biokatalyse in wenigen Stunden durchgeführt werden, wenn ich richtig abschneide. Bei der Lichtkatalyse besteht die Herausforderung darin, nützliche Reaktionen mit der Ernte des Lichts zu verknüpfen.

In unserem Fall haben wir das Licht im Molekül FMN als Photosensibilisator und verknüpfen es über ein Transfermolekül, das Wasserstoffperoxid ist, mit unserem Enzym