Name: Rekonstitution von Grund Mitosespindeln in Sphärische Emulsionströpfchen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Erfahren Sie die Rekonstitution von Mitosespindeln in sphärischen Emulsionströpfchen für Zellbiologie. Diese Bottom-up-Methode ermöglicht die Untersuchung von Spindelpositionierung und -dynamik in geometrischer Einschränkung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir möchten uns bei den Mitgliedern des Dogtero-Labors für die wertvollen Diskussionen bedanken. Wir danken Stefan Diez und Marcel Janson für die Reagenzien und Samara Reck-Peterson für ihre Hilfe bei der Reinigung von Dynein. Diese Arbeit wurde durch eine Förderung des Europäischen Forschungsrats (ERC Synergy Grant: MODEL-CELL) unterstützt.

<ol><li>Kotak, S., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+spindle+positioning%3A+cortical+force+generators+in+the+limelight%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).</li>
<li>Williams, S. E., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+divisions%2C+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oriented divisions, fate decisions.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 749-758 (2013).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+centrosome+separation+and+bipolar+spindle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly.</a> Dev Cell. 19, 797-806 (2010).</li>
<li>Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+force+generators+and+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitotic force generators and chromosome segregation.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).</li>
<li>Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+microtubule+asters+in+microfabricated+chambers%3A+the+role+of+catastrophes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).</li>
<li>Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubules+is+regulated+by+force%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubules is regulated by force.</a> J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).</li>
<li>Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-generation+and+dynamic+instability+of+microtubule+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).</li>
<li>Laan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+dynein+controls+microtubule+dynamics+to+generate+pulling+forces+that+position+microtubule+asters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters.</a> Cell. 148 (3), 502-514 (2012).</li>
<li>Dogterom, M., Yurke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+force-velocity+relation+for+growing+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules.</a> Science. 278 (5339), 856-860 (1997).</li>
<li>Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+force+balance+model+of+early+spindle+pole+separation+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos.</a> Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).</li>
<li>Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+microtubule+contacts+position+the+spindle+in+C.+elegans+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos.</a> Cell. 129 (3), 499-510 (2007).</li>
<li>Carminati, J. L., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+orient+the+mitotic+spindle+in+yeast+through+dynein-dependent+interactions+with+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex.</a> J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cortical+dynein+and+G+alpha+proteins+mediates+spindle+positioning+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).</li>
<li>Moore, J. K., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+mitosis+with+cell+polarity%3A+Molecular+motors+at+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).</li>
<li>Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+production+by+disassembling+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Force production by disassembling microtubules.</a> Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).</li>
<li>Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+hand-over-hand+mechanism+of+single+molecular+motility+of+cytoplasmic+dynein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).</li>
<li>Ten Hoopen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+astral+microtubule+capture+by+cortical+Bud6p+priming+spindle+polarity+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae.</a> Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).</li>
<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bipolar+mitotic+kinesin+Eg5+moves+on+both+microtubules+that+it+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks.</a> Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).</li>
<li>van den Wildenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homotetrameric+kinesin-5+KLP61F+preferentially+crosslinks+microtubules+into+antiparallel+orientations%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations.</a> Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).</li>
<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).</li>
<li>Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+functions+of+kinesin-5%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitotic functions of kinesin-5.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 255-259 (2010).</li>
<li>Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+function+of+Ase1p%3A+evidence+for+a+MAP-dependent+midzone-specific+spindle+matrix.+Microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins.</a> J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).</li>
<li>Loiodice, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ase1p+organizes+antiparallel+microtubule+arrays+during+interphase+and+mitosis+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast.</a> Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).</li>
<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-driven+multimerization+recruits+ase1p+onto+overlapping+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules.</a> Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).</li>
<li>Janson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinkers+and+motors+organize+dynamic+microtubules+to+form+stable+bipolar+arrays+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast.</a> Cell. 128 (2), 357-368 (2007).</li>
<li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li>
<li>Mollinari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC1+is+a+microtubule+binding+and+bundling+protein+essential+to+maintain+the+mitotic+spindle+midzone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone.</a> J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).</li>
<li>Braun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+braking+by+Ase1+prevents+overlapping+microtubules+from+sliding+completely+apart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart.</a> Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).</li>
<li>Lansky, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusible+crosslinkers+generate+directed+forces+in+microtubule+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks.</a> Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).</li>
<li>Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+fission+yeast+ase1+in+mitotic+cell+division%2C+meiotic+nuclear+oscillation%2C+and+cytokinesis+checkpoint+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling.</a> Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).</li>
<li>Roth, S., Laan, L., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cortical+Dynein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cortical Dynein function.</a> Methods Enzymol. 540, 205-230 (2014).</li>
