Name: Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Erfahren Sie eine hochdurchsatz-mikrofluidische Plattform für Einzelzell-Genomsequenzierung. Diese Methode kapselt und barcodiert Zellen einzeln, um genomische Heterogenität zu erhalten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Science Foundation durch den CAREER Award (Grant-Nummer DBI-1253293); die National Institute of Health (NIH) (Zuschuss Zahlen HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); und das Defense Advanced Research Projekte Agentur Leben Gießereien Programm (Vertragsnummern HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

<ol><li>Navin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li>
<li>Ni, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+copy+number+variation+patterns+among+single+circulating+tumor+cells+of+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).</li>
<li>Schmidt, H., Hensel, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14726454">Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).</li>
<li>Martínez, J. L., Baquero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+among+strategies+associated+with+bacterial+infection%3A+pathogenicity+epidemicity%2C+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+genomes+from+uncultivated+environmental+microorganisms+using+FACS-based+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li>
<li>Zhang, H., Liu, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers+for+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers for single cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).</li>
<li>Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+microfluidics+for+digital+quantification+and+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing.</a> Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+clonal+origins+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+by+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+labeling+%28Hi-SCL%29+for+RNA-Seq+using+drop-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics.</a> PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).</li>
<li>Amini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haplotype-resolved+whole-genome+sequencing+by+contiguity-preserving+transposition+and+combinatorial+indexing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing.</a> Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haplotyping+germline+and+cancer+genomes+with+high-throughput+linked-read+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).</li>
<li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nature Communications. 7, 11784(2016).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing+at+ultra-high-throughput+with+microfluidic+droplet+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding.</a> Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).</li>
<li>Novak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiplex+gene+detection+and+sequencing+with+microfluidically+generated+agarose+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Internation+Edition%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions.</a> Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).</li>
<li>Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lysis+methods+for+the+extraction+of+bacterial+DNA+for+analysis+of+the+vaginal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota.</a> PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).</li>
<li>Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beating+Poisson+encapsulation+statistics+using+close-packed+ordering%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering.</a> Lab on a Chip. 9 (18), 2628(2009).</li>
<li>Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-based+optical+waveguides+with+live+cell+encapsulation+and+integrated+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Optic+Letters%22%5BJournal%5D)">Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics.</a> Optic Letters. 37 (9), 1472(2012).</li>
<li>Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chemical-free+breaking+of+microfluidic+emulsions+with+a+hand-held+antistatic+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun.</a> Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).</li>
<li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li>
<li>Chao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analysis+reveals+significant+changes+of+microbial+compositions+and+protective+functions+during+drinking+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment.</a> Scientific Reports. 3 (1), 3550(2013).</li>
<li>Fierer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-biome+metagenomic+analyses+of+soil+microbial+communities+and+their+functional+attributes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).</li>
<li>Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+metagenomic+sequences%3A+methods+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Classification of metagenomic sequences: methods and challenges.</a> Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).</li>
<li>Eastburn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+droplet+enrichment+for+targeted+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 43 (13), e86(2015).</li>
<li>Clark, I. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+helix+in+a+haystack%3A+nucleic+acid+cytometry+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).</li>
</ol>

Patente im Zusammenhang mit diesem Workflow wird vielleicht an Mission Bio, von welchen Adam R. Abate lizenziert ein Aktionär.

