Gene Expression Profiling von Infecting Mikroben Mit einem Digital-Strichcode-Plattform

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Genexpression von Krankheitserregern in vivo genau zu messen, um Aufschluss darüber zu geben, wie sich ein Krankheitserreger an die infektiöse Umgebung anpasst und seinem Wirt Schaden zufügt. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten den Weg, die Dynamik der Genexpression von Krankheitserregern während einer realen Infektion auf verschiedenen Gewebetypen und zu mehreren Zeitpunkten zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie hochempfindlich und extrem reproduzierbar ist.

Diese Methode ermöglicht es, die Genexpression von Krankheitserregern aus einer winzigen Menge von Geweben aus einer realen Infektion zu quantifizieren. Um mit der Vorbereitung der Reagenzien zu beginnen, fügen Sie 2-Mercaptoethanol hinzu, um die RLT zu puffern, und mischen Sie gut. Bereiten Sie ein Gemisch von 25:24:1 Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol vor.

Homogenisierungsröhrchen vom Typ M beschriften und auf Eis abkühlen lassen. Beschriften Sie zwei Milliliter-Röhrchen mit Schraubverschluss und geben Sie etwa 300 Mikroliter Zirkonoxidkügelchen in jedes Röhrchen. Halten Sie die folgenden Instrumente einsatzbereit, darunter einen Gewebedissoziator, einen Bead-Beater, eine Tischzentrifuge mit Adaptern für 50-Milliliter-Röhrchen und 96-Well-Platten sowie ein Photometer.

Nehmen Sie zuvor gefrorene Nieren, die von C.albicans-infizierten Mäusen isoliert wurden, aus einem 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank und legen Sie sie auf Eis. Geben Sie 1,2 Milliliter Puffer RLT in jede Niere. Dann wird jede Niere mit Puffer in ein Homogenisierungsröhrchen vom Typ M umgefüllt.

Die Menge des verwendeten Puffer-RLT wird empirisch bestimmt. Zu viel Puffer RLT verdünnt die Probenkonzentration, während zu wenig das Homogenat sehr viskos und extrem schwer zu handhaben macht. Als nächstes homogenisieren Sie die Nieren mit einem Gewebedissoziator auf der vorgeladenen eingestellten RNA 2.01.

Dann eine Minute lang bei 1000 x G zentrifugieren. Füllen Sie 600 Mikroliter jedes Homogenats in ein Schraubverschlussröhrchen mit Zirkonoxidkügelchen um und bewahren Sie das restliche Homogenat auf Eis auf. Geben Sie 600 Mikroliter Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol in jedes Röhrchen, schließen Sie die Deckel fest und wirbeln Sie den Rührbesen drei Minuten lang bei vier Grad Celsius auf.

Zentrifugieren Sie bei 15.000 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie die wässrige Phase vorsichtig in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen und fügen Sie das gleiche Volumen von 70 % Ethanol hinzu. Dann auf die Schleudersäule laden und mit 8.000 x G schleudern.Mit 700 Mikrolitern Puffer RW jede Schleudersäule einmal waschen, gefolgt von zwei Wäschen mit 500 Mikrolitern Puffer RPE.

Füllen Sie die Säulen in trockene Sammelröhrchen und drehen Sie sie eine weitere Minute, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen. Zum Schluss verwenden Sie 50 Mikroliter Wasser, um die RNA zu eluieren. Verwenden Sie dann ein Spektralphotometer an OD 216 Animetern, um die RNA-Konzentration zu messen.

Um Genexpressionsprofile mithilfe von digitalem Barcode zu erstellen, beginnen Sie mit dem Auftauen des Reporter-Codesatzes und des Capture-Code-Satzes auf Eis. Fügen Sie dem Reporter-Codesatz 130 Mikroliter Hybridisierungspuffer hinzu. Zum Mischen umkehren und nach unten drehen.