<li>Moudjou, M., Bornens, M. Method of centrosome isolation from cultured animal cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoudjou%2C+M+%22Cell+Biology%3A+A+laboratory+handbook%22">Cell Biology: A laboratory handbook</a>. Celis, J. E. 2, 111-119 (1998).</li>
<li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Lancaster, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+rounding+alters+cell+geometry+to+ensure+efficient+bipolar+spindle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation.</a> Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).</li>
<li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+volume+modulates+spindle+size+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis.</a> Science. 342 (6160), 856-860 (2013).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin+and+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li>
<li>Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+RCC1+to+chromosomes+is+required+for+proper+mitotic+spindle+assembly+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells.</a> Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).</li>
<li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+directly+stabilizes+reconstituted+kinetochore-microtubule+attachments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments.</a> Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).</li>
<li>Lawrimore, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+loops+generate+intracentromere+tension+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA loops generate intracentromere tension in mitosis.</a> J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).</li>
<li>Minc, N., Burgess, D., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cell+geometry+on+division-plane+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Influence of cell geometry on division-plane positioning.</a> Cell. 144 (3), 414-426 (2011).</li>
<li>Taberner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+systems+for+the+study+of+microtubule-based+cell+polarity+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast.</a> Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).</li>
<li>Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+robust+storage+of+drops+and+fluids+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die Methoden, die hier vorliegenden jüngsten Bemühungen beschriebenen Grund Mitosespindeln in Wasser-in-Öl-Emulsionströpfchen zu rekonstituieren. Studieren Spindelanordnung innerhalb geometrischen Grenzen bietet zahlreiche Vorteile. Wichtige Feedback-Mechanismen existieren zwischen Mikrotubuli der mitotischen Spindel und die geometrischen Zwänge, in denen sie zusammengesetzt sind. Mikrotubuli erzeugen können Kräfte drängen, wenn sie in geometrische Grenzen wachsen, die in mitotischen Spindel Verschiebung zur Folge haben kann. Darüber hinaus kann in eine physikalische Barriere wachsenden Mikrotubuli Katastrophen induzieren. Auch Spindelanordnung innerhalb eines begrenzten Geometrie kann zu einer allmählichen Erschöpfung der einzelnen Komponenten führen, wie Tubulin, die wiederum direkt die Rate Mikrotubuli Wachstum beeinflußt 36. Dies sind alles wesentliche Determinanten der Spindelanordnung, die untersucht werden können unter Verwendung der Assays hier beschrieben. Die beschriebenen Assays sind sehr empfindlich gegenüber kleinen Konzentration differences der Tröpfchen Komponenten. Dies ist der Fall für Tubulin, wo kleinere Konzentrationsunterschiede in entweder zu langsam oder zu schnelle Mikrotubuli Wachstum führen kann. In diesem Fall kann die Mikrotubuli Wachstumsraten oft noch durch Einstellen der Temperatur während der ~ 30 min des Versuchs zuerst korrigiert werden. Mitotischen Spindelanordnung und Positionierung ist auch sehr empfindlich gegenüber Variationen in der Konzentration von (cortical) Kraftgeneratoren. Dies ist wahrscheinlich auf die Konzentration, Reinheit und Aktivität der gereinigten Komponenten abhängt und für jede neu gereinigte Protein sorgfältig titriert werden muss. Darüber hinaus haben bestimmte Kompromisse in Abbildungseinstellungen vorgenommen werden, abhängig von der Natur des Assays. Zu Beginn ein hohes Maß an löslichen fluoreszierenden Tubulindimeren machen es schwierig, zu Bild einzelnen Mikrotubuli. Wie Mikrotubuli länger werden und lösliche Tubulin wird langsam aufgebraucht, wird das Signal-zu-Rausch-Verhältnis allmählich höher und erlaubt die Abbildung von individual Mikrotubuli. Im Gegensatz zu den Setups mit offenen Systemen verhindert die geometrische Confinement den Austausch von fluoreszierenden Molekülen und Sauerstofffänger Systemkomponenten innerhalb eines Bulk-Reservoir, in signifikanten Bleichen führt. Insbesondere zur Überwachung Spindelanordnung und Positionierung im Laufe der Zeit ist es dem Bild erforderlich mit niedriger Lichtintensitäten, selbst in Gegenwart eines starken Sauerstoff-Scavenger-System. Diese Verfahren ermöglichen die Bottom-up - Rekonstitution von vereinfachten spindelartigen Strukturen in vitro. Zusätzlich zu den Komponenten hier eingeführt sind viele andere Faktoren beschrieben worden bipolar Spindelbildung zu beeinflussen, Positionierung, Ausrichtung, Formen etc. 3. Dieses System kann weiter die einzelnen und kombinierten Effekte von zusätzlichen Kraftgeneratoren zu studieren erweitert werden. Wichtige Beiträge zur Spindelbildung, die derzeit von diesem System nicht vorhanden sind, sind die mitotischen Chromosomen. Mitotische Chromatin hat sich gezeigt,direkte Spindelbildung durch (1) chromokinesins , die so genannte 3 &#39;polar-Ausstoßkräfte erzeugen kann, (2) die Bildung eines RanGTP Gradienten durch die Chromatin-gebundenen RanGEF RCC1 38, (3) Kinetochore , die mit interagieren können (Depolymerisation Mikrotubuli) 39 und (4) das Chromatin selbst, die als eine mechanische Feder in-zwischen gegenüberliegenden Mikrotubuli 40 funktionieren kann. Schließlich bietet das beschriebene System noch begrenzte zeitliche und räumliche Kontrolle der Aktivität und Lokalisierung von eingeführten Kraftgeneratoren. In Zellen lokalisieren viele Spindelanordnung Faktoren an bestimmte Kompartimente oder aktiv sind innerhalb eines begrenzten Zeitfensters. Ein eindrucksvolles Beispiel ist die Aktivität von Dynein, die speziell an der hinteren Seite des C angereichert ist elegans ein Zellstadium Embryo asymmetrische Spindelpositionierung und die Zellteilung zu fördern. In diesem System untersuchen wir derzeit die Möglichkeit einer solchen nachahmt temporal und asymmetrische Aktivität unter Verwendung von Methoden aus der optogenetischen Techniken entlehnt. Darüber hinaus, wie es der Fall für die C. elegans Embryo und Zellen mit einer starren Zellwand, viele Zellen abrunden nicht in der Mitose. Die Form der geometrischen Haft wird einen grundlegenden Einfluss auf die Kräfte haben auf die Spindel wirkende 41. Es ist daher wichtig, Spindelanordnung und die Positionierung in nicht-kugelförmige Tröpfchen als auch zur Rekonstitution, potenziell komplexer mikrofluidischer Systeme , die ermöglichen die Gestaltung und Speicherung von Emulsionströpfchen 42,43. Schließlich in Geweben, Zell-Zell- und Zell-Substrat-Signalisierungs- und Befestigungs externe Signale liefern, die in gerichtete Spindelorientierung übersetzt werden kann, wie es oft in Epithelzellen und Stammzellen beobachtet wird. Alle diese speziellen Aspekte haben in dieser aktuellen Studie berücksichtigt und könnten die Herausforderungen der Zukunft bieten zu bauen in Richtung mehr in vivo -ähnlichen Rekonstitutionen der mitotischen Spindel assemb nichtly und Positionierung.

