Name: Gene Expression Profiling von Infecting Mikroben Mit einem Digital-Strichcode-Plattform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Erfahren Sie die Genexpressionsanalyse von Infektionserregern mit einer digitalen Strichcode-Plattform. Diese hochsensible Methode ermöglicht die Quantifizierung von C. albicans-Genexpression in vivo aus kleinen Gewebemustern.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse NIH R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM &amp; SGF), R01 AI054928 (SGF) und R01 DE017088 (SGF) unterstützt.

Alle tierischen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee auf der Los Angeles Biomedical Research Institute bestätigt (Protokoll 011.000) und nach den National Institutes of Health (NIH) Leitlinien für die ethische Behandlung von Tieren durchgeführt. Die Mäuse wurden in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung auf dem Campus der Harbor-UCLA Research and Education Institute liegt im Käfig. Ein Vollzeit-Tierarzt, der in der Versuchstiermedizin spezialisiert beaufsichtigte ihre Pflege. Käfighaltung und Tierhaltung wurde nach den Richtlinien der US Public Health Service Publikation &quot;Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren&quot; zur Verfügung gestellt. Jeder Versuch unternommen wurde, um die Mäuse mit Menschlichkeit zu behandeln. Das Überleben und die Gesundheit der Mäuse wurde dreimal täglich überwacht. Offensichtlich wurden krank, lethargisch Mäusen aus der Gruppe getrennt und eingeschläfert, Leiden zu minimieren. Die Mäuse wurden durch Überdosis Pentobarbital (210 mg / kg) getötet, wie der Ausschuss für Euthanas empfohlenia der American Veterinary Medical Association. 1. Herstellung von Gewebe, Reagenzien und Instrumente <ol><li> Verwenden männliche Balb / c-Mäusen, 20-22 g Gewichtung für alle Studien. Impfen drei Mäusen pro Versuchsgruppe intravenös mit 1 x 10 6 Hefe-Phase C albicans-Zellen. Opfern Tiere und Ernte Nieren zu bestimmten Zeitpunkten nach der Infektion. Platzieren Sie jede Niere in einen Schraubverschluss Rohr, Snap freeze in flüssigem Stickstoff, und bei -80 ° C für die spätere RNA-Extraktion 6. Anmerkung: Die Tierversuche wurden wie im Detail in Xu et al beschrieben durchgeführt. 6. </li><li> Bereiten Sie die folgenden Reagenzien und Instrumente vor dem Entfernen der Nieren aus dem -80 ° C Gefrierschrank: <ol><li> Öffnen Sie eine Gesamt-RNA-Extraktions-Kits. In 2-Mercaptoethanol (1% v / v) zu RLT-Puffer und gut mischen (Vorbereitung 2 ml für jede Probe). </li><li> Vorbereitung Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol 25: 24: 1 (600 ul müssen für jede Probe). </li><li> Label M-Typ Homogenisierung Rohre (M-Rohr) und Chill auf Eis. </li><li> Label 2 ml Schraubverschluss Röhrchen, und fügen Sie ca. 300 &amp; mgr; l Zirkonia-Perlen in jedes Röhrchen. </li><li> Check Instrumente stehen zur Verfügung: Gewebe Dissociator, BeadBeater, Tischzentrifuge mit Adapter für 50 ml-Röhrchen und Platten mit 96 Vertiefungen, Photometer. </li></ol></li></ol> 2. RNA-Extraktion aus infizierten Geweben <ol><li> Röhrchen, die Nieren von -80 ° C Gefrierschrank zu entfernen und legen auf Eis. Mit 1,2 ml RLT mit 2-Mercaptoethanol zu jeder Niere puffern. Dekantier-Niere mit Puffer in eine M-Typ Homogenisierung Rohre. </li><li> Homogenisieren die Niere unter Verwendung eines gewebe Dissociator auf vorinstallierten Einstellung RNA_02.01. </li><li> Zentrifuge bei 1000 × g für 1 min in einer Tischzentrifuge bei RT. </li><li> Übertragen Sie 600 ul Homogenat zu der Schraubkappe Röhrchen mit Zirkonia-Perlen. Speichern Sie die verbleibenden Homogenat auf Eis. </li><li> Mit 600 &amp; mgr; l Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol 25: 24: 1 bisdie Rohre aus dem vorhergehenden Schritt. </li><li> Schließen