Name: Eine hohe Ausbeute und kosteneffiziente Expression System der Menschen Granzyme in Säugerzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Erfahren Sie eine kosteneffiziente Methode zur Expression von Granzymen in HEK293T-Zellen mit hoher Ausbeute. Dieses System liefert vollständig glykosylierte und enzymatisch aktive Proteasen für die Immunforschung.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Novartis Stiftung für medizinisch-biologische Forschung und des Forschungspools der Universität Freiburg (an MW) unterstützt. Wir danken Li Zhao, Zhan Xu und Solange Kharoubi Hess für die technische Unterstützung sowie Radu Aricescu und Yvonne Jones (Oxford University, UK) für die Bereitstellung des pHLsec-Plasmids und Thomas Schürpf (Harvard Medical School) für hilfreiche Gespräche.

1. Herstellung des Expressionsplasmids pHLsec-GZM <ol><li> Bereiten Gesamt-RNA aus menschlichen NK-Zellen (Primärzellen, wie in 26 oder der NK-Zelllinie NK-92 exprimieren, alle fünf menschlichen Gzms hergestellt) mit einer geeigneten RNA-Isolierungsverfahren und Umkehr transcribe unter Verwendung eines ersten cDNA synthetisieren Satz, nach dem manufacturer` s Empfehlungen. Verstärken GZM cDNA mittels PCR und Klon in pHLsec wie in 23 (Art Geschenk der Radu Aricescu und Yvonne Jones, University of Oxford, UK) beschrieben mit den AgeI und KpnI-Stellen (Abbildung 1). HINWEIS: Verwenden Sie die folgenden in Tabelle 1 angegebenen Primer. </li><li> Bestätigen richtigen Inserts durch Sequenzierung. Erweitern Sie die Expressionsplasmide in DH5a-Zellen und zu reinigen mit einem Endotoxin-freiem Plasmidisolierung Satz und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers. </li><li> Resuspendieren der gereinigten Plasmide in Endotoxin-freiem, sterilem Wasser bei einer Konzentration von 2 mg / ml und bei -20 ° C until Einsatz. </li></ol> 2. Expression von Gzms in HEK293T-Zellen <ol><li> Zubereitung von Reagenzien <ol><li> Bereiten Standardkulturmedium. In Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glucosegehalt (25 mM), Glutamax (4 mM), Natriumpyruvat (1 mM) in 10% der Standard fötalem Kälberserum (FCS), Penicillin (100 Einheiten / ml), Streptomycin ( 100 ug / ml). </li><li> Bereiten Transfektionsmedium. Um Kulturmedium ohne Penicillin-Streptomycin hinzufügen 25 ug / ml Chloroquin (Add frisch am Tag der Transfektion von 1,000x Aktien in PBS, bei -20 ° C gelagert). </li><li> Vorbereitung serumfreien Kulturmedium: Zu einem serumfreien Medium für HEK293 Zellen hinzuzufügen Glutamin (4 mM), Penicillin (100 Einheiten / ml), Streptomycin (100 ug / ml) und 2,5 mg / l Amphotericin B. </li><li> Herzustellen, die in Tabelle 2 und der Filter mit einem 0,45 um Filter vor der Verwendung beschriebenen Lösungen: </li></ol></li><li> Ausbau HEK293T-Zellen <ol><li> Wachsen HEK293T-Zellen in 20 ml Kulture Medium unter Verwendung von 150 x 25 mm-Gewebekulturschalen. </li><li> Split-Zellen bei 80% Konfluenz (Split-Verhältnis von 1: 4, in der Regel jeden 3. Tag). Zellen lose befestigen, sie mechanisch ohne Trypsinierung abgelöst werden kann durch eine konsequente Auf- und Abpipettieren. </li><li> Plattenzellen in der Nacht vor der Transfektion auf 60-70% Konfluenz am Tag der Transfektion (Aussaatdichte ~ 2 x 10 5 Zellen / ml) zu ergeben. Eine übliche Vorbereitung Größe besteht aus 20 bis 25 Kulturschalen. </li></ol></li><li> Calciumphosphat-Transfektion <ol><li> 1 Stunde vor der Transfektion, ändern Sie die Standard-Kulturmedium auf 20 ml Transfektionsmedium. Kurz vor dem Ende dieser 1 h Inkubationsschritt mischen 400 ug Plasmid-DNA mit 10,95 ml ddH 2 0 und 1,55 ml 2 M CaCl 2 in 50-ml-Röhrchen (1 Röhrchen / 5 Gerichte). </li><li> 1 bis 2 min vor der Transfektion wurden anschließend 12,5 ml 2x HBS bis 12,5 ml der DNA-Calcium-Lösung, Mischung durch Umdrehen der Röhrchen und Inkubation für 30 s bei RT. </li><li> In the-Gemisch in 2.3.2 direkt auf die Zellen (5 ml pro Schale), tropfenweise in das Medium. Streuen gleichmäßig über die gesamte Fläche, Drehen des Mediums auf eine leicht orange Farbe. </li><li> Die Kulturschalen inkubieren 7-11 h in einem Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2 in angefeuchteter Luft). Nach der Inkubation ist ein feiner Niederschlag sichtbar. Entfernen Sie das Transfektionsmedium gründlich vorsichtig mit vorgewärmten PBS und 20 ml Serum-freiem Kulturmedium in 2.1.3 vorbereitet. Inkubiere für 72 h in einem Brutschrank. </li><li> Analyse der Transfektion und Expressionseffizienz, indem eine Probe (~ 20 &amp; mgr; l) der Zellüberstand auf SDS-PAGE und Färbung mit Coomassie Brilliant Blue, ein Granzym Band visualisieren. </li></ol></li><li> Reinigung von Gzms aus Kulturüberstand von Nickel-IMAC <ol><li> Nach der Inkubation dekantieren die Zellkulturüberstände in 250-ml-Röhrchen und klar durch Zentrifugation. Führen Sie eine erste Spin (400 g, 10 min, 4 °C), die das Medium von abgelösten Zellen löschen wird. Den Überstand in frische 250 ml-Röhrchen und Schleudern bei 4000 xg, 30 min bei 4 ° C, um alle verbleibenden Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> 5 ml 5 M NaCl, 6,25 ml 2 M Tris-Base (pH 8) und 1 ml von 0,25 M NiSO 4 pro 250 ml der geklärten Überstand. Den Überstand unter Verwendung eines 500 ml Vakuum-Filtereinheit (0,45 mm). </li><li> Äquilibrieren eine Nickel-IMAC-Säule mit His-Bindungspuffer A (10 Säulenvolumen, CV) mit einem geeigneten FPLC-System. </li><li> Gelten