Während der Mitose werden die Chromosomen des Genoms replizierten an der Zell Äquators organisiert gleichmäßige Verteilung der Schwesterchromatiden über den neu gebildeten Tochterzellen gewährleisten. Chromosome Positionierung und Segregation wird vermittelt durch ihre Bindung an Mikrotubuli Spindel aus zwei gegenüberliegenden Zentrosomen stammen. Neben treuen Chromosomenverteilung zu gewährleisten, bestimmt die Orientierung der mitotischen Spindel auch die Zellteilungsebene 1. Koordinierte Ausrichtung der Zellteilung ist während vieler Stadien der Entwicklung und für Gewebshomöostase 2 wesentlich. Insbesondere kann geregelt mitotischen Spindelpositionierung in der asymmetrischen Verteilung von zellulären Inhalte führen oder sogar Tochterzellen unterschiedlicher Größe 2 produzieren. Mitotischen Spindelanordnung und Orientierung beginnt in Prophase und wird durch ein komplexes Zusammenspiel orchestriert zwischen kooperierenden und Antagonisierung Kraftgeneratoren 3,4. Die erzeugten Kräfte bestehen aus both Zug- und Druckkräfte. Diese Kräfte entstehen sowohl aus Spindel Kontakte mit der Zelle Kortex sowie aus der Spindel, und kann durch die Dynamik der Mikrotubuli sowie von molekularen Motoren und Vernetzern (Figur 1) erzeugt werden. Schubkräfte erzeugt werden, wenn die Mikrotubuli wachsen gegen starre Strukturen wie die Zelle cortex. In Abhängigkeit von der Gesamtwiderstandskraft innerhalb des Systems erzeugt wird , kann dies zur Folge haben in Neupositionierung der mitotischen Spindel (geringe Kräfte) oder Mikrotubuli Knicken oder Katastrophe (hohe Kräfte) 5-8 auszulösen. Die Menge an Kraft , die durch Druck hängt von Mikrotubuli Länge erzeugt werden kann, da Länge eine starke Determinante von 9 Mikrotubuli-Knicken. Darüber hinaus kann die Mikrotubuli , die von einem Zentrosomen stammen schieben gegen den anderen Zentrosomen, einen Mechanismus, der Prophase in frühen Zentrosomen Separation zum Antrieb 3,10 wurde vorgeschlagen. In der Werbungdition Kräften , die durch wachsende Mikrotubuli Mikrotubuli - Enden in Kontakt der Zelle Kortex schieben vermitteln kann auch Kräfte 11 ziehen. Untersuchungen von mehreren Laboratorien haben gezeigt , daß die gesteuerte Aktivität von kortikalen Kraftgeneratoren für die asymmetrische Positionierung der mitotischen Spindeln in vivo 1 erforderlich ist. Wesentlich für diese Zugkräfte ist Cortex-lokalisierte zytoplasmatischen Dynein (im Folgenden als &quot;Dynein&quot; genannt), ein Minus-Ende gerichtet Mikrotubuli Motorprotein 8,12,13. Zum Beispiel, Hefe, lateralen Wechselwirkungen der kortikalen dynein mit dem Mikrotubuli - Gitter Ergebnis in motorabhängigen Mikrotubuli entlang der Hirnrinde gleitenden 14 in Knospung. Jedoch kann kortikalen Zugkräfte auch durch die Fähigkeit der Dynein erzeugt werden 8 end-on Anlagen Depolymerisation von Mikrotubuli zu bilden. Die Energie , die von Mikrotubuli Schrumpfung erzeugt wird, kann zu Kräften führen, die im Allgemeinen eine Größenordnung höher (~ 50 pN sind (Referenz 15 </sup&gt;)) als die Kräfte , die von einzelnen Motorproteine ​​(~ 7-8 pN (ref erzeugt. 16)). End-on Befestigung der kortikalen dynein zu Depolymerisation von Mikrotubuli fördert Spindelpositionierung in Bäckerhefe 17 und C. elegans 13. Ob beide motorabhängigen Schiebe- und Mikrotubuli Depolymerisation angetrieben kortikalen Zugkräften zusammenarbeiten können oder sich gegenseitig aus in vivo ist derzeit nicht bekannt. Zusätzlich zu Mikrotubuli Schubkräfte und Dynein-vermittelte kortikalen Zugkräften wird Zentrosom Positionierung innerhalb der mitotischen Spindel durch zahlreiche andere Proteine ​​gesteuert. Kinesin-5 - Motoren, beispielsweise existieren , wie Tetramere , die antiparallele Mikrotubuli interpolaren vernetzen kann, was in der Erzeugung von nach außen gleitenden Kräfte 18-20. Mitglieder der Kinesin-Motor 5 - Familie sind für Zentrosomen Separation und bipolar Spindelanordnung in allen Eukaryonten erforderlichen sucht, mit der Ausnahme von C. elegans<html> (Übersicht in Bezug 21). Darüber hinaus diffusionsfähige Vernetzer der ASE1 / PRC1 Familie werden auch überlappende Mikrotubuli Regionen von interpolaren Mikrotubuli in vivo zu lokalisieren bekannt und in - vitro - 22-27. Die Kräfte , die durch ASE1 getriebene Expansion des überlappenden Mikrotubuli-Region sind groß genug , Kinesin-14 vermittelte Schiebekräfte in vitro 28,29 entgegenzuwirken. In den Zellen wird ASE1 / PRC1 für stabile Bildung erforderlich Mikrotubuli Regionen in der Spindel Mittelbereich überlappender 25-27,30, was darauf hindeutet , dass die durch diffusionsfähige Vernetzer erzeugten Kräfte wesentlich zur Spindel Organisation beitragen können. Schließlich Kräfte aus der mitotischen Chromatin und Kinetochore beeinflussen mitotischen Spindelanordnung und Positionierung durch verschiedene Wege 3. Da diese Komponenten hier nicht Teil der Rekonstitution Assays beschrieben sind, werden sie nicht im Detail diskutiert werden. jove_content &quot;&gt; Verschiedene Theorien existieren, wie die verschiedenen molekularen Komponenten und Kräfte über kooperieren in Spindelanordnung und Positionierung beschrieben, aber wir sind noch weit von einem quantitativen Verständnis. Neben Experimente in lebenden Zellen, in vitro - Experimenten mit gereinigten Komponenten bieten eine leistungsfähige Route zu helfen , dieses Ziel zu erreichen. Hier haben wir eine visuelle Anleitung zu einer angepassten und erweiterten Version der kürzlich veröffentlichten Methoden (Roth et al. 31) präsentiert, in denen Grund Spindeln in Wasser-in-Öl - Emulsionströpfchen wiederhergestellt werden, beginnend mit einem minimale Anzahl von Komponenten. Verwendung von Mikrofluidik-Techniken werden kugelförmige Tröpfchen mit einer Größe erzeugt, die zu mitotischen Zellen vergleichbar sind. Innerhalb dieser Tröpfchen kann gereinigte Zentrosomen und Tubulin, um Wechselwirkungen zu studieren aster Dynamik der Mikrotubuli kombiniert werden, Krafterzeugung und aster-aster. Durch Einführung von kortikalen (wie dynein) und interpolaren (wie Kinesin-5 / ASE1) Kraft-Generatoren, wirrekonstituieren immer komplexer spindelartige Strukturen, die die in vivo Situation ähnlich starten.