Sie den Deckel fest und Wirbel auf BeadBeater für 3 Minuten in einer 4 ° C kalten Raum. </li><li> Zentrifugieren der Röhrchen bei 15.000 xg für 5 min in einem 4 ° C kalten Raum. </li><li> Die wässrige Phase in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig zu übertragen, gut mischen mit gleichen Volumen von 70% Ethanol, dann auf die Spin-Säule zu laden (load zweimal). </li><li> Einmal Waschen Sie die Spin-Säule mit 700 &amp; mgr; l Puffer RW, gefolgt von zweimal mit 500 &amp; mgr; l Puffer RPE. Zentrifuge eine zusätzliche Minute in einem trockenen Sammelröhrchen, um restliche Flüssigkeit in der Spin-Säule entfernen. Führen Sie alle Zentrifugationsschritte bei 8000 x g. </li><li> Eluieren RNA mit 50 &amp; mgr; l H 2 O. Messen Sie RNA-Konzentration bei OD 260 mit einem Spektralphotometer. </li></ol> 3. Genexpressions Mit Digital-Strichcode- <ol><li> Thaw Reporter codeset (grüner Deckel Rohr) und Capture-Codesatz (graue Kappe Rohr) auf Eis. </li><li> Add 130 ul Hybridisierungspuffer zur Wiederporter codeset, umzukehren, zu mischen und Spin-Down. </li><li> Mit 20 &amp; mgr; l des Gemisches zu jeder der 12 Reaktionsrohren. </li><li> Zugabe von 10 ug Gesamt-Gewebe-RNA (in einem Volumen von 5 ul) in jedes Röhrchen. Mischen durch Pipettieren. </li><li> Plus 5 ul Erfassungscodesatz in jedes Röhrchen. Mischen Sie, indem Sie den Rohr, gefolgt von einer schnellen Spin-Down. </li><li> Die Reaktionen bei 65 ° C inkubieren in einem Thermocycler mit Heizdeckel O / N (~ 18 h). </li><li> Entfernen Sie eine Probenkassette von -20 ° C und lassen Sie es auf RT erwärmen. </li><li> Entfernen zwei Reagenz Platten von 4 ° C und Zentrifugation bei 670 × g für 2 min in einer Tischzentrifuge. </li><li> Einrichten der Vorbereitungsstation folgenden Schritt-für-Schritt-Anleitungen auf dem Bildschirm, wählen Sie die Option, eine hohe Empfindlichkeit. </li><li> Entfernen Sie die Reaktionen aus dem Thermocycler und sofort auf dem Vorbereitungsstation laden. Wählen Sie, um die hohe Empfindlichkeit Programm (3 h) laufen. </li><li> Wenn die Vorbereitungsstation Programm abgeschlossen ist, entfernen Sie die Kassette und dichten die Bahnen mit einem klaren Klebeband. ApLagen Mineralöl auf die Unterseite der Patrone (zur Erzeugung einer nCounter nur, spätere Generationen diesen Schritt nicht erforderlich), dann wird die Kassette laden auf den Digital-Analysator. </li><li> Einrichten des digitalen Analysators folgenden Schritt-für-Schritt-Anleitungen auf dem Bildschirm, wählen Sie die Scan-Option Hochauflösung. </li><li> Wählen Sie den (600 Felder) Option hohe Auflösung, führen Sie den Scan-Programm (~ 4,5 h). </li><li> Wenn das Scan-Programm abgeschlossen ist, laden Sie die Ergebnisse (oder wählen Sie, um die Ergebnisse per E-Mail) und Rohdaten Import in Herstellersoftware. Die Software überprüft automatisch die Datenqualität und erhöhen Flags, wenn die Qualität der Daten aus dem normalen Bereich fällt. Führen technische Anpassung mit Hilfe der eingebauten Funktion (optional, befolgen Sie die Anweisungen in der Software), dann die Daten zu exportieren als Excel-Datei. </li><li> Normalisieren die Daten mit Hilfe einer der folgenden Methoden: Gesamtaktivität aller Gene im Codesatz; einem oder wenigen internen Kontrollgenen; geometrisches Mittelvon hoch exprimierten Genen (siehe Diskussion). </li><li> Berechnet den Mittelwert Expressionswerte für jedes Gen (wenn das Experiment wurde in Wiederholungen oder dreifach durchgeführt), dann wird das Verhältnis der Expressionsniveaus zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen. </li><li> (optional) Analyse und Visualisierung der Profilierung Ergebnisse durch integrierte Funktionen im nSolver Software oder einer Clustering-Programm wie MultiExperiment Viewer-10. </li></ol>