die geklärte Überstand auf die äquilibrierte Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml / min bei 4 ° C. </li><li> Nachdem der Überstand aufgebracht wurde, Waschsäule mit His-Bindungspuffer, bis die UV-Absorption Basislinie erreicht ist (normalerweise 10 CV). </li><li> Eluieren Gzms mit einem linearen 20 ml-Gradienten (0 bis 250 mM Imidazol) bei einer Flussrate von 0,5 ml / min, während das Sammeln 2 ml-Fraktionen. Analyse der Elutionsfraktionen durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung. </li></ol></li><li> Enterokinase (EK)Behandlung und Endreinigung durch Kationenaustauschchromatographie <ol><li> Pool GZM haltigen Fraktionen in einem Dialyseschlauch mit ≤10 MWCO. Bewahren Sie eine kleine Probe bei -20 ° C als Pre-EK Kontrolle. </li><li> In EK bei 0,02 Einheiten / 50 ml anfänglichen Überstand direkt auf die vereinigte Fraktion im Dialyseschlauch dialysiert und O / N (mindestens 16 h) bei RT in EK-Puffer (4 L, ändern Puffer einmal). </li><li> Am nächsten Tag analysiert EK behandelt Gzms im Vergleich zur vorge EK Kontrolle durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung. </li><li> Wenn N-terminale Verarbeitung abgeschlossen ist, ändern Dialysepuffer auf S Puffer A (4 l) dialysiert und für weitere 4 h bei RT. Filter Dialysat (0,45 um). </li><li> Äquilibrieren eine S-S-Säule mit Puffer A. Laden der Probe auf die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml / min bei 4 ° C. </li><li> Nach der Probenbeladung, waschen Sie die Säule mit S-Puffer A, bis die UV-Absorption Basislinie erreicht ist (ca. 10 CV). Eluieren die Gzms mit einer 30 ml linearen Gradienten (150 bis 1000 mM NaCl). GZMA eLauten bei ~ 650 mM NaCl, GzmB bei ~ 700 mM NaCl und GzmM bei ~ 750 mM NaCl. </li><li> Analysieren Elutionsfraktionen durch SDS-PAGE und kolorimetrische Assays (siehe unten). Pool enthaltenden Fraktionen Gzms und Konzentrat (etwa 30-fach, auf eine Konzentration von etwa 100 uM) in Spinfilter (15 ml, 10 MWCO). Aliquot der konzentrierten GZM Vorbereitungen und bei -80 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Prüfung GZM Aktivität <ol><li> Zubereitung von Reagenzien <ol><li> Vorbereitung kolorimetrischen Assay-Puffer: 50 mM Tris-Base, pH 7. <ol><li> Für die Messung der GZMA fügen Na-CBZ-L-Lysin thiobenzyl ester (S-Bzl) (BLT) mit dem Assay-Puffer auf eine Endkonzentration von 0,2 mM und 5,5&#39;-Dithio-bis (2-nitrobenzoesäure) (DTNB) in einer Konzentration von 0,22 mM. Für GzmB umfassen 0,2 mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) und 0,22 mM DTNB. Für GzmM umfassen 0,2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-Nitroanilid (pNA) (AAPL). Synthetische Peptide werden von entsprechenden Stammlösungen in DMSO (, stored bei -20 ° C) zu dem Puffer frisch vor dem Assay. </li></ol></li><li> Vorbereitung Spaltungstestpuffer: 100 mM NaCl, 50 mM Tris-Base, pH 7,5 </li></ol></li><li> Kolorimetrische Assays <ol><li> Verteilen Sie kleine GZM Proben (&lt;5 &amp; mgr; l) von Elutionsfraktionen oder konzentrierte Aktien in den 96-Loch-Flachbodenplatten. Fügen Sie eine positive Kontrolle (getestet GZM Zubereitungen oder rohe NK Zell-Lysate) und eine Negativkontrolle (nur Puffer). </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l Assay-Puffer in jede Vertiefung (unter Verwendung einer Mehrkanalpipette). Inkubieren für 10 min bei 37 ° C. Messen der OD bei 405 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät. </li></ol></li><li> Spaltungsassay <ol><li> Für Spaltungs-Assays unter Verwendung von gereinigten Substrate, Co-Inkubation ein Protein-Substrat (native oder rekombinante, 100-400 nM; einige Beispiele für effiziente GZM Substrate werden in der Ergebnisbereich und in dem Hinweis am Ende dieses Abschnitts dargestellt) mit seriellen Verdünnungen einer GZM (beginnend bei 400 nM) in Assay-Puffer für verschiedene Zeiten.Analyse durch SDS-PAGE und Silberfärbung oder Coomassie; oder durch Western-Blot unter Verwendung spezifischer Antikörper. </li><li> Zur Abspaltung Assays unter Verwendung Zelllysaten auszusetzen 10 6 HeLa-Zellen (oder einen beliebigen verfügbaren Tumorzelllinie) in 1 ml Testpuffer und Lyse durch Einfrieren in einem Ethanol / Trockeneis-Bad und Auftauen bei 37 ° C dreimal. Entfernen von Zelltrümmern durch Zentrifugation (15.000 × g für 10 min bei 4 ° C). </li><li> Co-Inkubation mit dem geklärten Lysat Gzms in verschiedenen Konzentrationen und Zeiten wie oben. Spaltung wird durch Immunoblotting unter Verwendung von geeigneten Antikörpern nachgewiesen. HINWEIS: Einige Beispiele für Bona-fide-Substrate, für die kommerzielle Antikörper verfügbar sind: Bid (BH3-Domäne interagieren Tod Agonist) und Caspase 3 durch GzmB 27,28 gespalten; mehrere heterogene Kern Ribonukleoproteine ​​(hnRNPA1, A2 und U) durch GZMA 29 gespalten wird; Cytomegalovirus Phosphoprotein 71 durch GzmM 30. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die klassische und ausgiebig untersucht Rolle GZMA und GzmB ist die Induktion von Apoptose in Säugetierzellen nach ihrer zytosolischen Lieferung durch den porenbildendes Protein PFN 1. Kürzlich wurde die zytotoxische Spektrum der Gzms signifikant von Säugetierzellen, Bakterien 9,10 sowie bestimmte Parasiten 11 verbreitert. Darüber hinaus sind die nicht-klassischen, extrazelluläre Funktionen GZMA und GzmB sowie die biologische Bedeutung der verschiedenen Waisen Gzms noch unklar. Daher ist...