<table><tbody><tr><td><stark>1. Vorbereitung von Mikrofluidik-Chips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomask (Fotomaske auf Foliensubstrat)</td><td>Selba S.A. Schweiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siliziumwafer (4 Zoll Siliziumwafer p/Bor < 1-0-0>10-20 &Omega;-cm, 500-550 &mu; m, SSP, mit 2 Flächen)</td><td>WRS Materials</td><td>4P0SSP-005</td><td></td></tr><tr><td>Schleuderbeschichter&nbsp;</td><td>Polos</td><td>SPIN150I</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Prepolymer RVT615 A+B</td><td>Lubribond</td><td>9481</td><td></td></tr><tr><td>Corona-Behandler</td><td>Elektrotechnische Produkte</td><td>BD-20ACV</td><td></td></tr><tr><td>2. Mikrofluidischer Aufbau</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-( Biotinyl))Avanti</td> <td>Polare Lipide</td><td>870285</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Glaspipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasröhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vakuumpumpe</td><td>Laboport</td><td>KNF</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumkammer</td><td>Kartell</td><td>Polypropylen Vakuumexsikkator</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Tensid (Span80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Branson</td><td>M2800H</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td></td><td></td><td>24 mm x 60 mm, Dicke 1,5</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td></td><td></td><td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Stanzer</td><td>Harris Uni-Core</td><td>135840/135841/135843</td><td></td></tr><tr><td>Labor-Dichtung Film</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valap (Vaseline, Lanolin, Paraffinwachs in gleichen Konzentrationen geschmolzen)</td><td></td><td></td><td>Selbstgebautes</td></tr><tr><td>Hellfeldmikroskop</td><td>Leica</td><td>PMIRB&nbsp;</td><td>Jedes invertierte Hellfeld würde ausreichen</td></tr><tr><td>Druckregler</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-FLEX-4C-1000</td><td></td></tr><tr><td>PEEK Tubing</td><td>Cluzeau Info. Labo, Frankreich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrofluidik Fläschchen (Röhrchen Micrew 0,5 ml und 1 ml)</td><td>VWR, Niederlande</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3. Rekonstituierung der Spindelbildung und -positionierung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10.000 MW, anionisch, fixierbar)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA - Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-oxidase (Glucoseoxidase aus Aspergillus niger)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Dithioltheitol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Katalase (Katalasse aus Rinderleber)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin (Tubulin aus Rinderhirn)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamin-markiertes Tubulin aus Schweinehirn)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GTP (Guanosin-'5-triphosphat, Natriumsalzhydrat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr>&<tr><td>kappa;-Kasein (&kappa;-Kasein aus Rinderserummilch)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>Airfuge (luftbetriebene Ultrazentrifuge)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>CLS</td><td></td></tr><tr><td>4. Wir stellen vor: Spindelanordnungsfaktoren<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Name</strong</td><td>>Company<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosin-'5-triphosphat, Dinatriumsalzhydrat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>PEP (Phospho(enol)pyruvinsäure-Mononatriumsalzhydrat > 97% (enzymatisch))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0564</td><td></td></tr><tr><td>PK/LDH -(Pyruvatkinase/Milchdehydrogenase-Enzyme aus Kaninchenmuskel)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0294</td><td></td></tr></tbody></table>