<ol><li>Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host-infecting+fungal+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">The host-infecting fungal transcriptome.</a> FEMS Microbiol Lett. 307 (1), 1-11 (2010).</li>
<li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).</li>
<li>Creecy, J. P., Conway, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bacterial+transcriptomics+with+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq.</a> Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).</li>
<li>Geiss, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+multiplexed+measurement+of+gene+expression+with+color-coded+probe+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs.</a> Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).</li>
<li>Malkov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Res Notes. 2, 80(2009).</li>
<li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+Alliance+of+Regulatory+Pathways+in+C.+albicans+during+Mammalian+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection.</a> PLoS Biology. 13, e1002076(2015).</li>
<li>O'Meara, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cryptococcus+neoformans+Rim101+Transcription+Factor+Directly+Regulates+Genes+Required+for+Adaptation+to+the+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host.</a> Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).</li>
<li>Cheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+Candida+albicans+Gene+Expression+During+Intra-Abdominal+Candidiasis+Identifies+Biologic+Processes+Involved+in+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis.</a> J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).</li>
<li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Targets+of+Candida+albicans+Biofilm+Regulator+Bcr1+in+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo.</a> Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).</li>
<li>Saeed, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TM4%3A+a+free%2C+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).</li>
</ol>

Dieses Protokoll wurde im Labor von Dr. Aaron P. Mitchell an der Carnegie Mellon University entwickelt. Die Veröffentlichung dieses Manuskripts wird von NanoString Technologies gesponsert.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Transkriptionsprofilierung infizieren Mikroben mit einem nano nCounter Plattform zu optimieren. Das gesamte Verfahren, vom Gewebesammel um Expressionsdaten, benötigt weniger als 48 Stunden. Die Hands-on-Zeit beträgt etwa 4 Stunden für 12 Proben. Eine Schlüsselvariable in diesem Protokoll ist die Menge an Puffer RLT auf das Gewebe bei der ersten Stufe zugegeben. Zu viel Puffer das Homogenat zu verdünnen und zu einer RNA-Konzentration zu senken, während zu wenig Puffer kann zur Bildung von viskosen Gele nach dem Phenol-Chloroform-Extraktionsschritt zu führen und keinen Wasserphase für die RNA-Wiederherstellung. Die empirisch ermittelt optimale Volumen Puffer RLT für Mausgeweben (vorausgesetzt typischen Größen) sind: Nieren (1,2 ml), die Zunge (1,0 ml) und Lungenkrebs (2,0 ml). Für mikrobielle Krankheitserreger, vor allem in Fadenform davon gewachsen, der Wulst-zu schlagen Schritt hilft, offene dicke Zellwand zu brechen, um Zellinhalt vollständig freizugeben. In der Elutionsschritt, um die endgültige RNA zu erhöhenKonzentration kann die erste Runde Eluates wieder auf die Säule gegeben werden und ein zweites Mal eluiert. Etwa 100 ug Gesamt-RNA Gewebe kann von einem RNeasy Spinsäule (~ 2 ug / ul x 50 &amp; mgr; l) wiederhergestellt werden. Wenn größere Menge an RNA benötigt wird, kann eine zweite prep vom verbleibenden Gewebehomogenat erfolgen. Haben der verbleibenden Homogenat nicht weg, bis RNA-Konzentration gemessen wurde, nur für den Fall. Je nach Infektionsmodell, das Inokulum Größe und der Erreger-Stamm, der Anteil der Pathogen-RNA insgesamt Gewebe RNA im Bereich von 0% bis 2%, und fällt in den 0,05% -0,5% Reichweite in der Regel. Beispielsweise 10 ug Gesamt-RNA aus Gewebe C. albicans infiziert Nieren könnten rohes zählt gleich derjenigen der 10 ng reiner C erzeugen albicans RNA aus einer in vitro-Kultur (10 ng / 10 &amp; mgr; = 0,1%). Weil der Anteil der Pathogen-RNA insgesamt Gewebe RNA variiert in einem weiten Bereich, ist es schwierig, die Menge des pathoge wissenn -RNA in einer gegebenen Menge an Gesamt-RNA. Um Verschwendung zu vermeiden Codesatz (für 250 Gene x 192 Reaktionen, die Kosten pro Reaktion liegt bei etwa $ 200) an Proben mit Pathogen-RNA unter der Nachweisgrenze kann ein RNA Qualitätskontrollschritt durchgeführt, um den Erreger RNA-Ebene in jeder Probe zu bestimmen. Dies kann entweder durch Q-RTPCR oder eine kleine Codesatz mit ein paar Haushaltsgenen durchgeführt werden. Die Normalisierung mit pathogen-Gene ist ein kritischer Schritt, bevor die Expressionsprofile können unter den verschiedenen Proben verglichen werden. Es gibt drei allgemein verwendeten Verfahren zur Normalisierung. 1. Verwenden Sie die Gesamtaktivität von allen Genen im Codesatz. 2. Verwenden Sie eine oder wenige &quot;Housekeeping&quot; Genen. 3. Mit dem geometrischen Mittelwert (N-te Wurzel des Produkts der Anzahl N) von hoch exprimierten Genen. Für eine große Codesatz (&gt; 100 Genen), die nach dem Zufallsprinzip ausgewählten Sonden unter Verwendung von Gesamtaktivität für die Normierung kann eine gute Wahl sein, weil die Gesamtaktivität von einer großen Anzahl von nicht verwandten Gene Glaubevollständig widerspiegeln die Menge an RNA-Eingang. Für ein kleines codeset (&lt;100 Gene) enthalten Sonden, die auf einen bestimmten Prozess konzentriert (wie Hyphenwachstum, da Hyphenwachstums Genen zusammen reguliert werden tendieren), die Auswahl einer oder wenigen Haushaltsgenen als Kontrolle zur Normalisierung ist wesentlich. TDH3 ein robust ausgedrückt Stoffwechselgens hat auch die Kontrolle für viele Experimente serviert. Das dritte Verfahren ist ein Hybrid aus Verfahren 1 und 2, mit einem Schwerpunkt für gleiche Beitrag hoch exprimierten Genen. Obwohl die nCounter Plattform nicht genomweiten ermöglicht sie die Quantifizierung der Expressionsniveau für bis zu 800 Gene in einem einzigen Assay. Deshalb ist die Wahl der informativsten Gene zu analysieren, ist entscheidend für den Erfolg der Profilierung. Zwei Ansätze für Sonden ausgewählt wurden verwendet. Der erste Ansatz ist &quot;Kenntnisse&quot;. Informationen aus veröffentlichten Expression und funktionelle Daten an Bildschirm nach Genen, die von potenziellem Interesse an den aktuellen zusammengestelltzu untersuchen, wie die Umweltantwortgene 6-9. Dieser Ansatz ermöglicht den einfachen Vergleich von in-vivo-Profiling-Daten in viele bestehende Datensätze, also die Bereitstellung Zusammenhang auf die Interpretation der Daten. Der zweite Ansatz ist &quot;Exploration basiert&quot;. Eine Kategorie von Genen im Genom eines Mikroorganismus, wie beispielsweise alle Gene spezifiziert Transkriptionsfaktoren, Kinasen oder Zellwand-Proteine ​​für Sonden ausgewählt. Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung neuer Virulenzfaktoren und Identifizierung neuartiger Regulierungs Beziehungen auf der Grundlage der in vivo Profildaten 6.