Die Gzms sind eine Familie von hoch homologen Serinproteasen in spezialisierten Lysosomen von CTL und NK-Zellen 1 lokalisiert. Die zytotoxischen Granula dieser Killerzellen enthalten auch die Membran-störenden Proteinen PFN und GNLY, die gleichzeitig mit den Gzms bei Erkennung einer Zielzelle für die Eliminierung 2,3 bestimmt werden freigegeben. Es gibt fünf Gzms beim Menschen (GZMA, B, H, K und M) und 10 Gzms in Mäusen (GZMA - G, K, M und N). GZMA und GzmB sind die häufigsten und umfassend in Menschen und Mäusen 1 untersucht. Allerdings haben neuere Studien begonnen, die Zelltod Wege sowie die zusätzlichen biologischen Wirkungen von den anderen, so genannten Orphan-Gzms in Gesundheit und Krankheit 4 vermittelt zu untersuchen. Das am besten bekannte Funktion der Gzms, insbesondere GZMA und GzmB, ist die Induktion von programmiertem Zelltod in Säugerzellen, wenn sie von PFN 5,6 in die Zielzellen geliefert. JedochZeigten neuere Studien auch extrazelluläre Effekte der Gzms mit tiefgreifenden Auswirkungen auf die Immunregulation und Entzündungen, unabhängig von zytosolischen Lieferung durch PFN 7,8. Das Spektrum von Zellen, die effizient nach cytosolischen Eingabe der Gzms getötet wurde vor kurzem auch aus Säugerzellen, Bakterien 9,10 und sogar bestimmte Parasiten 11 verbreitert. Diese jüngsten Entdeckungen auf ein ganz neues Feld für GZM Forscher eröffnet. Daher wird eine kostengünstige, High-Yield-Säugetier-Expressionssystem deutlich den Weg für die künftige Studien erleichtern. Nativen menschlichen, Maus und Ratte Gzms wurden erfolgreich aus der Kornfraktion von CTL und NK-Zellen Linien 12-14 gereinigt. Jedoch in unseren Händen die Ausbeute solcher Reinigungsverfahren ist in dem Bereich von weniger als 0,1 mg / l Zellkultur (unveröffentlichte Beobachtung und 12). Darüber hinaus die chromatographische Auflösung eines einzelnen GZM ohne Verunreinigung durch other Gzms und / oder Proteine, die ebenfalls vorhanden sind, in den Granulaten ist eine Herausforderung (unveröffentlichte Daten und 12,14). Rekombinante Gzms wurden Bakterien 15, Hefe 16, Insektenzellen 17 und auch in Säugerzellen, wie HEK 293 18,19 hergestellt. Nur die Säugetier-Expressionssysteme tragen das Potenzial, rekombinanten Enzyme mit posttranslationalen Modifikationen identisch mit dem nativen zytotoxischen Protein zu produzieren. Posttranslationale Modifikationen der spezifischen Aufnahme durch Endozytose und die intrazelluläre Lokalisation der Protease in Zielzellen 20-22 gebracht. Daher kann unter Verwendung pHLsec 23 (ein freundliches Geschenk von Radu Aricescu und Yvonne Jones, University of Oxford, UK) als Plasmidrückgrat für GZM Ausdruck haben wir ein einfaches, zeit- und kosteneffizientes System für High-Yield-Proteinproduktion in HEK293T-Zellen. pHLsec kombiniert eine CMV-Enhancer mit einem Huhn Β-Actin-Promotor; Zusammen bilden diese Elemente Demonstrationented der stärkste Promotor-Aktivität in verschiedenen Zelllinien 24. Zusätzlich enthält das Plasmid ein Kaninchen Β-Globin-Intron, optimierte Kozak und Sekretionssignalen, einen Lys-6xHis-Tag und einem Poly-A-Signal. Inserts können bequem zwischen dem Sekretionssignal und dem Lys-6xHis-tag (Abbildung 1) eine optimale Expression und Sekretion Effizienz für Proteine ​​fehlen geeignete N-terminalen Domänen geklont werden. Für die Expression der Gzms, die endogene Sekretionssignal-Sequenz mit dem Sekretionssignal von dem Vektor, gefolgt von einer Enterokinase (EK) Website (DDDDK) versehen ist, so dass wir ersetzt EK Behandlung aktiviert die sezernierten Gzms (aktiv Gzms beginnen mit dem N-terminalen Aminosäuresequenz IIGG 25). Zusätzlich zugunsten für dieses Verfahren, HEK293T Zellen schnell wachsen in günstiges Medium, wie Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und sind für eine kosteneffiziente Calciumphosphat-Transfektionsverfahren gut geeignet.