rekonstitution von grund mitosespindeln in sphärische emulsionströpfchen

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

Die anordnung, Positionierung und Ausrichtung der mitotischen Spindel hängt von den kombinierten Kräften ab, die durch die Dynamik der Mikrotubuli, die Motorproteine der Mikrotubuli und die Vernetzer erzeugt werden. Das Wachstum von Mikrotubuli kann Druckkräfte erzeugen, während das Depolymerisieren von Mikrotubuli die Energie aus der Mikrotubuli-Schrumpfung in Zugkräfte umwandeln kann, wenn sie beispielsweise an kortikales Dynein oder Chromosomen gebunden sind. Darüber hinaus tragen Motorproteine und diffusionsfähige Vernetzer innerhalb der Spindel zur Spindelarchitektur bei, indem sie antiparallele Mikrotubuli verbinden und verschieben. In vivo hat es sich als schwierig erwiesen, den relativen Beitrag der einzelnen Akteure zum Gesamtkräfteverhältnis zu entwirren. Hier stellen wir die Methoden vor, die wir in jüngster Zeit entwickelt haben, um grundlegende mitotische Spindeln in vitro von unten nach oben zu rekonstituieren. Mit Hilfe mikrofluidischer Techniken werden Zentrosomen und Tubulin in Wasser-in-Öl-Emulsionströpfchen eingekapselt, was zur Bildung von geometrisch begrenzten (doppelten) Mikrotubuli-Astern führt. Durch die zusätzliche Einführung von kortikal verankertem Dynein, plus-end-gerichteten Mikrotubuli-Motoren und diffusiblen Vernetzern wird dieses System zur Rekonstitution spindelartiger Strukturen eingesetzt. Die hier vorgestellten Methoden bieten einen Ausgangspunkt für die Rekonstitution vollständigerer mitotischer Spindeln, die eine detaillierte Untersuchung des Beitrags jeder einzelnen Komponente ermöglichen und eine integrierte quantitative Sicht auf das Kraft-Gleichgewicht innerhalb der mitotischen Spindel ermöglichen.