Genexpression Dynamik hält wichtige Informationen darüber, wie eine Zelle auf Umweltveränderungen reagiert. Im Fall eines infizierenden Mikroben könnte Genexpressionsdaten klinisch relevanten Erkenntnisse darüber, wie ein Pathogen passt sich der Infektion Umwelt und verursacht Schäden an den Host liefern. In den vergangenen zwei Jahrzehnten haben Genexpressionsstudien in vitro und in vivo große Menge von Daten erzeugt und legte eine Grundlage für das Verständnis der Infektionsbiologie 1-3. Doch aktuelle Profilierung Technologien wie Mikroarrays und RNAseq, sind nicht optimal für die Profilierung des Erregers Genexpression während der Infektion. Wirts-RNA stellt eine überwiegende Teil (in der Regel&gt; 99%) der Gesamt-RNA aus infizierten Gewebeproben isoliert. Der Host-RNA trägt zu hohen Hintergrund auf Mikroarrays, und dominiert Folge liest aus RNAseq. Pathogen Zellisolierung aus infiziertem Gewebe, in der Theorie, kann dazu beitragen, für die Pathogen-RNA zu bereichern, aber es stellt sich zusätzlichal-Probleme: es große Mengen von infiziertem Gewebe erfordert; das Verfahren kann langwierig sein; und was am wichtigsten ist, ist es schwierig, den nativen Zustand oder Integrität der RNA während der langwierigen Prozess zu sparen. Um umfassendere und genaue Daten über Krankheitserreger Genexpression während der reale Infektionen erzeugen, machten wir uns auf ein Protokoll, zuverlässige und kosteneffektive Quantifizierung von Minderheits RNA-Spezies in einer gemischten RNA-Population ermöglicht zu entwickeln. Nano nCounter ist eine kürzlich entwickelte Plattform, die eine direkte Messung von gemultiplexten Genexpression macht Verwendung digitaler barcodierten Sondenpaare 4, 5. Diese Plattform hat eine Empfindlichkeit vergleichbar mit der qRT-PCR, aber nicht enzymatische Amplifikation erforderlich. Die Technologie nicht genomweite es Detektion von bis zu 800 verschiedene Gene in jedem Assay ermöglicht. Daher ist es entscheidend, informativen Genen als Sonden für die Profilierung aus. Hier verwenden wir Genexpressionsstudie einer großen humein Pathogen Candida albicans, während eine invasive Infektion als ein Beispiel, um zu zeigen: 1) Technische Einzelheiten der experimentellen Verfahren (Protokoll), 2) die Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und der dynamische Bereich dieser Methode (repräsentative Ergebnisse) und 3) Wichtig Überlegungen für die Gestaltung und Durchführung von Experimenten auf der Grundlage dieses Protokolls (Diskussion). Dieses Protokoll kann leicht für verschiedene Krankheitserreger angepasst werden und wurde erfolgreich in einer Reihe von Infektionsmodellen 6-9 angewendet.