Die SiC-Seq mikrofluidischen Workflow produziert einzellige Genom-Sequenzierungsdaten von Tausenden von Bakterienzellen. Digitalen Barcodes gespleißt auf die Genome der Microgel-gekapselte Zellen ermöglichen die in Silico Dekonvolution NGS Daten in Gruppen von Barcodes liest aus derselben Zelle. Ein kontrollexperiment mit einer mikrobiellen Gemeinschaft von bekannter Zusammensetzung ist notwendig für die Beurteilung der Reinheit der Barcode-Gruppen. Ein großer Teil der Low-Reinheit Gruppen zeigt, dass die Zelle Kapselung Rate zu hoch ist oder gibt es erhebliche Tröpfchen Cross-Kontamination während der mikrofluidischen Verarbeitungsschritte auftreten. Poisson Statistiken zufolge sollte die Barcodes und Zellen in einem Ziel-Verhältnis von 1 Teilchen für jeden 10 Tropfen, die Rate der mehrere Kapselung Ereignisse auf weniger als 5 % von allen nicht-leere Tröpfchen zu begrenzen gekapselt werden. Eine Kapselung-Rate höher als dies steigt die Preise von Dubletten exponentiell, so ist die Überprüfung der Kapselung Verhältnis während des Dropmaking-Prozesses von entscheidender Bedeutung. Nutzer sollten die Kapselung von mehreren Zellen in eine einzelne Microgel besonders vorsichtig sein, da liest aus verschiedenen Zellen teilen die gleiche Barcode-Sequenz Bioinformatically getrennt werden können. Im Fall, dass 1 Zelle erhält 2 verschiedene Barcodes, die Barcode-Gruppe-Reinheit ist nicht betroffen, obwohl die Fülle Metriken verzerrt werden, wenn durch Barcode-Sequenz zählen.
Droplet Cross-Kontamination auch durch suboptimale Fusion Bedingungen entstehen können. Bei einer erfolgreichen Operation kann mikrofluidischen Fusion Gerät (Abbildung 5) kontrollierbar 1 Barcode-Tropfen mit 1 Microgel und einem Volumen von PCR-Reagenz koppeln. Non-Ideal Flussraten führt ein Tröpfchen Paarung bei falschen Verhältnisse: 1 Barcode könnte zum Beispiel mit 2 mikrogele gekoppelt werden. Alle Durchflussmengen im Protokoll aufgeführten sollen Schätzungen und können je nach geringfügige Abweichungen in der Geometrie und Tröpfchen Gerätegrößen angepasst werden müssen. Benutzer mit Zugriff auf Kameras mit High-Speed-Aufnahme-Funktionen (> 10.000 Bilder/s) sollten die richtigen Tropfen Fusion zu Beginn und im Laufe der Operation mikrofluidischen überprüfen. Benutzer ohne Zugriff auf eine High-Speed-Kamera ein kleines Volumen der zusammengeführten Ausgabe sammeln und manuell messen die tröpfchengrößen unter dem Mikroskop. Die Tröpfchengröße sollte einheitlich sein: ein Übermaß an individuellen Barcodes oder Microgel Tropfen zeigt an, dass die Reinjektion entsprechend gesenkt werden sollte.
Mehrere werden allgemeine Vorkehrungen beim Umgang mit mikrogele und Microdroplets, ihre Integrität zu bewahren. Mikrogele, muss obwohl mechanisch robust, ausreichend vor den Bruch und Waschschritte dafür vollständig Gelierung gekühlt werden. Non-sphärische mikrogele sind ein Indiz, das die Agarose nicht ausreichend Zeit gegeben, zu festigen. Beim Waschen mikrogele spin-down die Suspensionen mit der erforderlichen Geschwindigkeit um ein Produkt zu vermeiden. Agarose Hydrogel hat einen Brechungsindex genau passend, das Wasser und kann schwierig sein, in ein Rohr22, zu sehen, so dass Benutzer die Gel-Liquid-Grenze vor Aspiration sorgfältig identifizieren sollte. Wasser-in-Öl-Tropfen sind anfällig für Koaleszenz durch den Aufbau von statischen Kräfte23 Labor Handschuhe und Schläuche. Aus diesem Grund empfehlen wir laden die Tröpfchen Reinjektion Spritzen mit bloßen Händen und behandeln die Reinjektion Linien mit einem Anti-Statik-Pistole vor die Pumpe ansaugen. Zusammengeführte große Tröpfchen können entfernt werden, durch langsam rotierende die Emulsionen in einer Spritze und manuell Absaugen von großen Tropfen, die in der Nähe der Spitze aufgrund ihrer größeren Auftrieb zu sammeln.
SiC-Seq ist die erste Technologie nachzuweisen einzellige Genomsequenzierung von > 50.000 Bakterienzellen. Diese Plattform bietet erhebliche Vorteile im Durchsatz über bestehende Ansätze und ermöglicht eine tiefere Probenahme von heterogenen mikrobieller Gemeinschaften. Bisher haben mikrofluidischen Technologien für einzellige Genom-Sequenzierung Microchambers9 und Mikrovertiefungen24 für Zelle Isolation und Verstärkung, aber mit Durchsätzen im Bereich von nur Dutzende bis Hunderte von Zellen eingesetzt. Der Fluss sortieren einzelner Zellen in Wellplates5,6 erfordert keine spezielle mikrofluidischen Instrumentation aber besitzt einen ähnlich geringen Durchsatz. Da die Boden- und Wasserproben aus der Umgebung häufig alpha Unterschiede haben > 1.000 auf die Spezies Stufe25,26, SiC-Seq ist ein großer Vorteil aufgrund seiner Fähigkeit, eine weit größere Anzahl von Organismen zu probieren. Die SiC-Seq-Workflow ist anpassungsfähig auf Zelle Eingaben von Laborkultur, die natürliche Umwelt oder eine lebende Host. Eine Zellprobe muss nur in einer wässrigen Suspension und frei von großen Partikeln (> 10 µm) für mikrofluidischen Kapselung geeignet. Beispielsweise wurde die Methode bereits zu einer Probe von Meerwasser mit Hilfe einer Reihe von Waschanlagen und Filterung Schritte aus, um die Zellen vor der Kapselung17Vorverarbeiten angewendet.
Die SiC-Seq-Protokoll generiert eine relativ spärliche Sequenzierung Datenmenge aus jeder einzelnen Zelle und möglicherweise nicht für alle Anwendungen geeignet. Einige Bioinformatik-Algorithmen wie de Novo Genom Montage oder Einzel-Nukleotid-Variante (SNV) aufrufen erfordern höhere Abdeckung tiefen, effektiv zu arbeiten. Stattdessen können Barcode Gruppen gruppierten in Silico taxonomische binning Methoden27 sein, so dass Algorithmen auf größere Sätze liest angewendet werden können. Die relativ niedrige Barcoding Gesamteffizienz der SiC-Seq-Workflow kann auch in Fällen Herausforderungen denen die Verfügbarkeit der eingabesample niedrig ist. SiC-Seq basiert auf einer Poisson-verteilten Barcode Kapselung Schritt, daher etwa 10 % der Zellen erhalten einen molekularen Barcode und werden während der abschließenden Bibliothek Vorbereitungsschritt verstärkt. Zwar ist dies vergleichbar mit anderen Microdroplet-basierte Barcode Systeme10, Benutzer arbeiten mit kostbaren Zellproben haben Schwierigkeiten, die die entsprechende Bibliothek Ausbeute für die Sequenzierung zu erreichen und möglicherweise müssen Sie die Anzahl der PCR-Zyklen im Finale zu erhöhen Verstärkung Schritt. Eine andere mögliche Lösung für Benutzer mit mikrofluidischen Expertise ist es, positive Barcode Tröpfchen Sortieren nach dem digitalen PCR Schritt, womit sich den Gesamtwirkungsgrad Barcoding auf > 85 %28.
Eine mögliche zukünftige Richtung für SiC-Seq-Technologie wird den Workflow für die Verwendung mit Säugerzellen, ebnet den Weg für neue klinische Studien der einzelligen angepasst. Als Beispiel, eine Analyse der die Kopie Nummer Unterschiede zwischen den einzelnen Krebs Zellen Mai unser Verständnis der Rolle der Heterogenität in Krebs Pathologie2weiter. Alternativ würde die Integration von SiC-Seq mit vorhandenen Methoden zur Sonde und DNA-Sequenzen von Interesse29 bereichern die gezielte einzellige Sequenzierung von Subpopulationen oder seltene Sorten von Zellen ermöglichen. Mit Umweltproben könnten Gene innerhalb einer bekannten Stoffwechselweg gezielt und Kontextuell neben benachbarte Gene zur Identifizierung neuartiger genomischer Inseln analysiert werden. Von innerhalb einer menschlichen Host-Umgebung, niedrige Titer Pathogene Bakterien Proben isoliert werden konnte und sequenziert einzellige Ebene mehr untersuchen eng ihre genotypischen Ursprünge der Virulenz.