Geben Sie anschließend 20 Mikroliter der Mischung in jedes der 12 Reaktionsröhrchen. Geben Sie dann 10 Mikrogramm Gesamtgewebe-RNA in jedes Röhrchen und mischen Sie es durch Pipettieren. Abhängig vom Infektionsmodell, der Größe des Inokulums und dem verwendeten Erregerstamm variiert der Anteil der Erreger-RNA an der Gesamt-RNA zwischen 0 und 2 %Daher sollte die Gesamtmenge an RNA, die jeweils hinzugefügt werden muss, empirisch optimiert werden.

Fügen Sie nun fünf Mikroliter Erfassungscode zu jedem Röhrchen hinzu. Mixen Sie, indem Sie die Röhrchen wenden und schnell herunterdrehen. Anschließend werden die Reaktionen in einem Thermocycler bei 65 Grad Celsius und einem beheizten Deckel etwa 18 Stunden lang inkubiert.

Nehmen Sie eine Probenkartusche aus 20 Grad Celsius und lassen Sie sie auf Raumtemperatur erwärmen. Entfernen Sie zwei Reagenzplatten von vier Grad Celsius und drehen Sie sie zwei Minuten lang in einer Tischzentrifuge bei 670 x G. Richten Sie als Nächstes die Vorbereitungsstation ein, indem Sie den Schritt-für-Schritt-Anweisungen auf dem Bildschirm folgen und die Option für hohe Empfindlichkeit auswählen.

Entfernen Sie dann die Reaktionen aus dem Thermocycler und laden Sie sofort die Vorbereitungsstation. Entfernen Sie nach dem Ausführen des dreistündigen Programms mit hoher Empfindlichkeit die Patrone und verwenden Sie durchsichtiges Klebeband, um die Fahrspuren abzudichten. Tragen Sie bei Bedarf Mineralöl auf die Unterseite der Kartusche auf.

Legen Sie dann die Patrone auf den digitalen Analysator. Richten Sie den digitalen Analysator gemäß den Schritt-für-Schritt-Anweisungen auf dem Bildschirm ein und wählen Sie die Option für hochauflösenden Scan. Laden Sie nach dem Ausführen des Scanprogramms die Ergebnisse herunter oder erhalten Sie sie per E-Mail und importieren Sie die Rohdaten in die Software des Herstellers.

Analysieren Sie die Daten gemäß dem Textprotokoll. Das in diesem Video demonstrierte Protokoll hat den einzigartigen Vorteil, dass es sowohl eine Capture-Sonde als auch eine Report-Sonde verwendet, um die Spezifität zu erhöhen und das Rauschen der Wirts-RNA zu reduzieren. Wie hier gezeigt, lagen die Hintergrund-Rohzahlen einer nicht infizierten Gewebeprobe alle unter 10, während die Rohzahlen von zwei infizierten Gewebeproben alle über 10 lagen.

Rohzählungen aus zwei biologischen Proben wiesen eine sehr gute Korrelation mit einem R-Quadrat-Wert von 0,945 auf. Die Plattform bietet auch einen ausreichenden Dynamikbereich, um natürliche biologische Expressionsniveaus abzudecken. Unter Verwendung eines Sondensets, das 248 Umweltreaktionsgene spezifizierte, wurden zwei Phasen der Genexpression von Krankheitserregern bestimmt.

Eine frühe Genexpressionsreaktion umfasst Gene mit RNA-Spiegeln, die sich zwischen den Inokulum- und 12-Stunden-Postinfektionsproben signifikant unterscheiden. Es wurde auch eine späte Genexpressionsreaktion entdeckt, die Gene mit RNA-Spiegeln umfasst, die sich zwischen den 12-Stunden-Proben und 48 Stunden nach der Infektion signifikant unterscheiden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Genexpression von C.albicans während einer invasiven Infektion eines Säugetierwirts dynamisch reguliert wird.

Diese Methode ist einfach und schnell. Das gesamte Verfahren von der Gewebeentnahme bis zur Datenexpression dauert weniger als 48 Stunden. Die Hands-on-Zeit beträgt rund vier Stunden für 12 Proben.

Während diese Methode entwickelt wurde, um die Genexpression von Krankheitserregern in vivo zu erfassen, kann sie auch zur Beantwortung der Genexpression des Wirts verwendet werden. Daher können Forscher nützliche Informationen von beiden Seiten einer Infektion gleichzeitig erhalten.