<table><tbody><tr><td>gentleMACS Dissoziator</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>gentelMACS M Tube</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:CHCl3:IAA</td><td>Sigma</td><td>P-2069</td><td></td></tr><tr><td>Zirkonoxid Kügelchen</td><td>Biospec Products</td><td>11079110zx</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>Biospec Products</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>nCounter Analysesystem</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nCounter Genexpression Codesets</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSolver Analysetool</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gene expression profiling von infecting mikroben mit einem digital-strichcode-plattform

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

Bei den meisten Säugetieren Erreger haben Genexpressionsstudien durch technische Schwierigkeiten begrenzt worden, um genau zu quantifizieren Erreger Gentranskripten aus infizierten Geweben. Pathogen-RNA bildet einen kleinen Teil der Gesamt-RNA aus infizierten Gewebeproben isoliert. Beide Mikroarray und RNAseq Technologien haben Schwierigkeiten bei der Erzeugung zuverlässiger liest für schwach ausgeprägt Erreger Gene. Mutant Erregerstämme mit reduzierten in vivo-Proliferation stellen eine noch größere Herausforderung. Hier beschreiben wir ein in vivo Genexpressions Protokoll, das sehr schnelle, hochempfindliche und sehr gut reproduzierbar ist. Wir dieses Protokoll entwickelt, während unserer Untersuchung der pilzlichen Pathogens Candida albicans in einem Mausmodell der hämatogen disseminierte Candidiasis. Mit diesem Protokoll haben wir Zeitverläufe der dynamisch geregelten C. dokumentiert albicans Genexpression während der Nieren-Infektion, und entdeckte unerwartete MerkmaleGenexpression Antworten auf medikamentöse Behandlung in vivo Antimykotika.