Das Genom dient als eine Blaupause der zelluläre Identität und Funktion, mit der Gesamtheit des Organismus Potenzial Codierung ist. Ein Verständnis der zellulären Biologie an der Genom-Ebene kann die beobachteten phänotypische Vielfalt innerhalb heterogener Zell-Populationen erklären. Diese Heterogenität ist offensichtlich in biologischen Systemen und hat breite Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit und Krankheit. Zum Beispiel sind Genvarianten Kopie Zahl unter den Tumorzellen, die Entwicklung und Ausbreitung von Krebs1,2verbunden. Bei bakteriellen Infektionen Pathogenitätsinseln vorhanden in einem kleinen Bruchteil der Genome horizontal übertragen werden können und führen zu der Verbreitung von Antibiotika-resistente Bakterien3,4. Eine primäre Herausforderung bei der Untersuchung der Genome der Ebene der einzelligen ist die geringe Mengen an DNA zur Verfügung sowie die Notwendigkeit, Tausende von Zellen zu analysieren, die ganze Vielfalt der Genotypen zu probieren. Aus diesen Gründen haben Einschränkungen in experimentelle Durchsatz die Wirksamkeit der einzelligen Studien, Vorspannen Ergebnisse in Richtung der am häufigsten vorkommenden Zellen verhindert. Einzellige ISOLIERUNGSTECHNIKEN wie Flow sortieren,5,6, optische Pinzette7, Einbettung in loser Schüttung Gele8und Mikrofluidik9 sind in der Lage hunderte von Zellen für die Sequenzierung; Dies ist jedoch nur einen kleinen Bruchteil von den meisten Proben. Eine Methode für einzellige Genom-Sequenzierung mit wesentlich höheren Durchsatz würde erlauben, tiefer und umfassender Profilierung der Zell-Populationen, damit Aufklärung die Rolle der genotypischen Vielfalt innerhalb dieser Gemeinschaften.
Droplet Mikrofluidik ermöglicht die Hochdurchsatz-Manipulation von Zellen und biologische Reagenzien innerhalb von Millionen von Picoliter-Skala Reaktoren. Heute, Microdroplet, die Technologien verwendet wurden, um differentielle Expression-Muster zwischen den Zellen von heterogenen Gewebe10,11,12, studieren tief Sequenz lange Moleküle13,14 ,15und Verhalten Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (ChiP-Seq) Analysen auf Einzelzellen16. In der Tat sind Microdroplets hohem Durchsatz, unterteilte Operationen, so dass sie offen für Anwendungen in einzellige Genomics. Die Entwicklung dieser Technologie stellt jedoch seinen eigenen einzigartigen technologischen Herausforderungen. Zellen müssen lysiert, gereinigt und mit minimalen Bias, um einheitlich Probe Zellpopulationen verstärkt werden. Außerdem, im Gegensatz zu Polyadenylated mRNA Transkripte in Säugerzellen gibt es keine vergleichbare Molekulare Motiv im Genom, die Erfassung von der Ziel-Nukleinsäure zu erleichtern. Aus diesen Gründen wurde die Sequenzierung des Genoms einzellige in Microdroplet Plattformen schwer umzusetzen.
Dabei bieten wir ein detailliertes Protokoll unseres bereits berichtet einzellige mikrofluidischen Ansatzes in der Lage, der Sequenzierung der Genome von Zehntausenden von Zellen in einem einzigen Experiment17. Mit dieser Technologie, genannt SiC-Seq Bakterienzellen in Mikron-Skala Hydrogele gekapselt und individuell lysiert, Tagmented, und fusionierte mit einer Microdroplet, enthält einen einzigartige Oligonukleotid-Barcode, der auf die Zelle genomischer DNA über gespleißt wird eine einzigen Überschneidungen Erweiterung Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die Hydrogele dienen als isolierte Container in denen hohen Molekulargewicht genomischer DNA sterisch ummantelt ist, ermöglicht kleinere Moleküle wie Wasch- und lytischen Enzymen Zugang zu reinigen DNA vor Barcoding18. Dieses Protokoll verarbeitet > 50.000 Einzelzellen in einer Angelegenheit von Stunden, wodurch eine Barcode-Bibliothek für die Sequenzierung bereit. Nach der Sequenzierung sind die liest demultiplexed entsprechend ihrer einzellige Barcode Reihenfolge, was in einem Dataset besteht aus Millionen von liest, jeder mit einem zellulären Index.

<table><tbody><tr><td>3" Siliziumwafer, P-Typ, reine Testqualität</td><td>Universitätswafer</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025 Fotolack</td><td>Microchem</td><td>17030192</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>Spezialbeschichtungssysteme</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>Fotomasken</td><td>CadArt Servcies</td> <td>(kundenspezifisch)</td><td>Siehe ergänzende Dateien für Maskendesigns</td></tr><tr><td>PGMEA-Entwickler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>484431</tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109827</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikonelastomer Kit</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Entgasungskammer</td><td>Bel-Art</td><td>42025</td><td></td></tr><tr><td>0,75 mm Biopsiestanze</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Objektträger (75 mm x 50 mm)</td><td>Corning</td><td>294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Aquapel (hydrophobe Glasbehandlung)</td><td>Pittsburgh Glass Works</td><td>47100</td><td></td></tr><tr><td>PE-2 Polyethylen-Schlauch</td><td>Scientific Commodities</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spritzen</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>27 Gauge Nadeln</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-501</td><td></td></tr><tr><td>Novec HFE-7500 fluoriertes Öl ( HFE)</td><td>3M</td><td>98-0212-2928-5</td><td></td></tr><tr><td>FC-40 fluoriertes Öl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9755</td><td></td></tr><tr><td>PEG-PFPE Tensid</td><td>Ran Biotechnologies</td><td>008-Fluortensid</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Raumheizung Lasko&nbsp;</td><td>CD09250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, niedrige Geliertemperatur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>a9414</td><td></td></tr><tr><td>TE (10X)</td><td>Rockland</td><td>mb-007</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X, pH 7,4</td><td>E& K Scientific Products</td><td>EK-65083</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep (Dichtegradientenmedium)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>d1556</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H-Perfluor-1-Octanol (PFO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>370533</td><td></td></tr><tr><td>Span 80 (Sorbitanmonooleat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s6760</td><td></td></tr><tr><td>Hexan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (Polysorbat 20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p2287</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym Typ IV</td><td>MP Biomedicals</td><td>195303</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase (Hefelytisches Enzym)</td><td>Zymo Research</td><td>e1004</td><td></td></tr><tr><td>Lysostaphin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7386</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 7,5, 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Teknova</td><td>d9750</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumdodecylsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>New England Biosciences</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 Proof (100%)</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I (Nukleinsäure-Färbung)</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>PEG 6k</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (Octylphenolethoxylat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>t8787</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix)</td><td>New England Biosciences</td><td>m05365</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4464263</td><td></td></tr><tr><td>Warmstart 2.0 Bst Polymerase (isotherme Polymerase)</td><td>New England Biosciences</td><td>m0538m</td><td></td></tr><tr><td>NT Puffer aus dem Nextera XT Kit (Neutralisationspuffer)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>Kaltkathoden-Fluoreszenz-Wechselrichter</td> <td>(kundenspezifisch)(</td><td>benutzerdefiniert)</td><td></td></tr><tr><td>Gleichstrom-Netzteil</td><td>Mastech</td><td>HY1503D</td><td></td></tr><tr><td>Zerostat 3 antistatische Pistole</td><td>Milty</td><td>5036694022153</td><td></td></tr><tr><td>3D-gedruckter Zentrifugenspritzenhalter</td> <td>(benutzerdefiniert)</td><td>(benutzerdefiniert)</td><td>Siehe Ergänzende Dateien für 3D-Druckdatei</td></tr><tr><td>Zymo DNA Clean & Konzentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr></tbody></table>

eine höchste durchsatz mikrofluidischen plattform für einzellige genom-sequenzierung