<table><tbody><tr><td>TRIzol-Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Gesamt-RNA-Isolationskit</td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transkriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>EX-CELL 293 serumfreies Medium für HEK 293 Zellen</td><td>Sigma</td><td>14571C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX Supplement, Pyruvat</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin Dialyseschlauch, 10K MWCO</td><td>Thermo Scientific</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>Enterokinase aus dem Rinderdarm</td><td>Sigma</td><td>E4906</td><td>rekombinant, &ge 20&nbsp; Einheiten/mg Protein</td></tr><tr><td>HisTrap Excel 5 ml Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>17-3712-06&nbsp;</td><td>Nickel IMAC</td></tr><tr><td>HiTrap SP HP 5 ml Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1152-01&nbsp;</td><td>S-Spalte</td></tr><tr><td>N-&alpha;-Cbz-L-Lysin thiobenzylester (BLT)</td><td>Sigma</td><td>C3647</td><td>GzmA Substrat</td></tr><tr><td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)</td><td>MP Biomedicals</td><td>2193608 _10mg</td><td>GzmB Substrat</td></tr><tr><td>Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilid (AAPL)</td><td>Bachem</td><td></td><td>GzmM Substrat</td></tr><tr><td>5,5&prime;-dithio-bis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB)</td><td>Sigma</td><td>D8130</td><td>Ellmans Reagenz</td></tr></tbody></table>