Die Verfahren, dargestellt in den vorhergehenden Abschnitten ermöglichen die Wiederherstellung der spindelartige Strukturen mit zunehmender Komplexität der geometrischen Einschluss von Wasser-in-Öl-Emulsionströpfchen verwendet wird. Dieser Abschnitt beschreibt repräsentative Ergebnisse, die qualitativ die Fähigkeit dieser Assays demonstrieren. Während der Mitose, wenn die bipolare Spindel montiert ist, Rundzellen up Kugeln zu bilden mit einem Durchmesser von etwa 15 um, wie für menschliche Zellen gemessen. Diese Eigenschaft mitotischen Zellform stellt eine geometrische Grenze , die beide einengt und Spindel Größe und Ausrichtung 35,36 lenkt. Mikrofluidik - Techniken bieten ein Maß an geometrische Begrenzung, die die Situation in lebenden Zellen beobachtet genau gleicht und daher erlaubt die Bottom-up - Rekonstruktion von Mitosespindeln in vitro. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Microtubule Astern sind für sich bereits in der Lage komplexe Verhalten, wenn Mikrotubuli Wachstum von geometrischen Grenzen eingeschränkt ist. Als Mikrotubuli wachsen, drängen durch den Einbau von neuen Tubulindimeren erzeugten Kräfte treiben die beiden Zentrosomen zu den Seiten der Emulsionströpfchen entgegenwirkt. Zunächst diffundieren Zentrosomen frei innerhalb des begrenzten Volumens (4a, linke Tafel). Nach ca. 20-30 Minuten werden die ersten Mikrotubuli sichtbar und Zentrosom Diffusion eingeschränkt wird als Mikrotubuli gegen die Rinde in alle Richtungen wachsen. Astern mit Mikrotubuli von mittlerer Länge (etwa 50% des Tropfendurchmesser) kann (sterisch) abstoßen anderen, mit Mikrotubuli gegeneinander schieben, die anderen Zentrosomen und die Rinde. Dies führt zu einem typischen &quot;bipolar&quot; spindelartige Anordnung mit den beiden Zentrosomen einander (4a, Mitte) entgegenwirkt . Wenn Mikrotubuli wachsen mehr als ~ 50% des tröpfchen diaMeter, erhalten die Zentrosomen geschoben weiter an gegenüberliegenden Grenzen des Tropfens, mit Mikrotubuli entlang der Tröpfchen Cortex (4a, rechts) wächst. Es ist wichtig, sowohl zu beachten, dass in diesen Tests Mikrotubuli Wachstumsraten sind sehr empfindlich auf Temperatur und Tubulin-Konzentrationen. Diese Parameter werden daher dringend die Zeit beeinflussen, wenn die Keimbildung wird zunächst beobachtet und wenn stationären Zustand aster Positionen erreicht werden. In Zellen, kortikalen Zugkräfte durch die Bildung von tragenden Befestigungen zwischen Mikrotubuli Plus-Enden und Cortex-assoziiertes dynein erzeugt. In tierischen Zellen, hängt diese Assoziation auf der Gai / LGN / NuMA - Komplex, der an die Plasmamembran über N-terminale Myristoylierung von G☐i - 1 ausgerichtet ist. In diesen Rekonstitution Assays wird die Anforderung des Gai / LGN / NuMA-Komplex durch direkte Kopplung Dynein an biotinylierte Lipide umgangen durch dieBildung von Biotin-Streptavidin-Biotin-Komplexe. Diese Anleihen sind relativ stabil (K D ~ 10 -14 M) 37 und bilden schnell ( in der Regel innerhalb von 10 Minuten nach der Emulsionstropfenbildung, vor Mikrotubuli Nukleation wird deutlich) (Abbildung 4b). In Gegenwart von kortikalen dynein behalten Zentrosomen typischerweise eine zentralere Position, wohingegen in der Abwesenheit von Dynein, Zentrosomen zu gegenüberliegenden Seiten des Tröpfchens cortex (Abbildung 4c) gedrückt werden. Wir folgern dies das Ergebnis von zwei Effekten ist, die verhindern und Mikrotubuli Schubkräfte entgegenzuwirken. (1) Dynein fördert direkt Mikrotubuli Katastrophen, wodurch Mikrotubuli Länge zu beschränken und übermäßige Mikrotubuli Knicken zu verhindern, und (2) kortikalen Zugkräfte führen zu Netto-Zentrieren Kräfte auf die einzelnen Astern 8, der die aster-aster Abstoßungskräfte entgegenzuwirken. Das diffusionsfähige Vernetzer ASE1 f induziertorces, die die überlappenden Bereich von anti-parallel Mikrotubuli 29 tendenziell zunehmen. In Übereinstimmung damit, in Gegenwart von ASE1 (und in Abwesenheit von Dynein) Zentrosomen nahe beieinander gefunden mit ASE1 lokalisierende interpolaren Mikrotubuli (4d) zu gebündelt. Die Mitglieder des Kinesin-5-Familie fahren Zentrosom Trennung durch Kräfte aus der Spindel (siehe Einleitung) Bereitstellung schieben. In Gegenwart von Cut7 (der S. pombe Kinesin-5 Ortholog), Zentrosomen sind an gegenüberliegenden Seiten der Emulsionströpfchen geschoben, auch in Gegenwart von ASE1 (Figur 4e). Durch die Kombination von kortikalen und interpolare Kraftgeneratoren kann der Grad der Komplexität weiter erhöht werden, in diesen Experimenten, was schließlich zu einem umfassenden Verständnis der bipolaren mitotischen Spindelanordnung führt. Eine detaillierte quantitative Beschreibung dieser Ergebnisse werden in der Zukunft (Roth et al., Manuskript in Vorbereitung) zur Verfügung stehen. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Neben der Position der Zentrosomen zu festen Zeitpunkten zu beobachten und ihr Verhalten in Bezug auf die beobachteten Längen der Mikrotubuli, wertvolle Informationen können im Anschluss an die Positionierung über erhalten werden Zeit. Durch die Reduzierung Belichtungszeiten und Laserintensitäten, ist es nun möglich aster Positionierung in 2 min Intervallen für mindestens 1 Stunde mit nur ~ 30% Bleichen folgen. Dies ermöglicht die Überwachung von aster Montage und Positionierung von frei diffundierenden Zentrosomen (0 min.) Über die zentrale (12 min.) Zu dezentralen Astern (36 min und weiter) (Abbildung 5c). Dies erleichtert die Studie sowohl stationäre Verhalten und Spindelanordnung Kinetik. Durch Tröpfchen mit verschiedenen Inhalten in der gleichen Probe kombiniert, ist es zum Beispiel möglich , Zentrosomen Positionierung und Spindelanordnung kinetics in Tröpfchen direkt mit und ohne kortikalen Krafterzeuger (Abbildung 5b) vergleichen. Abbildung 1: Kräfte , die auf die mitotische Spindel Mehrere krafterzeugenden Moleküle wirken auf die Mikrotubuli der mitotischen Spindel Spindelbildung und Positionierung zu fördern.. Mikrotubuli, die in die Zelle Rinde wachsen, um eine Schubkraft auf dem Zentrosom erzeugen. Cortical dynein (lila) fängt Mikrotubuli und erzeugt eine Zugkraft auf den Zentrosomen Depolymerisation. Innerhalb der Spindel, Kinesin-5 / Cut7 Motorproteine ​​liefern eine nach außen gerichtete Schiebekraft auf antiparallele Mikrotubuli, während Vernetzer der PRC1 / ASE1 Familie eine nach außen erzeugen entgegengesetzte Kraft schieben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen .</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Mikrofluidik - Chip - Design (A) Entwurf von 4 - Zoll - Fotomaske 4 Mikrofluidik - Chips enthält. (B) Detaillierte Darstellung eines einzelnen Chips. Chips enthalten einen Ausgangskanal und drei Einlass durch einen Staubfilter gefolgt Kanäle. Einlasskanal 1 enthält die Wasserphase, Kanal 2 der Lipid / Öl-Phase und Kanal 3 können die gebildeten Tröpfchen mit zusätzlichen Lipid / Öl-Phase zu verdünnen, verwendet werden. (C) Detaillierte Darstellung der Kreuzung , wo die Lipid / Öl-Phase (kommt von oben und unten) mit der Wasserphase trifft (von links kommend). An der Kreuzung wird Tröpfchen bilden und dem Austrittskanal auf der rechten Seite in Richtung fließen. (D) Detaillierte Darstellung eines Staubfilter mit 2 &amp; mgr; m - Kanälen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> Abbildung 3:. Methodik für Wasser-in-Öl - Emulsion Tröpfchenbildung (A) Mikrofluidik - Chip und der Mikrofluidik Schlauch auf einem Hellfeld - Mikroskop. Sowohl die Wasser- und Lipid / Öl-Phasen-Röhren sind mit den Chip Einlässe 1 bzw. 2. (B) Einschränkung auf Mikrofluidik - Chip , wo die Wasser- und Lipid / Öl-Phasen erfüllen. Durch Ändern der Drücke können Tröpfchen Größe gesteuert werden. (C) Entwurf von PDMS beschichteten Flusszellen. Nach dem Laden der Tröpfchen in der Strömungszelle werden die offenen Enden mit zusätzlichen Valap geschlossen. (D) Schematische Darstellung der Tröpfchenbildung. Tröpfchen werden verwendet Zentrosomen zu verkapseln, Tubulin und zusätzliche Komponenten für mitotischen Spindelbildung erforderlich. (E) Schematische Darstellung der kortikalen-dynein Targeting. Biotinylated (Bio) dynein wird an biotinylierte Lipide durch Streptavidin (Strp) ausgerichtet. <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> Abbildung 4:. Repräsentative Ergebnisse spindel Rekonstitutionen mit zunehmender Komplexität (A) Maximale Intensität Projektionen von Tröpfchen , die zwei Zentrosomen Beispiele von kurzen, mittleren und langen Mikrotubuli zeigt. Zentrosomen und Mikrotubuli werden durch die Zugabe von 10% HiLyte-488 markiertes Tubulin visualisiert. Maßstabsbalken = 10 um. (B) Lokalisierung von GFP-Biotin-Dynein-TMR in Abwesenheit (-, links) und Anwesenheit (+, rechts) von Streptavidin (Strp). (C) Microtubule aster Positionierung in Abwesenheit (-, links) oder Gegenwart (+, rechts) der kortikalen GFP-Biotin-Dynein-TMR. (D) Mikrotubulus aster (linkes Bild, green) Positionierung in Gegenwart von ASE1 (Mitteltafel, rot). (E) Mikrotubulus aster (links, grün) Positionierung in Gegenwart von ASE1 und Cut7 (Kinesin-5) (mittleres Feld, rot). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> Abbildung 5: Imaging Aster Positionierdynamik in vitro (A) Entwurf eines PDMS Tasse , die bis zu mehreren Stunden Tröpfchen Bildgebung ermöglicht.. (B) Erzeugung, Speicherung und Darstellung von Tröpfchen (übertragen) mit unterschiedlichen Inhalten, veranschaulicht durch Abwesenheit (links) die Aufnahme (rechts) von fluoreszierendem Dextran (Alexa 647). (C) Einzelebene Bilder einer 60 min Zeitraffer (2 - Minuten - Intervallen) von einem z-Stapel entnommen (2 &amp; mgr; m Abstände) von adroplet eine einzige Zentrosom enthält. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Der Aufbau und die Positionierung der mitotischen Spindel hängen von den kombinierten Kräften ab, die durch die Dynamik der Mikrotubuli, Motorproteine und Vernetzer erzeugt werden. Im Folgenden stellen wir unsere neu entwickelten Methoden vor, bei denen der geometrische Einschluss von sphärischen Emulsionströpfchen für die Bottom-up-Rekonstitution basischer mitotischer Spindeln genutzt wird.

