Name: Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von Caenorhabditis elegans Locomotion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Erfahren Sie die mikrofluidische Elektrotaxis zur quantitativen Analyse der Lokomotion von Caenorhabditis elegans. Diese Methode ermöglicht die schnelle Untersuchung neuronaler und neuromuskulärer Veränderungen.

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Die Autoren bedanken sich bei den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Canada Research Chairs Programm, Canadian Institutes of Health Research und Ontario Ministerium für Forschung und Innovation durch ihre frühe Forscher Award Programm für die finanzielle Unterstützung bedanken.

1. Photolithographie für Master Mold Fabrication <ol><li> Bathe eine 3 Zoll Siliziumwafer in Aceton 30 sec und dann mit Methanol für 30 sek. Spülen Sie mit dH 2 0 Wasser für 5 min. </li><li> Trocknen Sie die Oberfläche des Wafers mit einem N2 Blaspistole. Erhitzen des Wafers auf einer heißen Platte bei 140 ° C für 2 min. </li><li> Plasma die Oxidation der Oberfläche des Silizium-Wafers (1 min, 50 W). </li><li> Spin-Mantel der Oberfläche des Wafers mit 3 ml SU-8 Fotolack 100 (40 sec; 1.750 rpm). </li><li> Pre-Bake der beschichtete Wafer auf einer Heizplatte bei 65 ° C für 10 min, dann die Rampe die Temperatur bis zu 95 ° C über 2 min. Halten Sie diese Einstellung für eine zusätzliche 1 Stunde. </li><li> Richten Sie ein Photomaske mit dem gewünschten Kanal Design. Freilegen zu 550-600 mJ / cm 2 UV-Licht (350-400 nm) zu widerstehen. Photomasks können in AutoCAD entworfen und gedruckt auf einer Transparenz mit hoher Druckauflösung. </li><li> Nachhärten des Wafers auf einer heißen Platte bei 65 ° C für 1 min und 95 ° C für 10 min, Rampen ter Temperatur wie zuvor. </li><li> Tauchen Sie den Wafer in SU-8-Entwickler-Lösung für 10-15 min. Überprüfen Sie für die Fertigstellung der Entwicklung durch Spülen mit Isopropanol. Wenn ein weißer Niederschlag erscheint, weiter zu entwickeln. Die Master-Form ist in 2A gezeigt. </li></ol> 2. Soft-Lithographie für Microchannel Fabrication <ol><li> Mischen 35 ml Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomerbasis mit 3,5 ml PDMS Härtungsmittel. </li><li> Setzen Sie den Master hergestellt Form (Muster nach oben) und eine leere Siliziumwafer in Petrischalen mit Alufolie ausgekleidet. </li><li> Gießen Sie 20 ml PDMS Prepolymer in die Urform Schale und 15 ml in das zweite Gericht. Beseitigen Sie Lufteinschlüsse unter den Wafern durch leichten Druck auf sie mit einem Einweg-Holz-Applikator. </li><li> Titelbild beide Gerichte und beiseite für einen Tag, um zu heilen. Alternativ zur schnelleren Aushärtung entfernen Luftblasen aus dem PDMS mit einem Vakuumentgaseranlage und verlassen dann die Gerichte auf einer Heizplatte bei 80 ° C für 2hr. </li><li> Entfernen Sie die Folie und schälen die PDMS von den Wafern. </li><li> Verwenden Sie die Harris Uni-Core (2,5 mm), um Flüssigkeit Access Ports an beiden Enden des Kanals zu stanzen. Schneiden Sie den Kanal und leere PDMS in ähnlich große Streifen schneiden. </li><li> Legen Sie den Kanal, den Rohling PDMS-Streifen und einen Glasträger (75 × 25 mm 2) in ein Plasma Oxidationsmittel, wahrscheinlich in einem Reinraum befindet. Expose zum Sauerstoff-Plasma für 40 sec bei 40 W Leistung. </li><li> Haften die Kanalstück und Objektträger auf gegenüberliegenden Seiten des Rohlings