Eine große Herausforderung für die Erreger von Genexpressionsprofilen in vivo ist es, genug liest aus Pathogen-RNA. Angesichts der geringen Prozentsatz der Pathogen-Transkripte in Gesamt-RNA, große Mengen an Gesamt-RNA (&gt; 10 ug) muss für jede Reaktion verwendet werden. Die Plattform hat einen einzigartigen Vorteil in dieser Hinsicht: Es verwendet sowohl eine Einfangsonde und eines Berichts Sonde, die Spezifität zu erhöhen, so dass die überwiegende Menge der Wirts-RNA ist ein erhebliches Maß an Lärm verursachen. Wie in Abbildung 1 gezeigt (aus Lit.. 6), waren Hintergrund rohes zählt von einem nicht infizierten Gewebeprobe (rote Punkte) alle unter 10, während rohe zählt von zwei infizierte Gewebeproben (blaue Punkte) waren alle über 10 Expression Daten erzeugt mit diesem Protokoll sind hoch reproduzierbar. Wie in Abbildung 1 gezeigt (aus Lit.. 6), roh zählt von zwei biologischen Replikaten (blaue Punkte, 48 Stunden nach der Infektion Nierenproben) hatte sehr good Korrelation mit R-Quadrat-Wert gleich 0,945. Die Plattform bietet auch ausreichenden dynamischen Bereich, um natürliche biologische Expressionsniveaus umfassen (Abbildung 1, reichten Rohzählungen zwischen 10 1 und 10 6). Mit Hilfe eines Sondensatz Angabe 248 Umweltantwortgene, waren wir in der Lage, zwei Phasen des Erregers Genexpression (Abbildung 2, aus Lit. 6.) Zu erkennen: eine frühe Genexpression als Reaktion umfasst Gene, die mit RNA-Spiegel signifikant unterschiedlich zwischen Inokulum und 12 h nach der Infektion Proben (P &lt;0,05 und&gt; 2-fache Veränderung der Expression) und einem späten Genexpression als Reaktion umfasst Gene, die mit RNA-Spiegel, die signifikant verschieden zwischen den 12 h Zeitpunkt, zu 48 Stunden nach der Infektion Proben (P &lt;0,05 und&gt; 2-fache Veränderung der Expression). Diese Ergebnisse zeigen, daß C. albicans Genexpression dynamisch während invasive infectio geregeltn eines Säugetierwirts. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig1.jpg" /> Abbildung 1. Raw zählt von infizierten und nicht infizierten Nierengewebe (aus Lit.. 6). Sonde zählt für zwei infizierte (48 Stunden nach der Infektion, blauen Datenpunkte) und einem nicht infizierten (rote Datenpunkte) Nierenproben werden als Streu vorgestellt Plot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53460/53460fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Expression von C albicans umwelt responsive Gene bei invasiven Infektionen (aus Lit.. 6). Veränderungen im Expressionsniveaus während der Mausniere Invasion für 248 C. albicans-Gene sind in einer Wärme m vorgestelltap-Format. Mittelwerte der biologischen Triplikaten für Hochregulierung (gelb) dargestellt und Down-Regulation (blau) von Genen bei 12, 24 und 48 Stunden nach der Infektion relativ zu Inokulum Ebenen (0 h) bedeuten. Farbsättigung stellt das Ausmaß der Expression Änderung, mit voller Sättigung bei 10 fach Up- oder Down-Regulation. Teile der Heatmap werden erweitert, um repräsentative frühe up-regulierte Gene (oben), späte Gene (Mitte), und Anfang herunterreguliert Gene (unten) zu veranschaulichen. In diesen Abschnitten werden die einzelnen Proben gesondert ausgewiesen, um die Reproduzierbarkeit zu veranschaulichen. Wir definieren frühen Ausdruck ändert sich signifikante Unterschiede zwischen der Impfkultur und 12 h Proben. Wir definieren Spätausdruck ändert sich signifikante Unterschiede zwischen den 12 und 48 Stunden Proben. Bedeutung bezieht sich auf Veränderungen von&gt; 2-fachen und einem p-Wert &lt;0,05. Die Daten für jede Probe wurden die RNA-Niveaus von Kontrollgens TDH3 normalisiert, bevor Mittelwerte wurden berechnet. Unsere Zuordnungskriterien ermöglichen eine dynamically regulierten Gene in beiden frühen und späten Expression Klassen fallen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53460/53460fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Wir haben ein Protokoll entwickelt, das schnell, sensitiv und reproduzierbar für die Erstellung von Erreger-Genexpressionsprofilen während einer Infektion ist.

Gene Expression Profiling von Infecting Mikroben Mit einem Digital-Strichcode-Plattform

