Eine hohe Ausbeute und kosteneffiziente Expression System der Menschen Granzyme in Säugerzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, hohe Ausbeuten an folglykosylierten und enzymatisch aktiven Granzymen in humanen embryonalen Nieren-2-93-T-Zellen zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst HEC 2 93 T-Zellen in geeigneten Gewebekulturschalen expandiert werden. Die übliche Zubereitungsgröße nach dem Ausbau besteht aus 20 bis 25 Kulturschalen.

Der zweite Schritt besteht darin, die expandierten Zellen transient mit einem Granzym-Expressionsplasmid unter Verwendung der effizienten Calciumphosphat-Methode zu transfizieren. Als nächstes werden die Zellsupernat geerntet und die sekretierten großen Enzyme durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie gereinigt. Die letzten Schritte sind die Aktivierung der großen Enzyme durch Beginn der Kinasebehandlung und die weitere Reinigung der Proteasen mittels Kationenaustauschchromatographie

Letztendlich wird die enzymatische Aktivität mit einem schnellen und zuverlässigen cholemetrischen Assay getestet, da die Verfügbarkeit von aktiver Protease in ausreichenden Mengen ein limitierender Faktor in der Granzymforschung ist. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf diesem Gebiet zu beantworten, wie z. B. die Charakterisierung neuer Zelltodwege in verschiedenen Organismen oder die Identifizierung neuartiger Proteasesubstrate in Gesamtproteomansätzen zur Expression großartiger Enzyme. Zuerst züchten Sie HEC 2 93 T-Zellen in 20 Millilitern Kulturmedium unter Verwendung von 150 x 25 Millimeter großen Gewebekulturschalen, die die Zellen bei 80 % Co teilen. Die Fluenzzellen lagern sich locker an, können aber ohne Trypsin durch rigoroses Auf- und Abpipettieren der Platte mechanisch abgelöst werden.

Die Zellen in der Nacht vor der Transfektion, um am Tag der Transfektion eine Co-Flüssigkeit von 60 bis 70 % zu ergeben. Eine übliche Zubereitungsgröße besteht aus 20 bis 25 Kulturschalen. Eine Stunde vor der Transfektion wurde das Standardkulturmedium auf 20 Milliliter Transfektionsmedium umgestellt, gegen Ende des einstündigen Inkubationsschritts wurden 400 Mikrogramm Plasma-DNA mit 10,95 Millilitern doppelt destilliertem Wasser und 1,55 Milliliter zweimolares Calciumchlorid in 50-Milliliter-Röhrchen ein bis zwei Minuten vor der Transfektion gemischt.

Bei 12,5 Millilitern von zwei x Haufen salzig auf 12,5 Milliliter der DNA gepufferte Kalziumlösung, die durch Inversion der Röhrchen gemischt wurde, bevor sie 30 Sekunden lang inkubierte. Bei Raumtemperatur diese Mischung tropfenweise mit fünf Millilitern pro Schale direkt in die Zellen geben, gleichmäßig über die gesamte Fläche streuen und das Medium leicht orange färben. Inkubieren Sie die Kulturschalen sieben bis 11 Stunden lang in einem Gewebekultur-Inkubator.

Nach der Inkubation ist ein feiner Niederschlag sichtbar. Entfernen Sie das Transfektionsmedium. Spülen Sie vorsichtig mit vorgewärmtem PBS und fügen Sie 20 Milliliter serumfreies Kulturmedium hinzu, bevor Sie 72 Stunden lang in einem Gewebekultur-Inkubator inkubieren, analysieren Sie die Transfektion und Expressionseffizienz, indem Sie eine Probe des Zellüberstands auf der SDS-Seite durchführen und mit Kumasi färben.

Strahlendes Blau. Zur Visualisierung eines Granzym-Bandes. Nach der Inkubation werden die Zellkulturüberstände in 250-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und durch Zentrifugation klargestellt.

Führen Sie eine erste Drehung durch, bei der das Medium von den abgelösten Zellen befreit wird. Den Überstand in frische 250-Milliliter-Röhrchen umfüllen und 30 Minuten lang bei 4.000 g bei vier Grad Celsius drehen, um alle verbleibenden Zelltrümmer zu entfernen. Als nächstes fügen Sie fünf Milliliter Natriumchlorid, 6,25 Milliliter Trisbase und einen Milliliter Nickelsulfat plus 250 Milliliter geklärten Überstand hinzu.

Filtrieren Sie den Überstand mit einer 500-Milliliter-Vakuumfiltereinheit. Äquilibrieren Sie eine Nickel-immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie-Säule mit ihrem Bindungspuffer. A unter Verwendung eines geeigneten FPLC-Systems.