Streifen. Beiseite für 2 Stunden, um die Bindung zu vervollständigen. </li><li> Legen Sie die Baugruppe auf einer Heizplatte bei 120 ° C. Befestigen Kunststoffschlauch (Innendurchmesser 1/32 &quot;, Außendurchmesser 3/32&quot;), die jeweils mindestens 6 mm lang, um die ausgestanzten Behältern mit PDMS Prepolymer. Bringen Sie eine fluidische Kunststoff-Stecker auf eine oder beide Röhren Spritze Befestigung ermöglichen, oder verwenden Sie handelsübliche Armaturen. </li><li> Lassen Sie das PDMS Sicherung der Schlauch zu heilen. Legen Sie 3 &quot;Längen von 22-Gauge-isoliertem Kupferdraht in each Reservoir, zwischen dem Eingang und dem Rohr-Kanal und sicher mit PDMS Prepolymer. Das fertige Produkt wird in 2B gezeigt. </li></ol> 3. Electrotaxis Experiment <ol><li> Legen Sie die Mikrokanalstruktur auf der Bühne (vorzugsweise XY-bewegliche) eines Mikroskops mit einer fest montierten Kamera mit einem Monitor verbunden (Abbildung 1). </li><li> Schließen Sie das Netzteil oder Ausgang des Verstärkers Drähte an der Mikrokanalstruktur der Elektroden. Eine einfache Gleichstromversorgung nicht ausreichend, wenn nur ein DC-Signal gewünscht wird, sondern ein Verstärker, der mit einem Funktionsgenerator ermöglicht Einsatz von gepulsten DC-und AC-Signale als auch. </li><li> Bringen Sie die Mikrokanalstruktur den Ausgang Rohr zu einer Einwegspritze. Tauchen der Mund des Einlaßrohres in M9 physiologischen Puffer und sanft streben Flüssigkeit in dem Kanal durch Anlegen eines Unterdrucks im Inneren der Spritze (entweder manuell oder unter Verwendung einer Spritzenpumpe). Wenn die Ein-und Auslass Rohre sowohl mit M9 gefüllt, ziehen Sie die Spritze from die Röhre. Wert, den beide Rohre auf die gleiche Höhe hydrostatisch angetriebene Strömung zu verhindern. </li><li> Anwenden einer Gleichspannung an den Kanal und zu gewährleisten, dass der Widerstand (R = V / I) beträgt etwa 0,6 MOhm (für eine 50 mm lang, 0,3 mm breit und 0,1 mm tief ~ Mikrokanal). </li><li> Wenn mit dem Kanal die Integrität erfüllt, befolgen Sie die obigen Schritte, um Würmer aus einer verdünnten Suspension laden in den Kanal. </li><li> Trennen Sie die Spritze und hydrostatisch manipulieren die durch Einstellen der Röhrchen relative Höhe. Verwenden Sie diese Methode, um einen Wurm in der Mitte des Kanals zu platzieren und dann legen die beiden Rohre flach auf der gleichen Höhe. </li><li> Stellen Sie die Stromversorgung auf die entsprechende Spannung: 4-12 V / cm für L3 Stadium Tiere, 4-10 V / cm für L4s und 2-4 V / cm für junge Erwachsene. Aktivieren Sie das elektrische Signal und damit 1 min von Vorbelichtung für die Schnecke auf dem Gebiet akklimatisieren. Der Wurm sollte beginnen, sich in Richtung der Kathode. Wenn die Minute vergangen ist, verwenden Sie die Kamera, um die Aufnahme zu starten. </li><li> Für AC-und Impuls-d DC Experimente, die maximale Reaktion elektrische Feld kann von oben und von Frequenz und Tastverhältnis des Signals angenommen werden kann wie gewünscht moduliert 7, 8. </li><li> Als Experiment beendet ist, entfernen Sie alle Flüssigkeit (und Würmer) aus dem Kanal, spülen Sie es mit dH 2 0, und lassen Sie das Gerät auf einer Heizplatte bei 125 ° C zu trocknen. </li><li> Auszug Bewegungsapparates Daten von aufgenommenen Videos manuell mit NIH ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) oder benutzerdefinierte MATLAB-basierten Wurm-Tracking-Software. </li></ol>