eine hohe ausbeute und kosteneffiziente expression system der menschen granzyme in säugerzellen

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

Wenn zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) oder natürliche Killerzellen (NK) Tumorzellen oder Zellen, die mit intrazellulären Krankheitserregern infiziert sind, erkennen, setzen sie ihren zytotoxischen Granulatgehalt frei, um die Zielzellen und den intrazellulären Erreger zu eliminieren. Der Tod der Wirtszellen und intrazellulären Krankheitserreger wird durch die granulären Serinproteasen, Granzyme (Gzms), ausgelöst, die durch das porenbildende Protein Perforin (PFN) in das Zytosol der Wirtszelle und durch das prokaryotische membranstörende Protein Granulysin (GNLY) in bakterielle Krankheitserreger abgegeben werden. Um die molekularen Mechanismen des durch das Gzms vermittelten Zielzelltods in experimentellen in-vitro-Settings zu untersuchen, sind Proteinexpressions- und Reinigungssysteme notwendig, die hohe Mengen an aktiven Enzymen produzieren. Sekretierte Proteinexpressionssysteme von Säugetieren implizieren das Potenzial, korrekt gefaltetes, voll funktionsfähiges Protein zu produzieren, das posttranslationale Modifikationen, wie z. B. Glykosylierung, aufweist. Daher haben wir eine kosteneffiziente Calciumfällungsmethode zur transienten Transfektion von HEK293T Zellen mit humanen Gzms verwendet, die in das Expressionsplasmid pHLsec kloniert wurden. Die Gzm-Aufreinigung aus dem Kulturüberstand wurde durch immobilisierte Nickelaffinitätschromatographie unter Verwendung des C-terminalen Polyhistidin-Tags erreicht, der vom Vektor bereitgestellt wurde. Die Insertion einer Enterokinase-Stelle am N-Terminus des Proteins ermöglichte die Erzeugung einer aktiven Protease, die schließlich durch Kationenaustauschchromatographie aufgereinigt wurde. Das System wurde getestet, indem es hohe Mengen an zytotoxischen humanen Gzm A, B und M produzierte und sollte in der Lage sein, praktisch jedes Enzym im menschlichen Körper in hohen Ausbeuten zu produzieren.

Im folgenden Abschnitt werden wir eine vollständige Dokumentation eines GZMA Vorbereitung zu präsentieren, um die Methode zu beleuchten. Wir haben auch erfolgreich gereinigt GzmB und GzmM, die ähnliche Ergebnisse in Bezug auf Reinigungsleistung und Aktivität. Doch von diesen später Vorbereitungen werden wir nur zeigen einige ausgewählte Stücke von Daten. Wurden GzmB Präparate aus 293T-Zellen nach dem aktuellen Protokoll in mehreren veröffentlichten Studien verwendet, Hervorhebung ihrer Tätigkeit in verschiedenen biologi...

Wir beschreiben hier ein kosteneffizientes Granzym-Expressionssystem mit HEK293T Zellen, das hohe Ausbeuten an reiner, vollständig glykosylierter und enzymatisch aktiver Protease produziert.

Eine hohe Ausbeute und kosteneffiziente Expression System der Menschen Granzyme in Säugerzellen