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequenziertechnologien haben einen Paradigmenwechsel von Masse, einzellige Auflösung als Reaktion auf eine sich entwickelnde Verständnis der Rolle der zellulären Heterogenität in biologischen Systemen unterzogen. Jedoch wurde einzellige Sequenzierung von großen Populationen durch Einschränkungen bei der Verarbeitung von Genome für die Sequenzierung behindert. In diesem Beitrag beschreiben wir einer Methode für einzellige Genom-Sequenzierung (SiC-Seq) die Tröpfchen Mikrofluidik verwendet, um zu isolieren, zu verstärken und Barcode der Genome einzelner Zellen. Zelle die Kapselung in mikrogele ermöglicht es, die unterteilte Reinigung und Tagmentation der DNA, während eine mikrofluidischen Fusion effizient jedes Genom mit einem einzigartigen einzellige Oligonukleotid-Barcode Paare erlaubt > 50.000 Einzelzellen sequenziert werden pro Durchlauf. Die Sequenzierungsdaten ist per Barcode Generieren von Gruppen von liest aus Einzelzellen demultiplexed. Als eine Hochdurchsatz- und Low-Bias Methode der einzelligen Sequenzierung wird SiC-Seq ein breiteres Spektrum von genomischen Studium richtet sich an unterschiedliche Zellpopulationen ermöglichen.