<ol><li>Kuwahara, T., Koyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial+Parkinson+mutant+%CE%B1-synuclein+causes+dopamine+neuron+dysfunction+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).</li>
<li>Kuwahara, T., Koyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+reveals+involvement+of+endocytic+pathway+in+neuronal+dysfunction+in+a-synuclein+transgenic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic.</a> 17 (19), 2997-3009 (2008).</li>
<li>Su, L. J., Auluck, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li>
<li>Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment.</a> Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).</li>
<li>Salam, S., Ansari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics+set+up+to+study+neuronal+degeneration+and+identification+of+neuroprotective+compounds+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans.</a> , Submitted (2013).</li>
<li>Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+sorting+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Electrical sorting of Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).</li>
<li>Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pulse+direct+current+signals+on+electrotactic+movement+of+nematodes+Caenorhabditis+elegans+and+Caenorhabditis+briggsae%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae.</a> Biomicrofluidics. 5 (4), 044116(2011).</li>
<li>Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+Caenorhabditis+elegans+in+alternating+electric+field+and+its+application+to+their+localization+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control.</a> Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702(2010).</li>
<li>van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+model+identifies+genetic+modifiers+of+alpha-synuclein+inclusion+formation+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging.</a> PLoS Genet. 4, e1000027(2008).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+mediate+electrosensory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).</li>
<li>Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoresis+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).</li>
<li>Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+system+for+measuring+parameters+of+nematode+sinusoidal+movement%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genet%22%5BJournal%5D)">An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement.</a> BMC Genet. 6, 5(2005).</li>
<li>Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -M. D. i, Hersen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Running+worms%3A+C.+elegans+self-sorting+by+electrotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis.</a> PLoS One. 6 (2), e16637(2011).</li>
</ol>

Die mikrofluidischen electrotaxis Assay-Technologie ist zum Patent wurde in den Vereinigten Staaten von Amerika und Kanada eingereicht.

Unter Ausnutzung der Verhaltens-Phänomen erstmals von Gabel und Kollegen und Gebäude auf dem dielektrophoretischen Manipulation Arbeit von Chuang und Kollegen 11,12 beschrieben, stellt unsere Mikrofluidik-basierten electrotaxis Assay eine einfache, robuste und sensitive Methode, um neuronale Aktivität in Worms mit Bewegung als Sonde einen Ausgang. Die Analyse der Parameter der Bewegung ermöglicht quantitative Vergleich zwischen verschiedenen Genotypen. Die Präzision der Fertigung und Mikrokanalstruktur elektr...

<table><tbody><tr><td>Aceton</td><td>CALEDON Labs</td><td>1200-1-30</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>CALEDON Labs</td><td>6700-1-30</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>CALEDON Labs</td><td>8600-1-40</td><td></td></tr><tr><td>SU-8</td><td>Microchem Corp.</td><td>Y131273</td><td>SU-8 100</td></tr><tr><td>SU-8 Entwickler</td><td>Microchem Corp.</td><td></td><td></td>Y020100</tr><tr><td>92x16mm Petrischale</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Enthält Elastomerbasis und Härter</td></tr><tr><td>Funktionsgenerator</td><td>Tektronix Inc.</td><td></td><td>Modell AFG3022B</td></tr><tr><td>Verstärker</td><td>Trek Inc.</td><td></td><td>Modell 2210-CE</td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Harvard Apparatur</td><td>70-4506</td><td>Modell 11 ELITE</td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>11675916Q</td><td>Modell HP131725Q</td></tr></tbody></table>

mikrofluidik-basierten electrotaxis für on-demand-quantitative analyse von<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;locomotion