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, hohe Ausbeuten an folsäureglykosylierten und enzymatisch aktiven Granzymen in humanen embryonalen Nierenzellen 293T zu erzeugen. Dies wird zunächst durch die Vermehrung von HEK-293T-Zellen in geeigneten Zellkulturschalen erreicht. Die übliche Ansatzgröße nach der Vermehrung umfasst 20 bis 25 Kulturschalen.Der zweite Schritt besteht darin, die expandierten Zellen vorübergehend mit einem Granzym-Expressionsplasmid mittels der effizienten Calciumphosphat-Methode zu transfizieren. Danach werden die Zellüberstände gesammelt und die sezernierten Granzym-Enzyme durch Immobilized-Metal-Affinitätschromatographie gereinigt. Die abschließenden Schritte sind die Aktivierung der Granzym-Enzyme durch Enterokinase-Behandlung und die weitere Reinigung der Proteasen mittels Kationenaustauschchromatographie.Schließlich wird die enzymatische Aktivität mithilfe eines schnellen und zuverlässigen cholesterolbasierten Assays getestet, da die Verfügbarkeit aktiver Proteasen in ausreichenden Mengen ein begrenzender Faktor in der Granzym-Forschung ist. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in diesem Forschungsbereich zu beantworten, beispielsweise die Charakterisierung neuer Zelltodwege in verschiedenen Organismen oder die Identifizierung neuartiger Protease-Substrate in Ansätzen mit dem gesamten Proteom. Um Granzyme zu exprimieren, kultivieren Sie zunächst HEC-293T-Zellen in 20 Milliliter Kulturmedium unter Verwendung von 150 mal 25 Millimeter Zellkulturschalen. Teilen Sie die Zellen bei 80 % Konfluenz; die Zellen haften locker an, können aber mechanisch ohne Trypsin durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren abgelöst und umgeimpft werden.Die Zellen am Tag vor der Transfektion so einsäen, dass sie am Tag der Transfektion eine Konfluenz von 60 bis 70 % erreichen. Eine typische Versuchsgröße umfasst 20 bis 25 Kulturschalen. Eine Stunde vor der Transfektion das Standardkulturmedium durch 20 Milliliter Transfektionsmedium ersetzen. Kurz vor Ende des einstündigen Inkubationsschritts, 1 bis 2 Minuten vor der Transfektion, 400 Mikrogramm Plasmid-DNA mit 10,95 Millilitern doppelt destilliertem Wasser und 1,55 Millilitern zweimolarer Calciumchloridlösung in 50-Milliliter-Röhrchen mischen.Geben Sie 12,5 Milliliter zweifach konzentrierter gepufferter Salzlösung zu 12,5 Milliliter der DNA-Calcium-Lösung hinzu und mischen Sie durch mehrmaliges Vorsichtig-Invertieren der Röhrchen, bevor Sie 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie diese Mischung tropfenweise direkt zu den Zellen hinzu, und zwar mit fünf Milliliter pro Schale, gleichmäßig über die gesamte Fläche verteilt, wodurch das Medium eine leicht orangerote Färbung annimmt. Inkubieren Sie die Kulturschalen sieben bis elf Stunden in einem Zellkultur-Inkubator.Nach der Inkubation ist ein feiner Niederschlag sichtbar. Entfernen Sie das Transfektionsmedium. Spülen Sie vorsichtig mit vorgewärmtem PBS und geben Sie 20 Milliliter serumfreies Kulturmedium hinzu, bevor Sie 72 Stunden in einem Zellkultur-Inkubator inkubieren. Analysieren Sie die Transfektions- und Expressionsrate, indem Sie eine Probe des Zellüberstandes auf einer SDS-Gelelektrophorese laufen lassen und mit Kumasi färben.Hellblau. Zum Visualisieren eines Granzym-Bandes. Nach der Inkubation die Zellkulturüberstände in 250-Milliliter-Röhrchen abgießen und durch Zentrifugation klären.Führen Sie eine erste Zentrifugation durch, um das Medium von den abgelösten Zellen zu trennen. Überführen Sie das Überstand in frische 250-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie 30 Minuten bei 4.000 G bei vier Grad Celsius, um verbleibende Zelltrümmer zu entfernen. Geben Sie anschließend fünf Milliliter Natriumchlorid, 6,25 Milliliter Tris-Basis und ein Milliliter Nickelsulfat sowie 250 Milliliter geklärten Überstand hinzu.Filtern Sie das Überstandsgemisch mithilfe einer 500-Milliliter-Vakuumfiltereinheit. Puffern Sie eine Nickel-Immobilized-Metal-Ion-Affinitäts-Chromatographiesäule mit His-Bindungspuffer. A unter Verwendung eines geeigneten FPLC-Systems.Tragen