Dann wird der gereinigte Überstand mit einer Durchflussrate von 0,5 Millilitern pro Minute bei vier Grad Celsius auf die äquilibrierte Säule aufgetragen. Waschen Sie die Säule nach dem Auftragen des Überstands mit seinem Bindungspuffer, bis die UV- oder UV-absorbierende Grundlinie erreicht ist. Eluieren Sie die Granzyme mit einem linearen 20-Milliliter-ILE-Gradienten bei einer Durchflussrate von 0,5 Millilitern pro Minute, während Sie zwei Milliliterfraktionen sammeln.

Analysieren Sie die elucianischen Fraktionen mittels SDS-Seite und Kumasi-Färbung. Ziehen Sie das Grand-Zyme, das die Fraktionen enthält, in ein Betäubungsröhrchen. Lagern Sie eine kleine Probe bei minus 20 Grad Celsius als Prä-Entero-Kinase-Kontrolle.

Geben Sie Enterokinase in einer Menge von 0,02 Einheiten pro 50 Milliliter des Anfangsüberstands direkt zu der gepoolten Fraktion im Dialyseröhrchen und dialysieren Sie über Nacht bei Raumtemperatur in Enterokinase-Puffer. Am nächsten Tag analysieren Sie die mit Kinase behandelte Grand im Vergleich zur Pre-Enterer-Kinase-Kontrolle durch SDS-Seite und Kumasi-Blau-Färbung. Wenn die Verarbeitung des Endterminals abgeschlossen ist.

Wechseln Sie den Dialysepuffer gegen S-Puffer A und dialysieren Sie weitere vier Stunden bei Raumtemperatur, bevor Sie den DIALATE eight filtrieren. Äquilibrieren Sie als Nächstes eine S-Spalte mit dem S-Puffer. A.Laden Sie die Probe nach dem Laden der Probe mit einer Durchflussrate von 0,5 Millilitern pro Minute bei vier Grad Celsius auf die Säule.

Waschen Sie die Säule mit S-Puffer A, bis die UV-absorbierende Grundlinie erreicht ist. Eluieren Sie die Granzyme mit einem linearen Natriumchlorid-Gradienten von 30 Millilitern, Granzym A eluiert bei etwa 650 millimolaren Natriumchlorid, Granzym B bei etwa 700 millimolaren Natriumchlorid und Granzym M bei etwa 750 millimolarem Natriumchlorid. Die granzymhaltigen Fraktionen werden gepoolt und in Spin-Filtern auf etwa 100 Mikromolare konzentriert, die konzentrierten Granzym-Präparate aliquotiert und bei minus 80 Grad Celsius gelagert.

Als nächstes analysieren Sie elucianische Fraktionen mit SDS-Seiten- und Chole-metrischen Assays, um die Chole-metrischen Assays durchzuführen, die kleine Granzymproben aus elluzischen Fraktionen oder konzentrierten Stämmen in 96 verteilen. Nun, flache Bodenplatten enthalten eine Positiv- und eine Negativkontrolle. Fügen Sie jeweils 100 Mikroliter Assay-Puffer hinzu.

Platte 10 Minuten bei 37 Grad Celsius gut inkubieren. Messen Sie abschließend die optische Dichte bei 405 Nanometern in einem Mikroplatten-Reader. Dieses Protokoll wird hohe Ausbeuten an reinen Granzymen erzeugen, wie dieses repräsentative Kumasi-gefärbte SDS-Seitengel zeigt, das Granzyme BE aus der S-Säule zeigt.

Die rekombinanten Granzyme zeigen eine ähnliche Aktivität wie native Proteasepräparate, wie in diesem farbmetrischen Assay gezeigt, der die rekombinante und die native Granzym-B-Aktivität vergleicht. Wichtig ist, dass die Endo-H-Behandlung darauf hinweist, dass die in HEC 2 93 T-Zellen produzierten Granzyme vollständig glykosyliert sind. Die rekombinanten großen Enzyme sind in der Lage, makromolekulare Proteinsubstrate zu spalten, wie in diesem repräsentativen Granzym, einem Spaltassay unter Verwendung des bakteriellen Proteinsubstrats und der UOCD, gezeigt wird.

Hier verschwindet die Bande, die das gespaltene N-O-U-C-D darstellt, langsam mit zunehmender Granzymkonzentration. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man vollständig glykosylierte und proaktive große Enzyme mit hoher Ausbeute in HK 2 93 T-Zellen herstellt.