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ein vielseitiges Modell für biomedizinische Forschung wegen seiner Erhaltung der krankheitsbedingten Gene und Signalwege sowie seiner einfachen Anbau. Mehrere C. elegans Erkrankungsmodellen berichtet worden, wie neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson-Krankheit (PD), welche die Degeneration dopaminerger (DA) Neuronen 1 umfasst. Beide Transgene und neurotoxische Chemikalien verwendet worden, um DA Neurodegeneration und damit verbundene Bewegung Defekte in Würmern zu induzieren, so dass für Untersuchungen der Grundlage der Neurodegeneration und Bildschirme für neuroprotektive Gene und Verbindungen 2,3. Screens in niederen Eukaryoten wie C. elegans stellen ein effizientes und wirtschaftliches Mittel, um Verbindungen und Gene, die neuronale Signalübertragung identifizieren. Herkömmliche Bildschirme sind in der Regel manuell durchgeführt und erzielte durch visuelle Inspektion, folglich sind sie Zeit-consuming und anfällig für menschliche Fehler. Zusätzlich sind die meisten konzentrieren sich auf zellulärer Ebene Analyse unter Ignorierung Fortbewegung, ist das ein besonders wichtiger Parameter für Bewegungsstörungen. Wir haben einen neuen mikrofluidischen Screening-System (Abbildung 1), die quantifiziert und steuert C entwickelt elegans &#39;Fortbewegung mit elektrischen Feldes innerhalb Mikrokanäle Reize. Wir haben gezeigt, dass ein Gleichstrom (DC)-Feld kann robust on-demand Fortbewegung in Richtung der Kathode (&quot;electrotaxis&quot;) 4 induzieren. Umkehrung des Feldes Polarität der Wurm schnell seine Richtung umzukehren als gut. Wir haben auch gezeigt, dass Defekte in dopaminergen und anderen sensorischen Neuronen den Swimming Antwort 5 ändern. Daher kann Anomalien in neuronalen Signalübertragung ermittelt Fortbewegung als read-out werden. Die Bewegung Antwort kann genau quantifiziert werden mit einer Reihe von Parametern wie Geschwindigkeit Schwimmen, Körper Biegeeigenfrequenz und Wendezeit. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Unsere Arbeit hat gezeigt, dass die Reaktion mit electrotactic Alter variiert. Insbesondere junge Erwachsene zu einem niedrigeren Bereich von elektrischen Feldern zu reagieren und bewegen sich schneller im Vergleich zu 4 Larven. Diese Erkenntnisse führten wir eine neue Mikrofluidikvorrichtung passiv sortieren Würmer nach Alter und Phänotyp 6 entwerfen. Wir haben auch die Reaktion der Würmer gepulsten DC getestet und Wechselstrom (AC) elektrische Felder. Pulsed DC Felder der verschiedenen Arbeitszyklen effektiv erzeugt electrotaxis sowohl in C. elegans und seinen Cousin C. briggsae 7. In einem anderen Experiment immobilisiert symmetrisch Wechselfelder mit einer Frequenz von 1 Hz bis 3 KHz Würmer in den Kanal 8. Umsetzung des elektrischen Feldes in einem mikrofluidischen Umgebung ermöglicht eine schnelle und automatisierte Ausführung des electrotaxis Assay. Dieser Ansatz verspricht hohen Durchsatz genetischen und chemischen Faktoren für Bildschirme erleichternbeeinflussen neuronale Funktion und Lebensfähigkeit.

Eine repräsentative Video von einem Wildtyp-young adult Nematoden electrotaxis und ihre Position und Geschwindigkeit Ausgänge von der Schnecke Tracking-Software sind in Ergänzende Video 1 und Abbildung 3 dargestellt. Die Bewegungsanalyse-Software selbst nicht erkennt die Richtung des Feldes Polarität und die Zeit der Umpolung, sondern müssen diese Informationen von der Quelle Video erhalten werden. Dies könnte mit Hilfe eines Audio-oder visuellen Hinweis in der Video-oder aufzuschreiben...