Sie dann das klare Überstandsgemisch auf die äquilibrierte Säule mit einer Flussrate von 0,5 Milliliter pro Minute bei vier Grad Celsius auf. Nach der Aufgabe des Überstands waschen Sie die Säule mit dem Bindungspuffer, bis die Basislinie der Ultraviolett- (UV-)Absorption erreicht ist. Eluieren Sie die Granzyme mit einem linearen 20-Milliliter-ILE-Gradienten bei einer Flussrate von 0,5 Milliliter pro Minute, während Sie Fraktionen zu je zwei Milliliter sammeln.Analysieren Sie die Elutionsfraktionen mittels SDS-Page und Kumasisierungs-Färbung. Sammeln Sie die fraktionsweise vorliegenden Grand-Zym-haltigen Anteile in einem Zentrifagenröhrchen. Lagern Sie eine kleine Probe bei minus 20 Grad Celsius als Prä-Entero-Kinase-Kontrolle.Entero-Kinase im Verhältnis von 0,02 Einheiten pro 50 Milliliter Initialüberstand direkt zur gepoolten Fraktion im Dialyseschlauch hinzufügen und über Nacht bei Raumtemperatur in Entero-Kinase-Puffer dialysieren. Am nächsten Tag die Kinase-behandelte Probe im Vergleich zur vor der Entero-Kinase-Behandlung vorliegenden Kontrolle mittels SDS-Page und Kumasi-Blau-Färbung analysieren. Wenn die endständige Verarbeitung abgeschlossen ist.Wechseln Sie den Dialysepuffer zu S-Puffer A und dialysieren Sie weitere vier Stunden bei Raumtemperatur, bevor Sie das DIALATE acht filtrieren. Anschließend puffergleichen Sie eine S-Säule mit S-Puffer A. Laden Sie die Probe auf die Säule mit einer Flussrate von 0,5 Milliliter pro Minute bei vier Grad Celsius, nachdem die Probe aufgegeben wurde.Waschen Sie die Säule mit Puffer A, bis die UV-Absorptions-Basislinie erreicht ist. Eluieren Sie die Granzyme mit einem 30-Milliliter-linearen Natriumchlorid-Gradienten; Granzym A eluiert bei etwa 650 Millimolar Natriumchlorid, Granzym B bei etwa 700 Millimolar Natriumchlorid und Granzym M bei etwa 750 Millimolar Natriumchlorid. Vereinigen Sie die Fraktionen, die Granzyme enthalten, und konzentrieren Sie diese mithilfe von Spin-Filtern auf etwa 100 Mikromolar. Aliquotieren Sie die konzentrierten Granzympräparationen und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.Als Nächstes analysieren Sie Elucian-Fraktionen mittels SDS-PAGE und chromometrischer Assays. Führen Sie die chromometrischen Assays durch, indem Sie kleine Granzym-Proben aus Elucian-Fraktionen oder konzentrierten Stämmen in 96-Loch-Platten mit flachem Boden verteilen. Fügen Sie eine positive Kontrolle und eine negative Kontrolle hinzu. Geben Sie 100 Mikroliter Assay-Puffer zu jedem hinzu.Die Platte 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Abschließend die optische Dichte bei 405 Nanometern in einem Mikroplatten-Reader messen. Dieses Protokoll liefert hohe Ausbeuten an reinen Granzymen, wie anhand dieses repräsentativen, mit Kumasi gefärbten SDS-Page-Gels gezeigt, das Granzym B/E aus der S-Säule darstellt.Die rekombinanten Granzyme zeigen eine ähnliche Aktivität wie native Proteasepräparationen, wie in diesem farbmetrischen Assay gezeigt, der die Aktivität rekombinanter und nativer Granzym B vergleicht. Wichtig ist, dass die Endo-H-Behandlung darauf hinweist, dass die in HEC-293T-Zellen produzierten Granzyme vollständig glykosyliert sind. Die rekombinanten Granzyme sind in der Lage, makromolekulare Proteinsubstrate zu spalten, wie in diesem repräsentativen Granzym-a-Spaltassay mit dem bakteriellen Proteinsubstrat und UOCD gezeigt wird.Hier verschwindet das Band, das gespaltenes N-O-U-C-D darstellt, langsam mit steigender Granzymkonzentration. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man vollständig glykosylierte und proaktive Grandenzyme in hohen Ausbeuten in HK 2 93 T-Zellen herstellt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In der Post-Genom-Ära menschlicher, ist die Verfügbarkeit von rekombinanten Proteinen in nativer Konformation darauf an, strukturelle, funktionelle und therapeutische Forschung und Entwicklung. Hier beschreiben wir ein Test-und Proteomik-Expressionssystem in humanen embryonalen Nierenzellen 293T-Zellen, die verwendet werden, um eine Vielzahl von rekombinanten Proteinen hergestellt werden können.

