Gene Expression Profiling von Infecting Mikroben Mit einem Digital-Strichcode-Plattform

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Genexpression von Krankheitserregern in vivo genau zu messen, um Einblicke darüber zu gewinnen, wie sich ein Erreger an die infektiöse Umgebung anpasst und welchen Schaden er beim Wirt verursacht. Diese Technik eröffnete für Forscher im Bereich der Infektionskrankheiten die Möglichkeit, die Dynamik der Genexpression von Krankheitserregern während einer tatsächlichen Infektion in verschiedenen Gewebetypen und zu mehreren Zeitpunkten zu untersuchen. Der entscheidende Vorteil dieser Methode liegt in ihrer hohen Empfindlichkeit und außerordentlichen Reproduzierbarkeit.

Diese Methode ermöglicht es, die Genexpression von Pathogenen aus geringen Gewebemengen einer natürlichen Infektion zu quantifizieren. Um mit der Vorbereitung der Reagenzien zu beginnen, geben Sie 2-Mercaptoethanol zum Puffer RLT hinzu und mischen gründlich. Bereiten Sie eine 25:24:1-Mischung aus Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Lösung vor.

Etikettieren Sie M-Typ-Homogenisierungsgefäße und kühlen Sie sie auf Eis. Etikettieren Sie zwei Milliliter-Schraubdeckelgefäße und geben Sie jeweils etwa 300 Mikroliter Zirkonia-Perlen in jedes Gefäß. Bereiten Sie die folgenden Geräte zur Verwendung vor: einen Gewebe-Dissoziator, einen Bead-Beater, eine Tischzentrifuge mit Adaptern für 50-Milliliter-Gefäße und 96-Loch-Platten sowie einen Photometer.

Entnehmen Sie zuvor gefrorene Nieren, die von mit C.albicans infizierten Mäusen isoliert wurden, einem Gefrierschrank mit -80 Grad Celsius und legen Sie sie auf Eis. Geben Sie 1,2 Milliliter Puffer RLT zu jeder Niere hinzu. Danach dekantieren Sie jede Niere mit Puffer in ein M-Typ-Homogenisierrohr.

Die Menge an Puffer RLT wird empirisch bestimmt. Zu viel Puffer RLT verdünnt die Probenkonzentration, während zu wenig den Homogenat sehr viskos und äußerst schwer handhabbar macht. Anschließend homogenisieren Sie die Nieren mithilfe eines Gewebedissociators in der voreingestellten RNA-2.01-Einstellung.

Anschließend bei 1000 × g eine Minute zentrifugieren. 600 Mikroliter jedes Homogenats in ein Schraubverschlussgefäß mit Zirkonia-Perlen überführen und das verbleibende Homogenat auf Eis aufbewahren. 600 Mikroliter Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol zu jedem Gefäß hinzufügen, die Verschlüsse fest schließen und drei Minuten bei vier Grad Celsius im Perlenzerreißer vortexen.

Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 15.000 × g und vier Grad Celsius. Überführen Sie vorsichtig die wässrige Phase in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrofugegefäß und geben Sie ein gleiches Volumen an 70 %igem Ethanol hinzu. Anschließend die Probe auf die Säule auftragen und bei 8.000 × g zentrifugieren. Spülen Sie jede Säule einmal mit 700 Mikrolitern Puffer RW, gefolgt von zwei Waschschritten mit jeweils 500 Mikrolitern Puffer RPE.

Überführen Sie die Säulen in trockene Sammelgefäße und zentrifugieren Sie eine zusätzliche Minute, um verbleibende Flüssigkeit zu entfernen. Schließlich verwenden Sie 50 Mikroliter Wasser, um die RNA zu eluieren. Anschließend messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer bei OD 216 Nanometern.

Um eine Genexpressionsprofilierung mittels digitaler Barcode-Technik durchzuführen, beginnen Sie damit, den Reporter-Code-Satz und den Capture-Code-Satz auf Eis aufzutauen. Geben Sie 130 Mikroliter Hybridisierungspuffer zum Reporter-Code-Satz hinzu. Vorsichtig umdrehen, um zu mischen, und kurz zentrifugieren.