Die SiC-Seq experimentelle Workflow enthält 3 PDMS mikrofluidischen Geräten hergestellt, mit einem weichen Lithographie-Verfahren (Abbildung 1). Eine Co-Flow-Dropmaker (Abbildung 3A) erzeugt 25 µm von digitalen Barcode Tröpfchen für die Kennzeichnung von genomischen DNS mit einer eindeutigen Kennung der einzelligen. Die Barcode-Oligonukleotide bestehen aus einer 15 bp Entartete Abfolge flankiert von PCR-Griffe für Verstärkung (Tabelle 2, BAR-Primer). Die Barcodes werden verdünnt, um eine femtomolare Konzentration der Einzelmolekül-Kapselung zu erreichen und alle Tröpfchen erhalten entweder 0 oder 1 Barcode FCP. Die Tröpfchen mit einem Barcode werden verstärkt, viele Kopien der Doppelstrang-Barcode Amplifikate nachgeben. Ein Nukleinsäure-Fleck wird verwendet, um die erfolgreiche Verstärkung zu überprüfen und zu quantifizieren die Kapselung Rate der Barcode-Fragmente (Abbildung 4 b). Die mikrogele entstehen durch Co fließt eine Bakterienzelle Federung und einem geschmolzenen Agarosegel bei gleicher Flussraten (Abbildung 2A). Die Agarose wird in zweimal die gewünschte Endkonzentration, vorbereitet, wie die Co-Flow Dropmaking Prozess effektiv die wässrigen Lösungen um den Faktor 2 verdünnt. Da die Agarose abkühlt, erstarrt es in eine 25 µm Durchmesser Microgel besetzen die kugelförmigen Volumen des tropfenabscheiders.
Eine Reihe von Wasch- und Lyse Schritten reinigt den hohe Molekulargewicht genomischen DNA in mikrogele (Abb. 2 b). Nach dem Bruch der Emulsionen, wässrige Waschungen erfolgt in großen Mengen, Spur organische Lösungsmittel verdünnen die nachgelagerten enzymatischen Behandlungen hemmen können. Die gewaschenen mikrogele werden unter dem Mikroskop zu überprüfen, die Zelle Kapselung Rate (Abb. 4A) beobachtet. Ein Cocktail von Enzymen mit breiten lytische Aktivität ergänzt die Microgel Aussetzung, die Zellwände der Bakterien und Eukaryoten Mikroben19zu verdauen. Eine zweite Behandlung mit Proteinase K und Reinigungsmittel die Proteine abbaut und zellenrückstand solubilisiert.
Tagmentation der gereinigte DNA erfolgt in Tropfen, um potenzielle infolge der Diffusion von kleinen Tagmented DNA-Fragmente zwischen mikrogele18Kreuzkontamination zu vermeiden. Ein Tröpfchen Kapselung Gerät (Abb. 3 b) teilt jedem mikrogel mit einem Puffer und Tagmentation Enzym, welches gleichzeitig doppelsträngige DNA Fragmente während auch "tagging" es mit einer vorinstallierten Oligonukleotid-20. Die mikrogele werden in die Tröpfchen als dicht an dicht Partikel erreichen Kapselung Preise nähert sich 1 Microgel für jeden Tropfen mit einigen Dubletten21 (Abbildung 4) geladen.
Im letzten Schritt des mikrofluidischen Workflows (Abbildung 2) führt ein Gerät einen doppelten Fusion Vorgang 1 Barcode-Tropfen, 1 Microgel-haltigen Tropfen und die Verstärkung Mischung in zwei kontrollierten Schritten kombinieren. Erstens ist ein Tröpfchen mit PCR Reagenz gepaart und mit einem Barcode-Tropfen in der Region erscheinen in gelb (Abbildung 5) zusammengeführt. Salzwassersee Elektroden in der Mikrofluidik-Kanal erzeugen einen hohen elektrischen Feld Farbverlauf, der Tröpfchen Fusion auslöst. In ähnlicher Weise ist das erste zusammengeführte Tröpfchen gepaart mit einem Microgel Tröpfchen und ein zweites Mal in der Region erscheinen in rot zusammengeführt. Die Tröpfchen werden gesammelt und thermischen Gefahren-Chip in einer Single-Überlappung Verlängerung (SOE) PCR. Die überlappenden komplementäre Enden des Barcodes und die Tagmented genomischer DNA ermöglichen Fusion und exponentielle Amplifikation nur richtig Barcode Konstrukte.
Die Sequenzierungsdaten zuerst gefiltert durch eine Lesen Sie Qualität und dann durch die Gruppierung der liest laut ihrer 15-bp einzellige Barcode-Sequenz analysiert. Für eine Barcode-Gruppe als gültig betrachtet werden sollte es eine Mindestanzahl von liest enthalten; Diese Schwellwerte schränkt die Analyse auf Zellen mit eine sinnvolle Menge an Sequenzierungsdaten und den PCR mutiert Barcode "Waisen" aus dem Dataset entfernt. In diesem Beispiel ausführen, befindet sich das Minimum auf 7,5 kbit/s pro Gruppe (50 mal gelesen von 150 bp jedes). Ein Histogramm der Barcode Grafen gegen die Größe der Gruppe zeigt, dass ein erheblicher Teil der gültigen Barcode Gruppen oberhalb der Schwellengröße (Abbildung 6A).
In einem kontrollexperiment, wo die mikrobiellen Gemeinschaft Zusammensetzung bekannt ist, werden die Reinheit und die relative Häufigkeit Metriken zur Bewertung der Qualität einer SiC-Seq laufen. Hier ist eine synthetische 10-Zelle-Gemeinschaft bestehend aus 3 gram-negativen Bakterien, 5 gram-positiven Bakterien und Hefen 2 analysiert. Die Reinheit einer bestimmten Barcode-Gruppe ist definiert als die Anzahl der Lesevorgänge, die Zuordnung zu den häufigsten Genom in der Gruppe geteilt durch die Gesamtzahl der Lesevorgänge in der Gruppe. Die überwiegende Mehrheit der Barcode-Gruppen haben Reinheiten größer 0,95 (Abb. 6 b). Relative Häufigkeit der Zelltypen wird berechnet durch zählen der rohen liest und zählen die Barcode-Gruppen, wo die Gruppen einen Zellentyp entspricht dem Konsens von seiner Mitglied liest (Abbildung 6) zugeordnet sind. Die Fülle der Lese- und Barcode-Gruppen verfolgen in etwa zu gleichen Teilen, darauf hinweist, dass die Zell-Populationen abgetastet wird werden, so dass bestimmte Arten nicht in Gruppen unverhältnismäßig klein oder groß Barcode enthalten sind. Plotten der aggregierten Abdeckung aller Barcode-Gruppen aus einer einzigen Spezies zeigt eine hohe Abdeckung über das gesamte Genom, mit wenigen oder keinen ausfallende Regionen (Abbildung 7). Die Einheitlichkeit der Abdeckung mit einer Häufigkeitsverteilung der normalisierten Flächendeckungswerte, mit die meisten Werte um den Mittelwert zentriert überprüft werden kann (Abbildung 7, inset).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig1.jpg"> Abbildung 1 : Herstellung von mikrofluidischen Geräten durch Photolithographie. (A) Master Formen mit einer einzigen Funktion Höhe werden von Spin coating eine Schicht von SU-8 Photoresist auf einem Silizium-Wafer hergestellt. Der Fotolack ist dann eine Photolithographische Maske mit UV-Licht, Vernetzung der exponierten SU-8 gemustert. Schließlich ist in einem Entwickler-Bad Uncrosslinked SU-8 aufgelöst. Die resultierende Form wird verwendet, um PDMS zu werfen, das auf einen Objektträger zu produzieren das komplette mikrofluidischen Gerät verbunden ist. (B) für eine Doppelschicht-Gerät beginnt die Herstellung ähnlich mit Spin Coating und Belichtung Schritte. Diese Schritte werden dann wiederholt, ein zwei-Schicht-Gerät erstellen. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig2.jpg"> Abbildung 2: Überblick über die SiC-Seq-Workflow. (A) A mikrobielle Federung ist Co floss mit geschmolzenen Agarose in einem Dropmaker Gerät Einzelzellen in mikrogele zu kapseln. (B) die mikrogele unterliegen einer Reihe von Waschungen, die bakterielle genomische DNA zu reinigen. Lytischen Enzyme verdauen die Zellwände von gram-positiven Bakterien und Hefen und Waschmittel solubilisiert der zelltrümmer. Die mikrogele sind neu gekapselt in Tröpfchen für die Tagmentation, Cross-Kontamination zu reduzieren. (C) der mikrofluidischen Fusion vereint digitale PCR Barcode, ein Tagmented Microgel Genom und eine Verstärkung-Mischung mit einer Rate &gt; 1 kHz. Off-Chip SOE-PCR Spleiße einen einzigartigen einzellige Barcode auf das Tagmented Genom und selektiv verstärkt voll Barcode Konstrukte. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig3.jpg"> Abbildung 3: Mikrofluidische Geräte für Dropmaking und Microgel Re Kapselung. (A) dieses Panel zeigt eine Co-Flow-Dropmaker (25 µm Funktion Höhe). Zellen und flüssige Agarose werden in das Gerät bei gleicher Flussraten bis 25 µm Tröpfchen an einer 25 µm X 25 µm Kreuzung produzieren vorgestellt. Für die digitalen Barcode-Dropmaking der zelleneinströmungsöffnung angeschlossen ist, und eine PCR-Mischung wird in der Agarose-Einlass eingeführt. (B) dieses Panel zeigt ein Microgel Re Kapselung Gerät (25 µm Funktion Höhe). Die mikrogele fließen in einen trichterförmigen Einlass zu erhalten, ihre dicht an dicht bestellen und erhalten ein Volumen von Tagmentation Mischung vor die erneute Einkapselung an einer 25 µm X 30-µm-Kreuzung. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig4.jpg"> Abbildung 4 : Mikrographen Tröpfchen und mikrogele. (A) dieses Panel zeigt 25 µm mikrogele vor enzymatische Lyse gewaschen. Die Bakterien sind für die Quantifizierung der Kapselung Rate fluoreszent gefärbt. Poisson laden Statistiken zu diktieren, dass die Zellen gekapselte mit einer Rate von 1 in 10 Tropfen oder weniger um die Häufigkeit der Multiple-Kapselung Ereignisse zu minimieren. (B) zeigt dieses Panel eine Fluoreszenz Mikroskopie 25 µm digitalen Barcode Tröpfchen mit einer Nukleinsäure-beize behandelt. Die Tröpfchen mit verstärkten Barcode Fragmente erzeugen eine starke Fluoreszenz-Signal. (C) zeigt dieses Panel mikrogele wieder in 50 µm Tropfen gekapselt. Die schließen-Verpackung von der mikrogele ermöglicht eine Kapselung Preise nähert sich 1 Gel pro Tropfen mit einigen Dubletten. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig5.jpg"> Abbildung 5 : Mikrofluidischen double Fusion Gerät für einzellige Genom Barcoding. Eine zweistufige Fusion Operation Paare Barcode Tröpfchen mit Tagmented Genome bei hohem Durchsatz. Ein Tropfen des PCR-Mixes zuerst erzeugt und mit einem Barcode-Tröpfchen in der Region erscheinen in gelb mit Salzwasser Elektroden zusammengeführt. Als nächstes ist ein Tröpfchen mit einem Microgel eingeführt und ein zweites Mal in der Region erscheinen in rot zusammengeführt. Öleinführungen ermöglichen präzise Kontrolle über den Abstand zwischen den reinjected Tröpfchen. Der Barcode Reinjektion Kammer und seine Abstandhalter Öl befinden sich auf der kürzeren 25 µm Schicht blau schattiert. Alle anderen Gerätefunktionen gehören zu den dickeren Schicht mit 45 µm Gesamthöhe. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig6.jpg"> Abbildung 6 : Barcode Gruppe Metriken für ein 10-Zelle synthetische mikrobiellen Gemeinschaft. (A) dieses Panel zeigt die Verteilung des Barcodes Gruppengrößen. Die Anzahl der Gruppen einer bestimmten Größe sinkt exponentiell steigender Größe Gruppe. Eine Mindestgrenze von 7,5 kbit/s pro Gruppe begrenzt die Analyse zu Gruppen mit einer ausreichenden Menge an Informationen und entfernt die PCR mutiert Sequenz "Waisen." (B) dieses Panel zeigt die Verteilung der Barcode Gruppe Reinheiten. Die überwiegende Mehrheit (&gt; 90 %) der Gruppen sind von sehr hoher Reinheit (&gt; 95 %). (C) dieser Bereich zeigt die relative Häufigkeit von 10 Arten berechnet auf Konzernebene Lese- und Barcode. Die 2 zählen Methoden produzieren ähnliche Ergebnisse, darauf hinweist, dass der Barcode Gruppengrößen über Artgrenzen konsistent sind. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig7.jpg"> Abbildung 7 : Aggregieren genomischen Abdeckung der Bacillus subtilis Barcode Gruppen. Das liest der Barcode Gruppen zuordnen, das Bakterium B. Subtilis (N = 9.398) gebündelt werden und in ihrer Gesamtheit analysiert. Eine kreisförmige Versorgungskarte zeigt die Abdeckung Einheitlichkeit des SiC-Seq lautet, mit keine beobachtbaren Dropout-Regionen. Eine gestrichelte Linie um den Umfang zeigt die durchschnittliche Reichweite (5.55 X). Der Einschub-Histogramm der relative Abdeckung Frequenzen zeigt, dass ein Großteil der Basen fallen in eine Tiefe in der Nähe der Genom-weiten Durchschnitt durch die gestrichelte Linie dargestellt. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Gerät</td>
			<td>1. Layerhöhe (µm)</td>
			<td>1. Schicht Spin Drehzahl (u/min)</td>
			<td>2. Layerhöhe (µm)</td>
			<td>2. Schicht Spin Drehzahl (u/min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Co-Flow dropmaker</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Re Gel encapsulator</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Doppelte Fusion</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>20</td>
			<td>5000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Herstellung Geräteparameter mikrofluidischen. Diese Tabelle zeigt eine Auflistung der mikrofluidischen Geräte in der SiC-Seq-Workflow mit ihren erforderlichen Geschwindigkeiten für Fotolack Spin coating (basierend auf den Angaben des Herstellers für SU-8 3025) verwendet.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Label</td>
			<td colspan="5">Sequenz (5' &gt; 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>BAR</td>
			<td colspan="5">GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA_BAR</td>
			<td colspan="5">CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>P7_BAR</td>
			<td colspan="5">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>P5_DNA</td>
			<td colspan="5">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>I7_READ</td>
			<td colspan="5">GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Primer Sequenzen.
Ergänzende Datei 1: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_1-SiC-seq_device_masks.dwg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Datei 2: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_2-centrifuge_syringe_holder_1mL.dwg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