Eine halbautomatische mikroelektromechanischen fluidischen Verfahren zur On-Demand-Fortbewegung in induzieren<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Beschrieben. Diese Methode basiert auf dem Phänomen der neurophysiologischen Reaktion auf Würmer milden elektrischen Feldern (&quot;electrotaxis&quot;) in mikrofluidischen Kanälen basiert. Microfluidic electrotaxis dient als schnelle, empfindliche, kostengünstige und skalierbare Technik zum Screening auf Faktoren, die neuronalen Gesundheit.

Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Abnormalitäten in der neuronalen und neuromuskulären Signalübertragung im Modellorganismus C Allergan nach chemischer Exposition oder genetischer Manipulation zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Mikrokanal-Muster in eine Siliziumscheibe entworfen und geätzt wird. Im zweiten Schritt wird die Siliziumform verwendet, um einen oder mehrere Mikrokanäle aus PDMS abzugießen.Dann werden zusätzliche Komponenten an die PDMS-Form angebracht. Anschließend wird das Verhalten der Würmer aufgezeichnet, während sie mittels einer am Mikroskop befestigten Kamera angeregt werden, durch den Mikrokanal zu schwimmen. Letztendlich kommt die elektro-mikrofluidische Technik zum Einsatz, um die Veränderungen in den neuronalen und muskulären Systemen der Nematoden infolge chemischer oder genetischer Manipulationen mit der Fortbewegung als Messgröße zu bestimmen.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden, insbesondere plattenbasierten Verhaltensassays, liegt daher darin, dass mit ihr die Fortbewegungsrichtung des Wurms präzise gesteuert werden kann, was eine exakte Quantifizierung von Bewegungsverhalten wie der Frequenz der Körperbiegungen, der Rotationszeit und der Schwimmgeschwindigkeit ermöglicht. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Therapie neurodegenerativer Erkrankungen wie Parkinson und Alzheimer, da sie zur Identifizierung chemischer und genetischer Faktoren mit neuroprotektiven Eigenschaften eingesetzt werden kann. Die Idee zu dieser Technik entstand, als uns bewusst wurde, dass eine Methode zur quantitativen Analyse des Bewegungsverhaltens von Würmern fehlte.Die Bewegung ist willkürlich und zufällig, weshalb sie schwer zu charakterisieren ist. Daher wollten wir eine einfache Methode etablieren, die jeder erlernen kann. Um die Urform herzustellen, tauchen Sie eine drei Zoll große Siliziumscheibe zunächst 30 Sekunden lang in Aceton und anschließend 30 Sekunden lang in Methanol ein. Spülen Sie die Scheibe danach fünf Minuten lang mit entionisiertem Wasser ab.Als Nächstes verwenden Sie eine Stickstoff-Blasdüse, um die Oberfläche der Wafer zu trocknen, und erhitzen anschließend den Wafer zwei Minuten lang auf einer Heizplatte auf 120 Grad Celsius. Oxidieren Sie danach die Oberfläche des Siliziumwafers mittels Plasma bei 50 Watt für eine Minute. Tragen Sie nun mithilfe von drei Milliliter SU-8 100 Photoresist den Wafer mittels Spin-Coating bei 1.750 U/min für 40 Sekunden auf und führen Sie danach eine Vorvernetzung des beschichteten Wafers auf einer Heizplatte bei 65 Grad Celsius durch. Erhöhen Sie nach 10 Minuten die