Fügen Sie als Nächstes 20 µL der Mischung zu jedem der 12 Reaktionsröhrchen hinzu. Geben Sie dann 10 µg Gesamt-RNA aus dem Gewebe zu jedem Röhrchen und mischen Sie durch Pipettieren. Abhängig vom Infektionsmodell, der Inokulumgröße und dem verwendeten Pathogenstamm variiert der Anteil an pathogenem RNA innerhalb der Gesamt-RNA zwischen 0 und 2 %. Daher muss die Gesamtmenge an RNA, die für jeden Ansatz hinzugefügt werden muss, empirisch optimiert werden.

Fügen Sie nun fünf µL der Capture-Code-Sets in jedes Reaktionsgefäß hinzu. Mischen Sie durch Umdrehen der Gefäße und kurzem Wirbeln. Anschließend inkubieren Sie die Ansätze in einem Thermocycler bei 65 °C mit beheiztem Deckel für etwa 18 Stunden.

Entnehmen Sie eine Probenkartusche aus dem 20 Grad Celsius-Bereich und lassen Sie sie auf Raumtemperatur erwärmen. Entnehmen Sie zwei Reagenzplatten aus dem 4 Grad Celsius-Bereich und zentrifugieren Sie sie zwei Minuten lang in einer Tischzentrifuge bei 670 × g. Richten Sie anschließend die Vorbereitungsstation gemäß der schrittweisen Anleitung auf dem Bildschirm ein, wobei die Hochsensibilitäts-Option auszuwählen ist.

Entfernen Sie anschließend die Reaktionen vom Thermocycler und laden Sie sie unverzüglich auf die Aufbereitungsstation. Nach Durchlauf des dreistündigen Programms mit hoher Empfindlichkeit entfernen Sie die Kartusche und verschließen die Kanäle mit durchsichtigem Klebeband. Tragen Sie gegebenenfalls Mineralöl an der Unterseite der Kartusche auf.

Danach die Kartusche in den digitalen Analysator einlegen. Den digitalen Analysator gemäß der schrittweisen Anweisungen auf dem Bildschirm einrichten und die Option für die hochauflösende Scanfunktion auswählen. Nach Durchführung des Scanprogramms die Ergebnisse herunterladen oder die Zusendung per E-Mail wählen und die Rohdaten in die Software des Herstellers importieren.

Analysieren Sie die Daten gemäß dem Textprotokoll. Das in diesem Video dargestellte Protokoll bietet den besonderen Vorteil, dass es sowohl eine Capture-Sonde als auch eine Report-Sonde verwendet, um die Spezifität zu erhöhen und die Hintergrundsignale aus der Wirt-RNA zu verringern. Wie hier gezeigt, lagen die rohen Hintergrundzähldaten aus einer nicht infizierten Gewebeprobe sämtlich unter 10, während die rohen Zähldaten aus zwei infizierten Gewebeproben alle über 10 lagen.

Die Rohzähldaten aus zwei biologischen Proben wiesen eine sehr gute Korrelation mit einem Bestimmtheitsmaß (R-Quadrat) von 0,945 auf. Die Plattform bietet zudem einen ausreichenden dynamischen Bereich, um natürliche biologische Expressionsniveaus abzudecken. Mithilfe eines Sonden-Sets, das 248 Gene der Umweltantwort spezifiziert, wurden zwei Phasen der Pathogen-Genexpression bestimmt.

Eine frühe Genexpressionsantwort umfasst Gene mit signifikant unterschiedlichen RNA-Spiegeln zwischen den Inokulum- und den 12-Stunden-postinfektions-Proben. Es wurde außerdem eine späte Genexpressionsantwort entdeckt, die Gene mit signifikant unterschiedlichen RNA-Spiegeln zwischen dem 12-Stunden-Zeitpunkt und den 48-Stunden-postinfektions-Proben umfasst. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Genexpression von C.albicans während einer invasiven Infektion eines Säugetierwirts dynamisch reguliert wird.

Diese Methode ist einfach und schnell. Das gesamte Verfahren von der Gewebesammlung bis zur Datenpräsentation erfordert weniger als 48 Stunden. Die manuelle Arbeitszeit beträgt für 12 Proben etwa vier Stunden.

Obwohl diese Methode zur Erfassung der Genexpression von Pathogenen in vivo entwickelt wurde, kann sie ebenfalls verwendet werden, um die Genexpression des Wirts zu untersuchen. Forscher können daher gleichzeitig nützliche Informationen von beiden Seiten einer Infektion erhalten.