Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, mit Hilfe einer Reihe von mikrofluidischen Geräten barcodierte genomische Sequenzierungsdaten von Zehntausenden von Einzelzellen zu generieren. Mit dieser Methode wird ein beispielloser Einzelzell-Sequenzierungsdurchsatz erzielt. Wir verwenden Mikrofluidik, um Zellen einzeln zu verkapseln, zu lysieren und mit einem Barcode zu versehen, wobei die zugrunde liegende genomische Heterogenität erhalten bleibt, die bei herkömmlichen Schockstudien in Sequenzierungsstudien verloren geht.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einen hohen Durchsatz aufweist und in der Lage ist, Einzelzelldaten von Zehntausenden von Zellen zu erzeugen. Obwohl wir in dieser Demonstration mit Mikroben arbeiten, kann der Arbeitsablauf durch geringfügige Modifikationen an den Abmessungen des mikrofluidischen Geräts für die Verwendung mit verschiedenen Zelltypen angepasst werden. Bereiten Sie zu Beginn des Protokolls einen Milliliter Agarose mit 3 % Gewicht pro Volumen bei niedriger Schmelztemperatur in 1x Tris-EDTA oder TE-Puffer vor.

Bewahren Sie die Agaroselösung bis zum Laden der Spritze auf einem 90 Grad Celsius heißen Wärmeblock auf. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und drehen Sie die Zellen. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter mit einem Volumen-zu-Volumen-Dichtegradienten-Medium in PBS und halten Sie die Zellen bis zum Laden der Spritze auf Eis.

Laden Sie anschließend eine Drei-Milliliter-Spritze mit fluoriertem Öl (HFE), das ein PFPE-PEG-Tensid mit 2 Gewichtsprozent enthält. Setzen Sie es mit einer 27-Gauge-Nadel ein und stecken Sie es in eine Spritzenpumpe. Laden Sie die Zellsuspension und die geschmolzene Agarose in Ein-Milliliter-Spritzen, die beide mit 27-Gauge-Nadeln versehen sind, und geben Sie sie in Spritzenpumpen.

Stellen Sie dann eine Raumheizung auf hoch und positionieren Sie die Heizfläche 10 Zentimeter von der Spritze entfernt. Stellen Sie sicher, dass die an der Spritze gemessene Temperatur ca. 80 Grad Celsius beträgt. Bevor Sie die Schläuche in das Gerät einführen, grundieren Sie die Pumpen, um die Luft aus der Leitung zu entfernen.

Verbinden Sie die Spritzennadeln mit Schläuchen aus Polyethylen oder PE mit den Einlässen des mikrofluidischen Geräts. Schließen Sie ein Stück Schlauch an den Auslass an und legen Sie das freie Ende in ein 15-Milliliter-Auffangröhrchen. Nach der Tropfenherstellung stellen Sie das Entnahmeröhrchen 30 Minuten lang auf vier Grad Celsius, um die vollständige Gelierung der Agarose zu gewährleisten.

Entfernen Sie die untere Ölschicht mit einer Drei-Milliliter-Spritze aus dem Sammelröhrchen, die mit einer 20-Gauge-Nadel versehen ist, und achten Sie darauf, dass die oberste Schicht der Agarose-Tröpfchen nicht beschädigt wird. Fügen Sie einen Milliliter 10 Vol.-% PFO in HFE hinzu, um die Agarosetropfen aus ihrer Tensidschicht zu lösen. Pipettieren Sie die Lösung eine Minute lang auf und ab, um die Emulsionen, die homogen und klumpenfrei sein sollten, gründlich zu beschichten.

Drehen Sie das konische Röhrchen eine Minute lang bei 2.000 g Röhrchen, um die Agarose-Mikrogele zu sammeln. Aspirieren Sie den PFO/HFE-Überstand und stellen Sie sicher, dass die Mikrogele nun frei von ihrer Tensidschicht und klar sind. Überprüfen Sie nach dem Waschen der Mikrogele die Zellverkapselung in den Mikrogelen unter einem Mikroskop bei einer 400-fachen Vergrößerung, indem Sie ein 10-Mikroliter-Aliquot von Gelen mit einer 1-fachen Nukleinsäurefärbung färben.

Verstopfen Sie den Zelleneinlass eines Co-Flow-Dropmaker-Geräts mit einem kleinen Stück Bleilot. Bevor Sie die Schläuche in das Gerät einführen, grundieren Sie die Pumpen, um die Luft aus der Leitung zu entfernen. Schließen Sie ein Stück Schlauch an den Auslass an und legen Sie das freie Ende in ein 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen.

Nutzen Sie die Durchflussmengen auf dem Sieb für die Tropfenherstellung. Sammeln Sie die Tropfen in den PCR-Röhrchen mit ca. 50 Mikrolitern Tropfen in jedem Röhrchen. Entfernen Sie nach der Tropfenherstellung vorsichtig die untere Schicht des HFE-Öls von den Emulsionen mit Hilfe von Pipettenspitzen, die mit dem Gel geladen werden, und ersetzen Sie sie durch FC-40 fluoriertes Öl mit einem PFPE-PEG-Tensid von 5 Gewichtsprozent.

Programmieren Sie dann den thermischen Zyklus. Bevor Sie die Schläuche in das Gerät einführen, grundieren Sie die Pumpen, um die Luft aus der Leitung zu entfernen. Verbinden Sie die Spritzen mit HFE, Tagmentationsmischung und Mikrogelen mit PE-Schläuchen mit den Einlässen des mikrofluidischen Geräts.

