Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von Caenorhabditis elegans 'Locomotion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Anomalien in der neuronalen und neuromuskulären Signalübertragung im Modellorganismus von C Allergan nach chemischer Exposition oder genetischer Manipulation zu identifizieren. Dazu wird zunächst ein Mikrokanalmuster entworfen und in einen Siliziumwafer geätzt. Im zweiten Schritt wird die Silikonform verwendet, um einen oder mehrere Mikrokanäle aus PDMS zu gießen.

Dann werden Zubehörteile an die PDMS-Form angehängt. Als nächstes wird das Verhalten der Würmer, wenn sie zum Schwimmen durch den Mikrokanal angeregt werden, mit einer am Mikroskop befestigten Kamera aufgezeichnet. Letztendlich wird die Elektromikrofluidik verwendet, um die Veränderungen der Nematoden, des neuronalen und muskulären Systems aufgrund chemischer oder genetischer Manipulation zu bestimmen, wobei die Fortbewegung als Auslesung dient.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber den bestehenden Techniken, insbesondere den plattenbasierten Verhaltensassays, besteht darin, dass mit dieser Technik die Bewegungsrichtung des Wurms genau kontrolliert werden kann, was eine präzise Quantifizierung des Bewegungsverhaltens wie Körperbiegungsfrequenz, Rotationszeit und Schwimmgeschwindigkeit ermöglicht. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson und Alzheimer, da sie zum Screening auf chemische und genetische Faktoren mit neuroprotektiven Eigenschaften verwendet werden kann. Die Idee zu dieser Technik hatten wir erst, als wir feststellten, dass es an einer Methode mangelt, um das Bewegungsverhalten der Methode quantitativ zu analysieren.

Bewegung ist freiwillig und zufällig, und sie ist schwer zu charakterisieren. Deshalb wollten wir eine einfache Methode etablieren, die jeder lernen kann: Um die Urform herzustellen, baden Sie zunächst einen drei Zoll großen Siliziumwafer in Aceton und dann jeweils 30 Sekunden lang mit Methanol. Spülen Sie den Wafer dann fünf Minuten lang mit entionisiertem Wasser ab.

Als nächstes trocknen Sie die Oberfläche des Wafers mit einer Stickstoff-Blaspistole und erhitzen den Wafer dann nach zwei Minuten auf einer Heizplatte auf 120 Grad Celsius, plasma oxidieren Sie die Oberfläche des Siliziumwafers bei 50 Watt für eine Minute. Nun wird die Waferoberfläche mit drei Millilitern SU eight 100 Photo Resist 40 Sekunden lang bei 1.750 U/min gedreht und dann der beschichtete Wafer auf einer heißen Platte bei 65 Grad Celsius vorgebacken. Nach 10 Minuten die Temperatur über zwei Minuten auf 95 Grad Celsius erhöhen und die Waffel eine weitere Stunde backen.

Nachdem Sie den Wafer von der Heizplatte genommen haben, ordnen Sie eine Fotomaske im gewünschten Design über dem Wafer an. Setzen Sie den Fotolack 95 Sekunden lang UV-Licht aus. Anschließend die Waffel auf einer heißen Platte mit dem gleichen Temperaturgradienten wie bei den vorgebackenen nach dem Nachbacken nachbacken.

Tauchen Sie den Wafer in SU acht. Entwickeln Sie eine Lösung für 10 bis 15 Minuten. Spülen Sie den Wafer mit Isopropanol, um den Abschluss der Designentwicklung zu bestätigen.

Anschließend 30 Sekunden lang mit entionisiertem Wasser spülen. Zum Schluss trocknest du den Wafer mit einer Stickstoffpistole und backst ihn kurz bei 120 Grad Celsius. Legen Sie nun die fertige Urform sowie einen blanken Silikonwafer in zwei separate Petrischale, die mit Aluminiumfolie ausgelegt sind.

Gießen Sie 20 Milliliter PDMS-Prepolymer in die Urform und die Schale und 15 Milliliter in die leere Waffelschale. Drücken Sie dann vorsichtig mit einem Einweg-Applikator aus Holz auf die Waffeln, um Lufteinschlüsse unter den Waffeln zu entfernen, und decken Sie dann beide Schalen ab und stellen Sie sie einen Tag lang zum Aushärten beiseite. Nachdem die Wafer ausgehärtet sind, entfernen Sie die Folie und ziehen Sie das PDMS ab.

Verwenden Sie dann ein 2,5 Millimeter Harris Einhorn, um Flüssigkeitszugangsöffnungen an beiden Enden des Kanals im PDMS aus der Urform zu stanzen. Schneiden Sie beide PDMS-Scheiben in gleich große Streifen. Laden Sie dann in einem Reinraum den Kanal, den blanken PDMS-Streifen und einen Glasobjektträger in ein Plasmaoxidationsmittel.