Eine bequeme und allgemein Expression Plattform für die Produktion von sekretierten Proteinen aus menschlichen Zellen

Die Expression rekombinanter Proteine durch Säugetiersysteme wird zu einer attraktiven Methode zur Herstellung von Proteinkomplexen für die Strukturbiologie. Hier stellen wir ein einfaches, aber hocheffizientes Expressionssystem vor, bei dem suspensionsgezüchtete Säugetierzellen zur Aufreinigung von Proteinkomplexen für Strukturstudien verwendet werden.

Expression rekombinanter Proteine ​​für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz

Wir beschreiben einen einfachen, quantitativen kolorimetrischen Assay, der speziell die proteolytische Aktivität von Granzym B (GzmB) bei Mensch, Maus oder Ratte misst. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um die Proteaseaktivität anderer granulierter Serinproteasen durch die Hydrolyse anderer synthetischer Peptidsubstrate mit einer geeigneten Erkennungssequenz zu bestimmen.

Ein Farbtest, die speziell Maßnahmen Granzyme B Proteolytische Aktivität: Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

In dieser Studie wurde die Expression eines humanen rekombinanten Zielproteins in verschiedenen Produktionsplattformen verglichen. Wir konzentrierten uns auf traditionelle fermenterbasierte Kulturen und auf Pflanzen, beschrieben den Aufbau jedes Systems und hoben auf der Grundlage der berichteten Ergebnisse die inhärenten Grenzen und Vorteile für jede Plattform hervor.

Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine ​​in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme

Expression des Malaria-Proteinen in zellbasierten Systemen bleibt eine Herausforderung. Wir zeigen zwei Schritt und einen Schritt IVT (in vitro-Translation) zellfreie Expressionssysteme zur Expression von rekombinanten Malaria-rhoptry Proteine ​​aus HeLa-Zellen. Wir verwenden eine Ni-Harz Affinität Kläranlage, die rhoptry Proteine ​​zu reinigen.

Basierend HeLa Zellfreie Expressionssysteme zur Expression von<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteine

Dies ist ein schnelles, kosteneffizientes Protokoll für die Herstellung von sekretierten, glykosylierten Säugetierproteinen und die anschließende einstufige Aufreinigung mit ausreichenden Ausbeuten an homogenem Protein für die Röntgenkristallographie und andere biophysikalische Studien.

Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation

Die Produktion von eukaryotischen Proteinen im Labormaßstab mit entsprechender posttranslationaler Modifikation stellt ein erhebliches Hindernis dar. Hier ist ein robustes Protokoll mit schneller Etablierung und Durchlaufzeit für die Proteinexpression unter Verwendung eines Säugetier-Expressionssystems. Dieses System unterstützt die selektive Aminosäuremarkierung, die selektive Markierung von Proteinen und die kleinmolekulare Modulatoren der Glykanzusammensetzung.

High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

Die Reinigung von Ionenkanälen ist oft eine Herausforderung, aber einmal erreicht, kann es möglicherweise erlauben, in-vitro- Untersuchungen der Funktionen und Strukturen der Kanäle. Hier beschreiben wir die schrittweisen Verfahren für den Ausdruck und die Reinigung von Säugetieren Bestrophin Proteine, eine Familie von Ca2 +-Cl– Kanäle aktiviert.

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

Wir bieten skalierbare Protokolle, die das Konstruktdesign, die transiente Transfektion sowie die Expression und Reinigung von humanen Huntingtin-Proteinvarianten in voller Länge in HEK293-Zellen abdecken.

Effiziente und skalierbare Produktion von humanen Huntingtin-Varianten in voller Länge in Säugetierzellen unter Verwendung eines transienten Expressionssystems

His-Tag-Reinigung, Dialyse und Aktivierung werden eingesetzt, um die Ausbeute an löslicher, aktiver Matrix-Metalloproteinase-3-katalytischer Domänenproteinexpression in Bakterien zu erhöhen. Proteinfraktionen werden über SDS-PAGE-Gele analysiert.

Bakterielle Expression und Aufreinigung der humanen Matrix-Metalloproteinase-3 mittels Affinitätschromatographie

Strukturelle und biochemische Untersuchungen menschlicher Membrantransporter erfordern Milligrammmengen an stabilem, intaktem und homogenem Protein. Hier beschreiben wir skalierbare Methoden zum Screening, zur Expression und zur Reinigung humaner Transporter gelöster Substanzen unter Verwendung von Codon-optimierten Genen.

Hochdurchsatzexpression und Aufreinigung humaner gelöster Träger für strukturelle und biochemische Untersuchungen

Erfahren Sie eine kosteneffiziente Methode zur Expression von Granzymen in HEK293T-Zellen mit hoher Ausbeute. Dieses System liefert vollständig glykosylierte und enzymatisch aktive Proteasen für die Immunforschung.

Eine hohe Ausbeute und kosteneffiziente Expression System der Menschen Granzyme in Säugerzellen

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