Temperatur innerhalb von zwei Minuten auf 95 Grad Celsius und backen Sie den Wafer für eine zusätzliche Stunde. Nachdem Sie den Wafer von der Heizplatte genommen haben, legen Sie eine Fotomaske mit dem gewünschten Design auf den Wafer. Belichten Sie den Fotolack 95 Sekunden lang mit UV-Licht. Anschließend führen Sie eine Nachbegasung des Wafers auf einer Heizplatte durch, wobei denselben Temperaturgradienten verwenden, der auch für die Vorvergütung nach der Nachbegasung verwendet wurde.Tauchen Sie das Wafer in SU acht ein. Entwickeln Sie eine Lösung für 10 bis 15 Minuten. Spülen Sie das Wafer mit Isopropanol, um den Abschluss der Designentwicklung zu bestätigen.Anschließend 30 Sekunden lang mit entionisiertem Wasser spülen. Zum Schluss das Wafer mit einer Stickstoffpistole trocknen und kurz bei 120 Grad Celsius backen. Nun die hergestellte Urform sowie ein unstrukturiertes Silikonwafer in zwei separate mit Aluminiumfolie ausgelegte Petrischalen geben.Geben Sie 20 Milliliter PDMS-Präpolymer in die Masterform und die Schale sowie 15 Milliliter in die leere Wafer-Schale. Drücken Sie anschließend vorsichtig mit einem Einweg-Holzspatel auf die Wafer, um eventuelle Luftblasen unterhalb der Wafer zu entfernen, decken Sie beide Schalen ab und stellen Sie sie einen Tag lang zum Aushärten beiseite. Nachdem die Wafer ausgehärtet sind, entfernen Sie die Folie und lösen Sie das PDMS ab.Verwenden Sie anschließend einen 2,5 mm Harris-Unicorn, um an beiden Enden des Kanals in dem PDMS aus der Negativform Flüssigkeitszufuhröffnungen auszustanzen. Schneiden Sie beide PDMS-Scheiben in ähnlich große Streifen. Laden Sie dann im Reinraum den Kanal, den unbedruckten PDMS-Streifen und einen Objektträger in einen Plasmaoxidator.Den Sauerstoffplasma-Behandlung bei 40 Watt Leistung für 40 Sekunden aussetzen. Anschließend das Kanalstück und den Glasobjektträger auf gegenüberliegende Seiten des leeren Streifens kleben und die Materialien zur Vervollständigung der Bindung beiseitelegen. Nach zwei Stunden PDMS-Präpolymer verwenden, um zwei mindestens sechs Zoll lange Kunststoffschläuche an den gestanzten Reservoiren auf einer Heizplatte bei 120 Grad Celsius zu befestigen.Lassen Sie das PDMS aushärten, bevor Sie fortfahren. Befestigen Sie dann einen fluidischen Kunststoffverbinder an einem der Schläuche, um Spritzen anschließen zu können. Führen Sie nun drei Zoll lange Stücke aus isoliertem Kupferdraht mit 22 Gauge in jedes Reservoir zwischen dem Zulaufschlauch und dem Kanal ein, und sichern Sie die Drähte mit zusätzlichem PDMS-Präpolymer. Beginnen Sie diesen Schritt, indem Sie den gerade zusammengebauten Mikrokanal auf einen in X- und Y-Richtung beweglichen Mikroskoptisch mit einer montierten Kamera, die mit einem Monitor verbunden ist, stellen und die Stromversorgung mit den Elektroden des Mikrokanals verbinden. Nachdem bestätigt wurde, dass der Widerstand des Mikrokanals etwa 0,6 Megaohm beträgt, verbinden Sie das Auslassrohr des Mikrokanals mit einer Einwegspritze. Tauchen Sie dann die Mündung des Zulaufrohrs in eine Lösung von in M-9-physiologischem Puffer suspendierten Nematoden ein.