Rekonstitution von Grund Mitosespindeln in Sphärische Emulsionströpfchen

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, spindelförmige Strukturen, die der Mitosespindel ähneln, innerhalb der geometrischen Begrenzung von Wasser-in-Öl-Emulsionströpfchen neu zu rekonstituieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Mitosespindelbildung zu beantworten, beispielsweise wie Spindeln positioniert und aufgebaut werden und welchen spezifischen Beitrag einzelne Komponenten zu diesen Prozessen leisten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass wir einen Bottom-up-Ansatz verwenden, um spindelähnliche Strukturen innerhalb einer geometrischen Begrenzung zu rekonstituieren, die der Form einer mitotischen Zelle nachempfunden ist.Diese Methode kann auch verwendet werden, um andere Prozesse zu untersuchen, die von der zellulären Einschränkung abhängen. Mischen Sie 10 Teile PDMS-Präpolymer mit einem Teil Härter in einer Gesamtmasse von etwa 40 Gramm. Anschließend das Gemisch etwa 30 Minuten lang in eine Vakuumkammer stellen, um Luftblasen zu entfernen.Unterdessen wickeln Sie Aluminiumfolie um die Form, um eine Schale mit einer Tiefe von einem Zentimeter und einem Durchmesser von vier Zoll zu erstellen. Wenn bereit, gießen Sie etwa 3/4 der PDMS-Mischung in die Form. Danach bringen Sie das PDMS erneut für 30 Minuten in eine Vakuumkammer.Nach dem Entgasen das PDMS eine Stunde lang bei 100 Grad Celsius aushärten lassen. In der Zwischenzeit einige Objektträger für das Spin-Beschichten vorbereiten, indem sie mit Druckluft abgestaubt werden. Anschließend die verbleibende PDMS-Mischung auf die Objektträger spin-beschichten.Heizen Sie diese Objektträger eine Stunde lang auf 100 Grad Celsius, um das PDMS zu aushärten. Danach entfernen Sie das PDMS vorsichtig mit einem Rasiermesser und stanzen die erforderlichen Löcher in die PDMS-Streifen, um mikrofluidische Chips herzustellen. Behandeln Sie nun den mikrofluidischen Chip und einen mit PDMS beschichteten Objektträger kurzzeitig mit einer Coronaentladung.Schließlich wird ein mikrofluidischer Chip mit den Kanälen nach unten auf jede Objektträgerplatte gelegt und die Chips über Nacht bei 100 Grad Celsius ausgebacken. Zunächst werden mit mit Chloroform gewaschenem Glaswerk etwa 250 Mikrogramm in Chloroform gelöste Lipide vorbereitet. Die Lipidmischung wird vorsichtig mit Inertgas getrocknet.Und anschließend eine Stunde lang in eine Vakuumkammer stellen. Danach lösen Sie die Lipide in Mineralöl und 2,5 % Tensid auf 0,5 Milligramm pro Milliliter, was etwa 500 Mikroliter entspricht. Um die Lipide vollständig aufzulösen, beschallen Sie das Gemisch 30 Minuten lang bei 40 Kilohertz. Als Nächstes beschichten Sie Deckgläser durch Schleuderbeschichtung mit PDMS mit einer Dicke, die der des Mikroskopobjektivs entspricht. Danach beschichten Sie Objektträger durch Schleuderbeschichtung mit PDMS. Anschließend härten Sie die mit PDMS beschichteten Deckgläser und Objektträger eine Stunde lang bei 100 Grad Celsius aus.Danach stellen Sie die Strömungszellen her, indem Sie dünne Streifen aus Laborverschlussfolie in engem Abstand auf die mit PDMS beschichteten Objektträger platzieren. Positionieren Sie etwa zwei Millimeter breite Streifen in einem Abstand von etwa zwei Millimetern. Danach decken Sie die Strömungszellen mit einem mit PDMS beschichteten Deckglas ab und versiegeln die Anordnung, indem Sie die Folie für etwa eine Minute bei 100 Grad Celsius schmelzen.Einmal erhitzt, vorsichtig den Deckel aufdrücken und mit Valap versiegeln. Als Nächstes einen PDMS-Becher für die Langzeit-Aufnahme vorbereiten. In einer drei Millimeter dicken PDMS-Scheibe ein Loch mit vier Millimeter Durchmesser stanzen.Danach die PDMS-Scheibe und ein mit PDMS beschichtetes Deckglas einer Corona-Behandlung unterziehen. Nach der Behandlung beide übereinander positionieren und die Anordnung über Nacht bei 100 Grad Celsius aushärten. Die Bildung von Tröpfchen an einem invertierten Hellfeldmikroskop überwachen.Verbinden Sie die lipidbasierte Ölphase mit dem Druckregler und erhöhen Sie den Druck, bis ein Öltropfen aus dem Spitzenrohr austritt. Verbinden Sie das Spitzenrohr mit Einlass zwei des Mikrofluidikchips. Füllen Sie anschließend den Mikrofluidikchip vollständig über Einlass zwei mit der lipidbasierten Ölphase.Führen Sie anschließend die auf MRB-80 basierende wässrige Phase über Einlass eins zu. Steuern Sie die Tröpfchengröße, indem Sie die Drücke der Lipid-Ölphase und der wässrigen Phase anpassen, um Tröpfchen mit einem Durchmesser von etwa 15 Mikrometern zu erzeugen. Ein Druck von etwa 800 Millibar für die Lipid-Ölphase und 200 Millibar für die wässrige Phase ist ein guter Ausgangspunkt.Nachdem die gewünschte Tröpfchengröße erreicht ist, füllen Sie die Durchflusszelle vollständig mit Tröpfchen. Diese Tröpfchen werden unter Verwendung kleiner Volumina der wässrigen Phase gebildet. Das bedeutet, dass die mikrofluidische Anordnung schnell betrieben werden muss, um nicht die gesamte wässrige Phase zu verlieren, bevor Tröpfchen der korrekten Größe gebildet wurden.Nach dem Befüllen die Enden der Durchflusszelle vorsichtig mit Valap verschließen. Wenn sich die Tropfen weiterbewegen, ist die Abdichtung nicht vollständig oder es könnten Luftblasen eingeführt worden sein. Für Langzeit-Aufnahmen die Tropfen in eine PDMS-Schale überführen und mit einer Schicht aus Öl-Lipid-Gemisch abdecken.Tauen Sie die Zentrosomen bei Raumtemperatur auf und geben Sie sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um eine ordnungsgemäße Mikrotubulus-Nukleation sicherzustellen. Währenddessen bereiten Sie die Assay-Mischung auf Eis vor. Diese sollte Tubulin, GTP, ein Sauerstoff-Scavenger-System, molekulare Kraftgeneratoren wie Mikrotubulus-Vernetzer, ATP und ein ATP-regenerierendes System enthalten.Nach dem Mischen die Probe im gek&uuml;hlten Airfuge-Rotor bei 30 psi drei Minuten lang zentrifugieren. Anschlie&szlig;end die vorerhitzten Zentrosomen der Mischung hinzuf&uuml;gen. Die Menge der hinzugef&uuml;gten Zentrosomen so optimieren, dass sich ein oder zwei Zentrosomen pro Tr&ouml;pfchen befinden.Verwenden Sie dann diese Mischung, um Emulsionströpfchen wie zuvor beschrieben herzustellen. Um Dynein an biotinylierte Lipide an der Tröpfchenkortex zu rekrutieren, fügen Sie GFP-Dynein TMR und Streptavidin zur wässrigen Phase hinzu. Stellen Sie das Mikrotubuli-Wachstum nach 30 Minuten bei 26 Grad Celsius an einem Spinning-Disk-Konfokalmikroskop dar.Während der Bildgebung kann das Mikrotubuli-Wachstum durch Erhöhung der Temperatur auf 28 oder sogar 30 Grad Celsius gefördert werden. Erstellen Sie für Z-Projektionen Stapel mit einmikronigen Abständen, was etwa 20 Bilder pro Tröpfchen erfordern sollte. Gehen Sie zum Hauptkamerapanel, klicken Sie auf „Edit Z“ und stellen Sie den Z-Schritt auf 1,0 ein.Klicken Sie auf „Weiter“, um die Einstellungen zu speichern. Legen Sie anschließend den maximalen linearen EM-Verstärkungsfaktor fest, indem Sie im Erfassungsbereich auf die Registerkarte Kamera klicken und den EM-Verstärkungsregler auf 300 schieben. Stellen Sie danach in derselben Registerkarte die Belichtungszeit auf 200 Millisekunden ein.Klicken Sie auf „Aufnehmen“, um die Einstellungen zu speichern. Führen Sie bei Live-Bildgebungsexperimenten alle zwei Minuten Z-Projektionen über einen Zeitraum von zwei Stunden durch, wobei die Belichtungszeiten auf etwa 100 Millisekunden reduziert und die Z-Intervalle auf zwei Mikrometer erhöht werden. Verwenden Sie für Live-Bildgebungsexperimente zur maximalen Immobilisierung der Probe eine PDMS-Schale anstelle einer herkömmlichen Durchflusszelle.Mithilfe der beschriebenen Protokolle wurde die Bildung von Asterstrukturen in Wasser-Öl-Emulsionströpfchen, die Zentrosomen enthielten, untersucht. Anfangs diffundierten die Zentrosomen frei innerhalb der begrenzten Volumina. Nach etwa 20 bis 30 Minuten wurden die ersten Mikrotubuli sichtbar, und die Diffusion der Zentrosomen wurde eingeschränkt, da die Mikrotubuli in alle Richtungen gegen die Cortexschicht wuchsen.Wenn sich die Mikrotubuli länger als die Hälfte des Durchmessers des Tropfens ausdehnen, werden die Zentrosomen an gegenüberliegende Grenzflächen gedrückt, wobei sich die Mikrotubuli entlang der Tropfenkortikalis ausbilden. Ohne Streptavidin ist Dynein im Tropfen diffus verteilt. Mit Streptavidin hingegen wird Dynein innerhalb von etwa 10 Minuten nach der Tropfenbildung an die biotinylierten Lipide gebunden.Bei Betrachtung von fluoreszierendem Tubulin in Gegenwart von kortikalem Dynen wird deutlich, dass die Zentrosomen zentral positioniert sind. Hingegen werden die Zentrosomen in Abwesenheit von Dynen an entgegengesetzte Seiten des Tröpfchens gedrückt. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass Dynen Mikrotubuli-Katastrophen und kortikale Zugkräfte fördert, was zur Zentrierung der Sternstrukturen führt.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mikrofluidik-Technologien einsetzt, um spindelförmige Strukturen in sphärischen Emulsions-Tröpfchen herzustellen. Sobald die Technik beherrscht ist, können die Tröpfchenbildung und die Bildgebung bei korrekter Durchführung innerhalb von zwei bis drei Stunden durchgeführt werden. Mithilfe dieses Verfahrens können weitere Faktoren der Spindelbildung eingeschlossen werden, um deren Einfluss auf die Spindelmorphologie und -positionierung zu untersuchen.Es sollten stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen getroffen werden, wenn Chloroform oder PDMS verwendet wird.