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Genexpression von Krankheitserregern in vivo genau zu messen, um Einblicke darüber zu gewinnen, wie sich ein Erreger an die infektiöse Umgebung anpasst und welchen Schaden er beim Wirt verursacht. Diese Technik eröffnete für Forscher im Bereich der Infektionskrankheiten die Möglichkeit, die Dynamik der Genexpression von Krankheitserregern während einer tatsächlichen Infektion in verschiedenen Gewebetypen und zu mehreren Zeitpunkten zu untersuchen. Der entscheidende Vorteil dieser Methode liegt in ihrer hohen Empfindlichkeit und außerordentlichen Reproduzierbarkeit.Diese Methode ermöglicht es, die Genexpression von Pathogenen aus geringen Gewebemengen einer natürlichen Infektion zu quantifizieren. Um mit der Vorbereitung der Reagenzien zu beginnen, geben Sie 2-Mercaptoethanol zum Puffer RLT hinzu und mischen gründlich. Bereiten Sie eine 25:24:1-Mischung aus Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Lösung vor.Etikettieren Sie M-Typ-Homogenisierungsgefäße und kühlen Sie sie auf Eis. Etikettieren Sie zwei Milliliter-Schraubdeckelgefäße und geben Sie jeweils etwa 300 Mikroliter Zirkonia-Perlen in jedes Gefäß. Bereiten Sie die folgenden Geräte zur Verwendung vor: einen Gewebe-Dissoziator, einen Bead-Beater, eine Tischzentrifuge mit Adaptern für 50-Milliliter-Gefäße und 96-Loch-Platten sowie einen Photometer.Entnehmen Sie zuvor gefrorene Nieren, die von mit C.albicans infizierten Mäusen isoliert wurden, einem Gefrierschrank mit -80 Grad Celsius und legen Sie sie auf Eis. Geben Sie 1,2 Milliliter Puffer RLT zu jeder Niere hinzu. Danach dekantieren Sie jede Niere mit Puffer in ein M-Typ-Homogenisierrohr.Die Menge an Puffer RLT wird empirisch bestimmt. Zu viel Puffer RLT verdünnt die Probenkonzentration, während zu wenig den Homogenat sehr viskos und äußerst schwer handhabbar macht. Anschließend homogenisieren Sie die Nieren mithilfe eines Gewebedissociators in der voreingestellten RNA-2.01-Einstellung.Anschließend bei 1000 × g eine Minute zentrifugieren. 600 Mikroliter jedes Homogenats in ein Schraubverschlussgefäß mit Zirkonia-Perlen überführen und das verbleibende Homogenat auf Eis aufbewahren. 600 Mikroliter Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol zu jedem Gefäß hinzufügen, die Verschlüsse fest schließen und drei Minuten bei vier Grad Celsius im Perlenzerreißer vortexen.Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 15.000 × g und vier Grad Celsius. Überführen Sie vorsichtig die wässrige Phase in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrofugegefäß und geben Sie ein gleiches Volumen an 70 %igem Ethanol hinzu. Anschließend die Probe auf die Säule auftragen und bei 8.000 × g zentrifugieren. Spülen Sie jede Säule einmal mit 700 Mikrolitern Puffer RW, gefolgt von zwei Waschschritten mit jeweils 500 Mikrolitern Puffer RPE.Überführen Sie die Säulen in trockene Sammelgefäße und zentrifugieren Sie eine zusätzliche Minute, um verbleibende Flüssigkeit zu entfernen. Schließlich verwenden Sie 50&nbsp;Mikroliter Wasser, um die RNA zu eluieren. Anschließend messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer bei OD 216&nbsp;Nanometern.Um eine Genexpressionsprofilierung mittels digitaler Barcode-Technik durchzuführen, beginnen Sie damit, den Reporter-Code-Satz und den Capture-Code-Satz auf Eis aufzutauen. Geben Sie 130 Mikroliter Hybridisierungspuffer zum Reporter-Code-Satz hinzu. Vorsichtig umdrehen, um zu mischen, und kurz zentrifugieren.Fügen Sie als Nächstes 20 µL der Mischung zu jedem der 12 Reaktionsröhrchen hinzu. Geben Sie dann 10 µg Gesamt-RNA aus dem Gewebe zu jedem Röhrchen und mischen Sie durch Pipettieren. Abhängig vom Infektionsmodell, der Inokulumgröße und dem verwendeten Pathogenstamm variiert der Anteil an pathogenem RNA innerhalb der Gesamt-RNA zwischen 0 und 2 %. Daher muss die Gesamtmenge an RNA, die für jeden Ansatz hinzugefügt werden muss, empirisch optimiert werden.Fügen Sie nun fünf µL der Capture-Code-Sets in jedes Reaktionsgefäß hinzu. Mischen Sie durch Umdrehen der Gefäße und kurzem Wirbeln. Anschließend inkubieren Sie die Ansätze in einem Thermocycler bei 65 °C mit beheiztem Deckel für etwa 18 Stunden.Entnehmen Sie eine Probenkartusche aus dem 20 Grad Celsius-Bereich und lassen Sie sie auf Raumtemperatur erwärmen. Entnehmen Sie zwei Reagenzplatten aus dem 4 Grad Celsius-Bereich und zentrifugieren Sie sie zwei Minuten lang in einer Tischzentrifuge bei 670 × g. Richten Sie anschließend die Vorbereitungsstation gemäß der schrittweisen Anleitung auf dem Bildschirm ein, wobei die Hochsensibilitäts-Option auszuwählen ist.Entfernen Sie anschließend die Reaktionen vom Thermocycler und laden Sie sie unverzüglich auf die Aufbereitungsstation. Nach Durchlauf des dreistündigen Programms mit hoher Empfindlichkeit entfernen Sie die Kartusche und verschließen die Kanäle mit durchsichtigem Klebeband. Tragen Sie gegebenenfalls Mineralöl an der Unterseite der Kartusche auf.Danach die Kartusche in den digitalen Analysator einlegen. Den digitalen Analysator gemäß der schrittweisen Anweisungen auf dem Bildschirm einrichten und die Option für die hochauflösende Scanfunktion auswählen. Nach Durchführung des Scanprogramms die Ergebnisse herunterladen oder die Zusendung per E-Mail wählen und die Rohdaten in die Software des Herstellers importieren.Analysieren Sie die Daten gemäß dem Textprotokoll. Das in diesem Video dargestellte Protokoll bietet den besonderen Vorteil, dass es sowohl eine Capture-Sonde als auch eine Report-Sonde verwendet, um die Spezifität zu erhöhen und die Hintergrundsignale aus der Wirt-RNA zu verringern. Wie hier gezeigt, lagen die rohen Hintergrundzähldaten aus einer nicht infizierten Gewebeprobe sämtlich unter 10, während die rohen Zähldaten aus zwei infizierten Gewebeproben alle über 10 lagen.Die Rohzähldaten aus zwei biologischen Proben wiesen eine sehr gute Korrelation mit einem Bestimmtheitsmaß (R-Quadrat) von 0,945 auf. Die Plattform bietet zudem einen ausreichenden dynamischen Bereich, um natürliche biologische Expressionsniveaus abzudecken. Mithilfe eines Sonden-Sets, das 248 Gene der Umweltantwort spezifiziert, wurden zwei Phasen der Pathogen-Genexpression bestimmt.Eine frühe Genexpressionsantwort umfasst Gene mit signifikant unterschiedlichen RNA-Spiegeln zwischen den Inokulum- und den 12-Stunden-postinfektions-Proben. Es wurde außerdem eine späte Genexpressionsantwort entdeckt, die Gene mit signifikant unterschiedlichen RNA-Spiegeln zwischen dem 12-Stunden-Zeitpunkt und den 48-Stunden-postinfektions-Proben umfasst. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Genexpression von C.albicans während einer invasiven Infektion eines Säugetierwirts dynamisch reguliert wird.Diese Methode ist einfach und schnell. Das gesamte Verfahren von der Gewebesammlung bis zur Datenpräsentation erfordert weniger als 48 Stunden. Die manuelle Arbeitszeit beträgt für 12 Proben etwa vier Stunden.Obwohl diese Methode zur Erfassung der Genexpression von Pathogenen in vivo entwickelt wurde, kann sie ebenfalls verwendet werden, um die Genexpression des Wirts zu untersuchen. Forscher können daher gleichzeitig nützliche Informationen von beiden Seiten einer Infektion erhalten.