Schließen Sie ein Stück Schlauch an den Auslass an und legen Sie das freie Ende in eine leere Ein-Milliliter-Spritze, wobei der Kolben auf die Ein-Milliliter-Linie gezogen wird. Überprüfen Sie als Nächstes die Verkapselungsrate des Mikrogels unter einem Lichtmikroskop bei 400-facher Vergrößerung. Setzen Sie die Spritze mit den Tagmentationsemulsionen mit einer Nadel ein und inkubieren Sie sie aufrecht in einem Heizblock oder Ofen für eine Stunde bei 55 Grad Celsius, um die genomische DNA zu fragmentieren.

Bereiten Sie die Barcode-Tröpfchen für die Fusion vor, indem Sie die FC-40-Ölfraktion durch HFE 2 % Gewicht pro Gewicht PFPE-PEG ersetzen. Füllen Sie die Tropfen vorsichtig in eine Ein-Milliliter-Spritze um, setzen Sie sie mit einer Nadel ein und geben Sie sie in eine Spritzenpumpe. Laden Sie die inkubierte und markierte Mikrogel-Tröpfchenspritze in eine Spritzenpumpe.

Verbinden Sie als Nächstes die drei Natriumchlorid-Spritzen mit PE-Schläuchen mit den beiden Elektrodeneinlässen und dem Einzelgrabeneinlass. Bevor Sie die Schläuche in das Gerät einführen, grundieren Sie die Pumpen, um die Luft aus der Leitung zu entfernen. Verbinden Sie die drei HFE-Spritzen, die an den Pumpen montiert sind, mit PE-Schlauchstücken mit den beiden Abstands-Öleinlässen und dem Tropfenherstellungsöleinlass.

Schießen Sie dann alle Tröpfchen-Reinjektionsschläuche mit einer antistatischen Pistole ab, bevor Sie die Schläuche mit den Spritzennadeln verbinden. Verbinden Sie die PCR-Mix-Spritze, die Mikrogel-Tropfspritze und die Barcode-Tropfspritze mit den jeweiligen Einlässen mit PE-Schläuchen. Verbinden Sie die Nadel der Elektrodenspritze mit einer Krokodilklemme mit einem Kaltkathoden-Fluoreszenzinverter.

Stellen Sie die Gleichstromversorgung des Wechselrichters auf zwei Volt ein. Lassen Sie das Doppelfusionsgerät mit den empfohlenen Durchflussraten laufen. Sammeln Sie die Tropfen in PCR-Röhrchen mit ca. 50 Mikrolitern Emulsion in jedem Röhrchen.

Entfernen Sie vor dem thermischen Wechsel vorsichtig die untere Schicht des HFE-Öls von den Emulsionen mit Hilfe von Pipettenspitzen, die mit dem Gel geladen werden, und ersetzen Sie sie durch FC-40 fluoriertes Öl mit einem PFPE-PEG-Tensid von 5 Gew.-%. Programmieren Sie dann den Zyklus. Um die DNA aus den Tröpfchen des thermischen Zyklus zurückzugewinnen, werden die Tröpfchen in ein Mikrozentrifugenröhrchen gepoolt und die Emulsionen mit 20 Mikrolitern PFO aufgebrochen.

Wirbeln Sie sie 10 Sekunden lang zum Mischen. Drehe das Rohr. Entfernen Sie vorsichtig mit einer Pipette die obere wässrige Schicht aus dem Röhrchen und geben Sie sie in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.

Entsorgen Sie die Ölphase. Fahren Sie dann schließlich mit den Schritten zur Vorbereitung, Sequenzierung und Analyse der Bibliothek fort. Ein Histogramm der Barcode-Anzahl im Vergleich zur Gruppengröße zeigt, dass ein signifikanter Teil der gültigen Barcode-Gruppen knapp über dem Schwellenwert von 7,5 Kilobasenpaaren pro Gruppe liegt, der die PCR-mutierten Waisen ausschließt.

Die relative Häufigkeit der Zelltypen aus einer synthetischen 10-Zell-Gemeinschaft von drei gramnegativen Bakterien, fünf grampositiven Bakterien und zwei Hefen wurde durch Zählung der Rohlesevorgänge und der Barcode-Gruppen berechnet. Eine zirkuläre Abdeckungskarte von B.subtilis-Lesevorgängen aus allen Barcode-Gruppen veranschaulicht die Einheitlichkeit der SiC-seq-Lesevorgänge ohne beobachtbare Dropout-Regionen, bei denen die durchschnittliche Abdeckung das 5,55-fache betrug. Die Gleichmäßigkeit der Abdeckung wurde mit einer Häufigkeitsverteilung von normierten Abdeckungswerten verifiziert.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, eine Verkapselungsrate von etwa einem Barcode oder einer Zelle pro 10 Tröpfchen aufrechtzuerhalten. Dies begrenzt die Wahrscheinlichkeit eines doppelten Verkapselungsereignisses, das die Einzelzelldaten verdrehen kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die mikrofluidischen Geräte einrichten und bedienen, die zur Generierung von Einzelzellsequenzierungsdaten verwendet werden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in acht Stunden oder zwei Vier-Stunden-Tagen ausgeführt werden.