reconstitution-basic-mitotic-spindles-spherical-emulsion

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video beschreibt die Technik zur Untersuchung der Septin-Protein-Assemblierung auf Mikrosphären, die mit Lipiddoppelschichten beschichtet sind. Diese Technik hilft beim Verständnis der krümmungsabhängigen Anordnungen von Proteinen auf gekrümmten Oberflächen.

Sphärisch gestützter Lipid-Doppelschicht-Assay: Eine Technik zur Beobachtung der Septin-Assemblierung auf Mikrosphären

Riesenvesikel mit hochgepackten mikrometergroßen Komponenten sind nützliche Zellmodelle. Das Wasser-in-Öl-Emulsionszentrifugationsverfahren ist ein einfaches, leistungsstarkes Werkzeug zur Herstellung von riesigen Vesikeln mit verkapselten Materialien.

Herstellung von Riesenvesikeln Encapsulating Microspheres durch Zentrifugation einer Wasser-in-Öl-Emulsion

Die vorliegende Arbeit beschreibt eine Methode um Mizellen Nanokristalle, einer neuen großen Klasse von Nanobiomaterials zu fabrizieren. Diese Methode verbindet Elektrospray Top-Down, Bottom-up-Selbstmontage, und lösemittelhaltige Strukturkontrolle. Das Herstellungsverfahren ist weitgehend kontinuierlich, qualitativ hochwertige Produkte zu produzieren und besitzt eine kostengünstige Mittel zur Strukturkontrolle.

Herstellung von sphärischen und Wurm-förmigen Mizellen Nanokristalle durch die Kombination von Elektrospray, Selbstmontage und lösemittelhaltige Strukturkontrolle

Wir präsentieren eine Methode zur Erzeugung von in-vitro- autarken mitotischen Schwingungen auf der Ebene der einzelnen Zelle durch Verkapselung Ei Extrakte von Xenopus Laevis in Wasser-in-Öl-Mikroemulsionen.

Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte

Wasser-in-Öl-Tröpfchen-Assays sind nützlich für die analytische Chemie, die Enzymevolution und die Einzelzellanalyse, erfordern jedoch typischerweise Mikrofluidik, um die Tröpfchen zu bilden. Hier beschreiben wir die Partikel-Template-Emulgierung, einen mikrofluidikfreien Ansatz zur Durchführung von Tröpfchenassays.

Partikel-Template-Emulgierung ermöglicht mikrofluidsäurefreie Tröpfchen-Assays

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Rekonstitution der Msp1-Extraktionsaktivität mit vollständig gereinigten Komponenten in definierten Proteoliposomen vor.

Rekonstitution der Msp1-Extraktionsaktivität mit vollständig gereinigten Komponenten

Hier wird ein TIRF-Mikroskopie-basierter  In-vitro-Rekonstitutionsassay vorgestellt, um gleichzeitig die Dynamik zweier Mikrotubulipopulationen zu quantifizieren und zu vergleichen. Es wird ein Verfahren beschrieben, um gleichzeitig die kollektive Aktivität mehrerer Mikrotubuli-assoziierter Proteine auf vernetzten Mikrotubulibündeln und einzelnen Mikrotubuli zu betrachten.

Simultane Visualisierung der Dynamik von vernetzten und einzelnen Mikrotubuli in vitro mittels TIRF-Mikroskopie

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Bildung von Mikrotubuli-Baugruppen in Form von Tactoiden unter Verwendung von MAP65, einem pflanzlichen Mikrotubuli-Vernetzer, und PEG als Crowding-Agent vor.

Selbstorganisation von Mikrotubuli-Taktoiden

In diesem Manuskript demonstrieren wir die experimentellen Techniken zur Verkapselung des F-Aktin-Zytoskeletts in riesige unilamellare Lipidvesikel (auch Liposomen genannt) und die Methode zur Bildung einer Kortex-bioimitierenden F-Aktin-Schicht am inneren Blättchen der Liposomenmembran.

In vitro Rekonstitution des Aktinzytoskeletts in riesigen unilamellaren Vesikeln

Dieses Protokoll bietet einen experimentellen Rahmen, um den physikalischen Einfluss des Zytoskeletts auf die Kernform und die inneren membranlosen Organellen im Eizellsystem der Maus zu dokumentieren. Das Framework kann für die Verwendung in anderen Zelltypen und Kontexten angepasst werden.

Erfassung der zytoskelettbasierten Agitation des Maus-Eizellkerns über räumliche Skalen hinweg

In diesem Artikel wird eine einfache Ein-Topf-Rekonstitution von Zytoskelett-Netzwerken innerhalb von phasengetrennten Riesenvesikeln vorgestellt. Die Methode kann verallgemeinert und auf die Verkapselung oder den Einschluss einer Vielzahl von Biomolekülen angewendet werden.

In vitro Rekonstitution von Zytoskelett-Netzwerken in phasengetrennten riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs)

Erfahren Sie die Rekonstitution von Mitosespindeln in sphärischen Emulsionströpfchen für Zellbiologie. Diese Bottom-up-Methode ermöglicht die Untersuchung von Spindelpositionierung und -dynamik in geometrischer Einschränkung.

Rekonstitution von Grund Mitosespindeln in Sphärische Emulsionströpfchen

Weitere Videos entdecken