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Research

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JoVE Journal

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Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

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Droplet Barcode-basierte Einzelzelle Transkriptom des adulten Säugetier-Geweben

Dieser molekulare Ansatz zur Bestimmung der bakteriellen Fitness ermöglicht die präzise und genaue Detektion von Mikroorganismen mithilfe einzigartiger genomischer DNA-Barcodes, die über digitale PCR quantifiziert werden. Das Protokoll beschreibt die  Berechnung des Wettbewerbsindex für Salmonellenstämme; Die Technologie ist jedoch leicht an Protokolle anpassbar, die eine absolute Quantifizierung jedes genetisch verformbaren Organismus erfordern.

Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei Salmonellen

Hier präsentierten wir eine multiplexierte einzellige mRNA-Sequenzierungsmethode, um die Genexpression in embryonalen Geweben der Maus zu profilieren. Die tropfenbasierte einzelzellbasierte mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) in Kombination mit Multiplexing-Strategien kann Einzelne Zellen aus mehreren Proben gleichzeitig profilieren, was die Reagenzkosten deutlich reduziert und experimentelle Chargeneffekte minimiert.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine komplette Pipeline zur Analyse von RNA-Sequenzierungs-Transkriptomdaten von Rohlesungen bis hin zur Funktionsanalyse, einschließlich Qualitätskontroll- und Vorverarbeitungsschritten bis hin zu fortschrittlichen statistischen Analyseansätzen.

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Multiplex-Barcoding-Bildanalyse zur Immunprofilierung und räumlichen Kartierung bei der Einzelzellanalyse von Paraffingewebeproben

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