Einzellige Sequenzierung zeigt genotypischen Heterogenität in biologischen Systemen, aber aktuelle Technologien fehlen des Durchsatzes für die Tiefe Profilierung der Zusammensetzung und Funktion notwendig. Hier beschreiben wir einen mikrofluidischen Workflow für die Sequenzierung > 50.000 einzellige Genome aus verschiedenen Zell-Populationen.

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, mit Hilfe einer Reihe von mikrofluidischen Geräten barcodierte genomische Sequenzierungsdaten von Zehntausenden von Einzelzellen zu generieren. Mit dieser Methode wird ein beispielloser Einzelzell-Sequenzierungsdurchsatz erzielt. Wir verwenden Mikrofluidik, um Zellen einzeln zu verkapseln, zu lysieren und mit einem Barcode zu versehen, wobei die zugrunde liegende genomische Heterogenität erhalten bleibt, die bei herkömmlichen Schockstudien in Sequenzierungsstudien verloren geht.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einen hohen Durchsatz aufweist und in der Lage ist, Einzelzelldaten von Zehntausenden von Zellen zu erzeugen. Obwohl wir in dieser Demonstration mit Mikroben arbeiten, kann der Arbeitsablauf durch geringfügige Modifikationen an den Abmessungen des mikrofluidischen Geräts für die Verwendung mit verschiedenen Zelltypen angepasst werden. Bereiten Sie zu Beginn des Protokolls einen Milliliter Agarose mit 3 % Gewicht pro Volumen bei niedriger Schmelztemperatur in 1x Tris-EDTA oder TE-Puffer vor.Bewahren Sie die Agaroselösung bis zum Laden der Spritze auf einem 90 Grad Celsius heißen Wärmeblock auf. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und drehen Sie die Zellen. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter mit einem Volumen-zu-Volumen-Dichtegradienten-Medium in PBS und halten Sie die Zellen bis zum Laden der Spritze auf Eis.Laden Sie anschließend eine Drei-Milliliter-Spritze mit fluoriertem Öl (HFE), das ein PFPE-PEG-Tensid mit 2 Gewichtsprozent enthält. Setzen Sie es mit einer 27-Gauge-Nadel ein und stecken Sie es in eine Spritzenpumpe. Laden Sie die Zellsuspension und die geschmolzene Agarose in Ein-Milliliter-Spritzen, die beide mit 27-Gauge-Nadeln versehen sind, und geben Sie sie in Spritzenpumpen.Stellen Sie dann eine Raumheizung auf hoch und positionieren Sie die Heizfläche 10 Zentimeter von der Spritze entfernt. Stellen Sie sicher, dass die an der Spritze gemessene Temperatur ca. 80 Grad Celsius beträgt. Bevor Sie die Schläuche in das Gerät einführen, grundieren Sie die Pumpen, um die Luft aus der Leitung zu entfernen.Verbinden Sie die Spritzennadeln mit Schläuchen aus Polyethylen oder PE mit den Einlässen des mikrofluidischen Geräts. Schließen Sie ein Stück Schlauch an den Auslass an und legen Sie das freie Ende in ein 15-Milliliter-Auffangröhrchen. Nach der Tropfenherstellung stellen Sie das Entnahmeröhrchen 30 Minuten lang auf vier Grad Celsius, um die vollständige Gelierung der Agarose zu gewährleisten.Entfernen Sie die untere Ölschicht mit einer Drei-Milliliter-Spritze aus dem Sammelröhrchen, die mit einer 20-Gauge-Nadel versehen ist, und achten Sie darauf, dass die oberste Schicht der Agarose-Tröpfchen nicht beschädigt wird. Fügen Sie einen Milliliter 10 Vol.-% PFO in HFE hinzu, um die Agarosetropfen aus ihrer Tensidschicht zu lösen. Pipettieren Sie die Lösung eine Minute lang auf und ab, um die Emulsionen, die homogen und klumpenfrei sein sollten, gründlich zu beschichten.Drehen Sie das konische Röhrchen eine Minute lang bei 2.000 g Röhrchen, um die Agarose-Mikrogele zu sammeln. Aspirieren Sie den PFO/HFE-Überstand und stellen Sie sicher, dass die Mikrogele nun frei von ihrer Tensidschicht und klar sind. Überprüfen Sie nach dem Waschen der Mikrogele die Zellverkapselung in den Mikrogelen unter einem Mikroskop bei einer 400-fachen Vergrößerung, indem Sie ein 10-Mikroliter-Aliquot von Gelen mit einer 1-fachen Nukleinsäurefärbung färben.Verstopfen Sie den Zelleneinlass eines Co-Flow-Dropmaker-Geräts mit einem kleinen Stück Bleilot. Bevor Sie die Schläuche in das Gerät einführen, grundieren Sie die Pumpen, um die Luft aus der Leitung zu entfernen. Schließen Sie ein Stück Schlauch an den Auslass an und legen Sie das freie Ende in ein 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen.Nutzen Sie die Durchflussmengen auf dem Sieb für die Tropfenherstellung. Sammeln Sie die Tropfen in den PCR-Röhrchen mit ca. 50 Mikrolitern Tropfen in jedem Röhrchen. Entfernen Sie nach der Tropfenherstellung vorsichtig die untere Schicht des HFE-Öls von den Emulsionen mit Hilfe von Pipettenspitzen, die mit dem Gel geladen werden, und ersetzen Sie sie durch FC-40 fluoriertes Öl mit einem PFPE-PEG-Tensid von 5 Gewichtsprozent.Programmieren Sie dann den thermischen Zyklus. Bevor Sie die Schläuche in das Gerät einführen, grundieren Sie die Pumpen, um die Luft aus der Leitung zu entfernen. Verbinden Sie die Spritzen mit HFE, Tagmentationsmischung und Mikrogelen mit PE-Schläuchen mit den Einlässen des mikrofluidischen Geräts.Schließen Sie ein Stück Schlauch an den Auslass an und legen Sie das freie Ende in eine leere Ein-Milliliter-Spritze, wobei der Kolben auf die Ein-Milliliter-Linie gezogen wird. Überprüfen Sie als Nächstes die Verkapselungsrate des Mikrogels unter einem Lichtmikroskop bei 400-facher Vergrößerung. Setzen Sie die Spritze mit den Tagmentationsemulsionen mit einer Nadel ein und inkubieren Sie sie aufrecht in einem Heizblock oder Ofen für eine Stunde bei 55 Grad Celsius, um die genomische DNA zu fragmentieren.Bereiten Sie die Barcode-Tröpfchen für die Fusion vor, indem Sie die FC-40-Ölfraktion durch HFE 2 % Gewicht pro Gewicht PFPE-PEG ersetzen. Füllen Sie die Tropfen vorsichtig in eine Ein-Milliliter-Spritze um, setzen Sie sie mit einer Nadel ein und geben Sie sie in eine Spritzenpumpe. Laden Sie die inkubierte und markierte Mikrogel-Tröpfchenspritze in eine Spritzenpumpe.Verbinden Sie als Nächstes die drei Natriumchlorid-Spritzen mit PE-Schläuchen mit den beiden Elektrodeneinlässen und dem Einzelgrabeneinlass. Bevor Sie die Schläuche in das Gerät einführen, grundieren Sie die Pumpen, um die Luft aus der Leitung zu entfernen. Verbinden Sie die drei HFE-Spritzen, die an den Pumpen montiert sind, mit PE-Schlauchstücken mit den beiden Abstands-Öleinlässen und dem Tropfenherstellungsöleinlass.Schießen Sie dann alle Tröpfchen-Reinjektionsschläuche mit einer antistatischen Pistole ab, bevor Sie die Schläuche mit den Spritzennadeln verbinden. Verbinden Sie die PCR-Mix-Spritze, die Mikrogel-Tropfspritze und die Barcode-Tropfspritze mit den jeweiligen Einlässen mit PE-Schläuchen. Verbinden Sie die Nadel der Elektrodenspritze mit einer Krokodilklemme mit einem Kaltkathoden-Fluoreszenzinverter.Stellen Sie die Gleichstromversorgung des Wechselrichters auf zwei Volt ein. Lassen Sie das Doppelfusionsgerät mit den empfohlenen Durchflussraten laufen. Sammeln Sie die Tropfen in PCR-Röhrchen mit ca. 50 Mikrolitern Emulsion in jedem Röhrchen.Entfernen Sie vor dem thermischen Wechsel vorsichtig die untere Schicht des HFE-Öls von den Emulsionen mit Hilfe von Pipettenspitzen, die mit dem Gel geladen werden, und ersetzen Sie sie durch FC-40 fluoriertes Öl mit einem PFPE-PEG-Tensid von 5 Gew.-%. Programmieren Sie dann den Zyklus. Um die DNA aus den Tröpfchen des thermischen Zyklus zurückzugewinnen, werden die Tröpfchen in ein Mikrozentrifugenröhrchen gepoolt und die Emulsionen mit 20 Mikrolitern PFO aufgebrochen.Wirbeln Sie sie 10 Sekunden lang zum Mischen. Drehe das Rohr. Entfernen Sie vorsichtig mit einer Pipette die obere wässrige Schicht aus dem Röhrchen und geben Sie sie in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.Entsorgen Sie die Ölphase. Fahren Sie dann schließlich mit den Schritten zur Vorbereitung, Sequenzierung und Analyse der Bibliothek fort. Ein Histogramm der Barcode-Anzahl im Vergleich zur Gruppengröße zeigt, dass ein signifikanter Teil der gültigen Barcode-Gruppen knapp über dem Schwellenwert von 7,5 Kilobasenpaaren pro Gruppe liegt, der die PCR-mutierten Waisen ausschließt.Die relative Häufigkeit der Zelltypen aus einer synthetischen 10-Zell-Gemeinschaft von drei gramnegativen Bakterien, fünf grampositiven Bakterien und zwei Hefen wurde durch Zählung der Rohlesevorgänge und der Barcode-Gruppen berechnet. Eine zirkuläre Abdeckungskarte von B.subtilis-Lesevorgängen aus allen Barcode-Gruppen veranschaulicht die Einheitlichkeit der SiC-seq-Lesevorgänge ohne beobachtbare Dropout-Regionen, bei denen die durchschnittliche Abdeckung das 5,55-fache betrug. Die Gleichmäßigkeit der Abdeckung wurde mit einer Häufigkeitsverteilung von normierten Abdeckungswerten verifiziert.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, eine Verkapselungsrate von etwa einem Barcode oder einer Zelle pro 10 Tröpfchen aufrechtzuerhalten. Dies begrenzt die Wahrscheinlichkeit eines doppelten Verkapselungsereignisses, das die Einzelzelldaten verdrehen kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die mikrofluidischen Geräte einrichten und bedienen, die zur Generierung von Einzelzellsequenzierungsdaten verwendet werden.Einmal gemeistert, kann diese Technik in acht Stunden oder zwei Vier-Stunden-Tagen ausgeführt werden.