Setzen Sie die Materialien 40 Sekunden lang Sauerstoffplasma mit einer Leistung von 40 Watt aus. Kleben Sie dann das Kanalstück und den Glasschieber auf gegenüberliegende Seiten des Rohstreifens und legen Sie die Materialien beiseite, um die Verklebung abzuschließen. Verwenden Sie nach zwei Stunden PDMS-Prepolymer, um zwei mindestens sechs Zoll lange Kunststoffschläuche an den gestanzten Behältern auf einer Heizplatte bei 120 Grad Celsius zu befestigen.

Lassen Sie das PDMS aushärten, bevor Sie fortfahren. Befestigen Sie dann einen fluidischen Kunststoffverbinder an einem der Schläuche, um das Aufstecken von Spritzen zu ermöglichen. Führen Sie nun drei Zoll Längen 22 Gauge isolierten Kupferdraht in jedes Reservoir zwischen dem Einlassrohr und dem Kanal ein, um die Drähte mit mehr PDMS-Prepolymer zu sichern.

Beginnen Sie diesen Schritt, indem Sie den gerade zusammengebauten Mikrokanal auf einen beweglichen XY-Tisch eines Mikroskops mit einer montierten Kamera stellen, die an einen Monitor angeschlossen ist, und schließen Sie die Stromversorgung an die Mikrokanalelektroden an. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass der Widerstand des Mikrokanals etwa 0,6 Megaohm beträgt, befestigen Sie das Ausgangsrohr des Mikrokanals an einer Einwegspritze. Tauchen Sie dann die Mündung des Einlassrohrs in eine Lösung von Nematoden, die in M neun physiologischem Puffer suspendiert sind.

Üben Sie Unterdruck in der Spritze aus, um Flüssigkeit in den Kanal zu saugen. Wenn sowohl die Einlass- als auch die Auslassschläuche gefüllt sind, trennen Sie die Spritze und den hydrostatischen Saft. Manipulieren Sie den Durchfluss, indem Sie die relative Höhe der Rohre so einstellen, dass eine Schnecke in der Mitte des Kanals platziert wird.

Legen Sie dann beide Röhren flach auf der gleichen Höhe, um einen Nullfluss im Mikrokanal zu gewährleisten. Wenn Sie während eines Elektrotaxis-Experiments Wurmproben austauschen, nachdem Sie beide Einlassrohre auf die gleiche Höhe nivelliert haben, wenn noch Strömung vorhanden ist, nehmen Sie kleine Anpassungen an der Höhe des Rohrs relativ zueinander vor. Wenn wir uns jemals nicht sicher sind, ob die Strömung wirklich Null ist, können wir eine Umkehrung der Bewegung des Wurms herbeiführen, indem wir die Polarität des elektrischen Feldes ändern und dann die lineare Geschwindigkeit des Wurms auswerten, während er sich dreht.

Stellen Sie nun das Netzteil auf die entsprechende Spannung ein. Aktivieren Sie das elektrische Signal und warten Sie eine Minute Vorbelichtung, damit sich der Wurm an das Feld gewöhnt hat, während dieser Zeit sollte sich der Wurm nach Ablauf der Minute in Richtung Kathode bewegen. Starten Sie die Aufnahme.

Wenn das Experiment beendet ist, entfernen Sie alle Flüssigkeiten und Würmer aus dem Kanal. Spülen Sie die Kammer mit entionisiertem Wasser aus und lassen Sie das Gerät auf einer heißen Platte bei 125 Grad Celsius trocknen. In diesem repräsentativen Video wird die Elektroachse eines Wildtyp-Nematoden mit jungen Erwachsenen und deren Position und Geschwindigkeit von der Wurmverfolgungssoftware gezeigt.

Das Video beginnt mit der Kathode auf der rechten Seite. Das Aussehen der Glaspipette deutet auf die bevorstehende Umkehrung, die anschließende Entfernung der Pipettensignale, hin. Im Moment der Umkehrung werden hier die Daten für Position über Zeit und Momentangeschwindigkeit über Zeit ausgegeben des benutzerdefinierten Wurmverfolgungsprogramms für die Wurm Im Video wird gezeigt, wie das Programm die Geschwindigkeitskurve aus der Positionszeitkurve berechnet.

Dieser Boxplot zeigt die Elektrogeschwindigkeitsdaten einer Reihe von Wildtyp- und Trenchgentieren. Die T-transgenen Tiere exprimieren das humane Alpha-Synuclein-Gen in der Körperwandmuskulatur unter der Kontrolle des UNC 54-Myosin-Schwerketten-Genpromotors, das eine Proteinaggregation bewirkt und sich in einer langsameren elektrotaktischen Reaktion manifestiert als bei Wildtyp-Tieren. Sobald sie gemeistert sind, können stündlich mehr als 20 Würmer untersucht werden, wenn das Elektrotaxi-Experiment ordnungsgemäß durchgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass nur Mutationen und Chemikalien, die die Fortbewegung oder das Elektroempfinden beeinflussen, Phänotypen erzeugen, die mit dem Elektrosteuer-Assay nachweisbar sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Silikon mustert. Wir haben einen mikrofluidischen Kanal zusammengestellt und erfahren, wie man die Fortbewegung der N-Methode mit einem Axxis-Assay analysiert.