Üben Sie Unterdruck in der Spritze aus, um Flüssigkeit in den Kanal zu aspirieren. Wenn sowohl der Einlass- als auch der Auslasstubus gefüllt sind, trennen Sie die Spritze und stellen hydrostatisches Gleichgewicht her. Steuern Sie den Fluss, indem Sie die relative Höhe der Tuben anpassen, um einen Wurm in die Mitte des Kanals zu bringen.Legen Sie dann beide Schläuche flach auf gleicher Höhe ab, um einen Nullfluss innerhalb des Mikrokanals aufrechtzuerhalten. Beim Wechseln der Wurmproben während eines Elektrotaxis-Experiments, nachdem beide Zulaufschläuche auf gleiche Höhe ausgerichtet wurden, führen Sie kleine Höhenanpassungen der Schläuche zueinander durch, falls weiterhin ein Fluss besteht. Falls jemals unklar ist, ob der Fluss tatsächlich null ist, kann man eine Umkehr der Wurmbewegung induzieren, indem man die Polarität des elektrischen Feldes wechselt, und anschließend die lineare Geschwindigkeit des Wurms bewertet, während er sich umdreht.Stellen Sie nun das Netzteil auf die geeignete Spannung ein. Aktivieren Sie das elektrische Signal und lassen Sie eine Minute Vorbelichtung verstreichen, damit sich der Wurm an das Feld gewöhnen kann; nach Ablauf dieser Minute sollte der Wurm beginnen, sich zur Kathode hin zu bewegen. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung.Wenn das Experiment beendet ist, entfernen Sie alle Flüssigkeit und Würmer aus dem Kanal. Spülen Sie die Kammer mit entionisiertem Wasser aus und lassen Sie das Gerät auf einer Heizplatte bei 125 Grad Celsius trocknen. In diesem repräsentativen Video werden ein wildtypischer junger adulter Nematode, seine elektrische Achse sowie die Position- und Geschwindigkeitsausgaben der Wurmerfassungssoftware gezeigt.Das Video beginnt mit der Kathode rechts. Das Erscheinungsbild der Glaspipette deutet die bevorstehende Umkehrung an, die anschließende Entfernung der Pipettensignale. In dem Moment der Umkehrung werden hier die Daten für Position über der Zeit und die momentane Geschwindigkeit über der Zeit aus dem benutzerdefinierten Würmer-Tracking-Programm für den Wurm im Video gezeigt. Das Programm berechnete die Geschwindigkeitskurve aus der Positions-Zeit-Kurve.Dieses Boxplot-Diagramm zeigt Elektroschwindel-Daten von einer Gruppe von Wildtyp- und transgenen Tieren. Die transgenen T-Tiere exprimieren das humane Alpha-Synuclein-Gen in den Körperwandmuskeln unter Kontrolle des Promotors des UNC-54-Myosin-Schwerketten-Gens, was zu Proteinaggregation führt und sich als verlangsamte Elektrotaxis-Reaktion im Vergleich zu Wildtyp-Tieren manifestiert. Wenn die Methode einmal beherrscht ist, können über 20 Würmer pro Stunde untersucht werden, sofern das Elektrotaxis-Experiment ordnungsgemäß durchgeführt wird.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass nur Mutationen und Chemikalien, die die Fortbewegung oder die Elektrosensation beeinflussen, Phänotypen hervorrufen, die mittels des Elektrotaxis-Assays detektiert werden können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie gut verstehen, wie man ein Silikon strukturiert, einen mikrofluidischen Kanal zusammenbaut und die Fortbewegung von N. methodisch unter Verwendung eines Axxis-Assays analysiert.