an-ultrahigh-throughput-microfluidic-platform-for-single-cell-genome

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Hier beschreiben wir eine optimierte Multiplex-Reverse-Transkriptase-quantitative PCR (qRT-PCR)-Protokoll in Kombination mit einer mikrofluidischen Plattform als zeit-und kosteneffektiver High-Throughput-Screening-Tool für microRNA (miRNA) Expression, besonders beim Arbeiten mit geringen Mengen der Probe.

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

Wir stellen eine mikrofluidische Ansatz für die Expression von Protein-Arrays. Die Vorrichtung besteht aus Tausenden von Reaktionskammern durch mikromechanische Ventile gesteuert. Mikrofluidische Vorrichtung mit einer Mikroarray-bedruckte Genbibliothek gepaart. Diese Gene werden dann transkribiert und translatiert auf dem Chip, was zu einem Protein-Array bereit zu Versuchszwecken verwendet.

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

Wir haben eine automatisierte Zellkultur und Verhör Plattform für Mikro-Skala-Zell-Stimulation Experimente entwickelt. Die Plattform bietet eine einfache, vielseitige und präzise Kontrolle in den Anbau und die Förderung kleiner Populationen von Zellen und Gewinnen Lysate für molekulare Analysen. Die Plattform wird auch auf Studien, die kostbaren Zellen und / oder Reagenzien geeignet.

Eine vielseitige automatisierte Plattform für Mikro-Skala Handy Stimulation Experimente

In diesem Artikel präsentieren wir ein Mikrofluidik-Chip für Einzelzellanalyse. Es ermöglicht die Quantifizierung der intrazellulären Proteine, Enzyme, Cofaktoren und zweiten Boten mittels Fluoreszenzassays oder Immunoassays.

Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine Systemarchitektur für die Durchführung automatisierter Partikeltrennungen mit kleinen Volumina (0,15–1,5 ml) unter Verwendung eines mikrofluidischen Geräts und diskutiert Methoden zur Optimierung der Leistung und des Betriebs von akustofluidischen Geräten.

Einem mikrofluidischen Plattform für Präzisions-Kleinvolumen Probenbearbeitung und seine Verwendung zur Größe Separate biologische Partikel mit einem Acoustic Microdevice

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung einzelner Zellen mit einer mikrofluidischen Plattform, die ein neues Mikrotiter-Designkonzept verwendet, um eine hocheffiziente Einzelzellisolierung und eine langfristige klonale Kultur zu ermöglichen.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Die Nanopore-Sequenzierung ist eine neuartige Technologie, die eine kostengünstige Sequenzierung an entfernten Orten und ressourcenarmen Umgebungen ermöglicht. Hier stellen wir ein Protokoll zur Sequenzierung von mRNAs aus Vollblut vor, das mit solchen Bedingungen kompatibel ist.

Sequenzierung von mRNA aus Vollblut mit Nanopore-Sequenzierung

Der Herstellungsprozess eines PDMS-basierten, mehrschichtigen, mikrofluidischen Geräts, das in vitro Transkription und Translation (IVTT) Reaktionen über längere Zeiträume durchführen kann, wird beschrieben. Darüber hinaus erhalten Sie einen umfassenden Überblick über die Hard- und Software, die zur Automatisierung und Aufrechterhaltung dieser Reaktionen über einen längeren Zeitraum erforderlich ist.

Eine multilayer mikrofluidische Plattform für die Leitung einer längeren zellfreien Genexpression

Wir bieten ein Protokoll zur Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen sezierten Regionen einer erwachsenen Maushirnhälfte, gefolgt von halbautomatischer Bibliotheksvorbereitung für die tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung von Transkriptomen in voller Länge. Diese Methode wird dazu beitragen, die funktionelle Heterogenität von Mikroglia bei Gesundheit und Krankheit aufzuklären.

Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung

Wir präsentieren ein mikrofluidisches System für Hochdurchsatzstudien an komplexen Lebensmaschinen, das aus 1500 Kultureinheiten, einer Reihe verbesserter Peristaltikpumpen und einem Mischmodul vor Ort besteht. Der mikrofluidische Chip ermöglicht die Analyse der hochkomplexen und dynamischen Mikro-Umgebungsbedingungen in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind entscheidend für die Untersuchung des Fortschreitens und der Metastasierung von Krebs. In diesem Artikel wird ein integriertes Protokoll mit hohem Durchsatz für die CTC-Anreicherung und die Einzel-CTC-Sequenzierung vorgestellt, das die Abscheidungseffizienz und CTC-Reinheit verbessert und gleichzeitig die Kontaminations- und Sequenzierungskosten senkt und so die Präzisionsonkologieforschung und klinische Anwendungen voranbringt.

Mikrofluidik-basierte Hochdurchsatz-Sortierung von zirkulierenden Tumorzellen und Einzelzellsequenzierungstechnologie

Erfahren Sie eine hochdurchsatz-mikrofluidische Plattform für Einzelzell-Genomsequenzierung. Diese Methode kapselt und barcodiert Zellen einzeln, um genomische Heterogenität zu erhalten.

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Weitere Videos entdecken