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Elektrotaxis-Assay: Eine Methode zur Beobachtung der Fortbewegung bei C. elegans

Dieses Video beschreibt die Verwendung von Video- und Tracking-Software zur Aufzeichnung von Wurmbewegungen in einer Arena. Das Beispielprotokoll misst die Wirkung der Ethanolexposition auf die Fortbewegung von Würmern.

C. elegans Bewegungsverfolgung: Eine Methode zur Beurteilung der Fortbewegung bei Würmern

Die hier vorgestellte Technik misst den Weg frei schwimmen mikroskopischen Spezies unter Verwendung einer einzigen Wellenlänge Exposition. C elegans verwendet werden, um Schattenabbildungs ​​als kostengünstige Alternative zu kostspieligen Mikroskope demonstrieren. Diese Technik lässt sich an verschiedenen Orientierungen, Umgebungen und Arten aufzunehmen, um die Richtung, Geschwindigkeit, Beschleunigung und Kräfte zu messen.

Einzel-Wellenlänge Schatten von Imaging<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Locomotion einschließlich Kraft-Schätzungen

Die Verwendung eines angepassten "olfaktorischen Chips" für die effiziente Kalzium Imaging von C. Elegans Männchen ist hier beschrieben. Studien über männliche Einwirkung von Glycerin und ein Pheromon werden ebenfalls angezeigt.

Verwenden einen angepasste mikrofluidischen olfaktorische Chip für die Bildgebung neuronaler Aktivität als Reaktion auf Pheromone in männlichen C. Elegans Kopf Neuronen

Neue Werkzeuge für die Mechanobiology Forschung sind erforderlich, um verstehen, wie mechanischen Beanspruchung biochemische Stoffwechselwege aktiviert und biologische Reaktionen hervorruft. Hier präsentieren wir eine neue Methode zur selektiven mechanischen Stimulation der immobilisierten Tiere mit einem mikrofluidischen Trap ermöglicht hochauflösende Bildgebung der zellulären Antworten.

Verwendung von einem Mikrofluidik-Gerät für mechanische Stimulation und High Resolution Imaging von C. elegans

In diesem Artikel zeigen wir live Darstellung der einzelnen Würmer mit einem benutzerdefinierten mikrofluidischen Gerät. In das Gerät beschränken sich mehrere Würmer individuell separate Kammern, Multiplex längs Überwachung der verschiedenen biologischen Prozesse ermöglicht.

Mikrofluidische Plattform für längs-Imaging in Caenorhabditis elegans

Eine Reihe von Immobilisierung Methoden wurde gegründet, um die gezielte Bestrahlung von live Caenorhabditis Elegans ermöglichen Einzelpersonen mit einer neu entwickelten ultra-dünnen Polydimethylsiloxan mikrofluidischen chip mit Wassereinlagerungen. Dieser Roman auf dem Chip Immobilisierung ist auch ausreichend für imaging-Beobachtungen. Die ausführliche Behandlung und Anwendungsbeispiele des Chips werden erläutert.

Immobilisierung von Live Caenorhabditis Elegans Einzelpersonen, die eine ultraflache Polydimethylsiloxan Mikrofluidik-Chip mit Wassereinlagerungen

Diese Studie präsentiert Protokolle für zwei halbautomatische Ansätze zur Analyse der Bewegungsaktivität in C. elegans Komplex I Krankheit Gas-1(fc21) Würmer, nämlich ZebraLab (ein Mitteldurchsatz-Assay) und WormScan (ein Hochdurchsatz-Assay) und bieten vergleichende Analysen unter einer Vielzahl von Forschungsmethoden zur Quantifizierung des Nematodenverhaltens und der integrierten neuromuskulären Funktion.

Vergleichende Analyse experimenteller Methoden zur Quantifizierung der Tieraktivität bei Caenorhabditis elegans Modellen der mitochondrialen Erkrankung

Diese Studie untersucht den Einfluss des Alters auf die Fortbewegung bei C. elegans durch Messung des größten Lyapunov-Exponenten (LLE). Mit zunehmendem Alter zeigen C. elegans eine Zunahme und anschließende Abnahme der motorischen Kontrolle. Die Ergebnisse zeigen einen Höhepunkt der LLE nach fünf Tagen, gefolgt von einem Rückgang mit zunehmendem Alter der Würmer.

Altersabhängige Dynamik der Fortbewegung bei Caenorhabditis elegans: Eine Lyapunov-Exponentenanalyse

Erfahren Sie die mikrofluidische Elektrotaxis zur quantitativen Analyse der Lokomotion von Caenorhabditis elegans. Diese Methode ermöglicht die schnelle Untersuchung neuronaler und neuromuskulärer Veränderungen.

Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von

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