Rekonstitution von Grund Mitosespindeln in Sphärische Emulsionströpfchen

Der Aufbau und die Positionierung der mitotischen Spindel hängen von den kombinierten Kräften ab, die durch die Dynamik der Mikrotubuli, Motorproteine und Vernetzer erzeugt werden. Im Folgenden stellen wir unsere neu entwickelten Methoden vor, bei denen der geometrische Einschluss von sphärischen Emulsionströpfchen für die Bottom-up-Rekonstitution basischer mitotischer Spindeln genutzt wird.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mitotische spindelartige Strukturen innerhalb des geometrischen Einschlusses von Wasser in Ölemulsionströpfchen zu rekonstituieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der mitotischen Spindelmontage zu beantworten, z. B. wie Spindeln positioniert und montiert werden und welchen spezifischen Beitrag die einzelnen Komponenten zu diesen Prozessen leisten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir einen Bottom-up-Ansatz verwenden, um spindelartige Strukturen innerhalb des geometrischen Einschlusses zu rekonstituieren, die die Form einer mitotischen Zelle nachahmen.

Diese Methode kann auch verwendet werden, um andere Prozesse zu untersuchen, die vom zellulären Einschluss abhängen. Mischen Sie 10 Teile PDMS-Prepolymer mit einem Teil Härter in einer Gesamtmasse von ca. 40 Gramm. Geben Sie die Mischung dann für etwa 30 Minuten in eine Vakuumkammer, um Luftblasen zu entfernen.

Wickeln Sie in der Zwischenzeit Aluminiumfolie um die Form, um einen einen Zentimeter tiefen Becher mit einem Durchmesser von vier Zoll zu erhalten. Wenn Sie fertig sind, gießen Sie etwa 3/4 der PDMS-Mischung in die Form. Bringen Sie das PDMS dann für weitere 30 Minuten in eine Vakuumkammer zurück.

Nach der Entgasung härten Sie das PDMS eine Stunde lang bei 100 Grad Celsius aus. Bereiten Sie in der Zwischenzeit einige Objektträger für die Schleuderbeschichtung vor, indem Sie sie mit Druckluft abstauben. Dann schleudern Sie die restliche PDMS-Mischung auf die Objektträger.

Härten Sie diese Objektträger eine Stunde lang bei 100 Grad Celsius aus, um das PDMS zu härten. Entfernen Sie anschließend das PDMS vorsichtig mit einer Rasierklinge und stanzen Sie die erforderlichen Löcher aus den PDMS-Streifen, um mikrofluidische Chips herzustellen. Nun wird der mikrofluidische Chip und ein PDMS-beschichteter Glasobjektträger für einige Sekunden coronabehandelt.

Platzieren Sie abschließend einen mikrofluidischen Chip mit den Kanälen nach unten auf jedem Objektträger und backen Sie die Chips über Nacht bei 100 Grad Celsius. Bereiten Sie zunächst mit Chloroform gewaschene Glaswaren etwa 250 Mikrogramm chloroformgelöste Lipide vor. Trocknen Sie das Lipidgemisch vorsichtig mit Inertgas.

Und dann stellen Sie es für eine Stunde in eine Vakuumkammer. Lösen Sie dann die Lipide in Mineralöl und 2,5% Tensid auf 0,5 Milligramm pro Milliliter auf, was etwa 500 Mikrolitern entspricht. Um die Lipide vollständig aufzulösen, beschallen Sie die Mischung 30 Minuten lang bei 40 Kilohertz.

Als nächstes wird PDMS auf Deckgläser mit einer Dicke geschleudert, die dem Mikroskopobjektiv entspricht. Anschließend wird PDMS auf Objektträger geschleudert. Härten Sie nun die PDMS-beschichteten Deckgläser und Objektträger eine Stunde lang bei 100 Grad Celsius aus.

Stellen Sie dann die Durchflusszellen her, indem Sie dünne Scheiben Laborversiegelungsfolie in engem Abstand auf die PDMS-beschichteten Objektträger legen. Positionieren Sie die Streifen drei Millimeter im Abstand von etwa zwei Millimetern. Decken Sie dann die Durchflusszellen mit einem PDMS-beschichteten Deckglas ab und versiegeln Sie die Baugruppe, indem Sie die Folie eine kurze Minute lang bei 100 Grad Celsius schmelzen.

Drücken Sie nach dem Erhitzen den Deckel vorsichtig nach unten und verschließen Sie ihn mit Valap. Bereiten Sie als Nächstes einen PDMS-Becher für die Langzeitbildgebung vor. Stanzen Sie ein Loch mit einem Durchmesser von vier Millimetern in eine drei Millimeter dicke PDMS-Scheibe.

Anschließend wird die PDMS-Scheibe und ein PDMS-beschichtetes Deckglas koronabehandelt. Nach der Behandlung legst du sie aufeinander und backst die Baugruppe über Nacht bei 100 Grad Celsius. Überwachen Sie die Bildung von Tröpfchen an einem inversen Hellfeldmikroskop.

Verbinden Sie die Lipidölphase mit dem Druckregler und erhöhen Sie den Druck, bis ein Tropfen Öl aus dem Spitzenschlauch austritt. Verbinden Sie den Spitzenschlauch mit dem zweiten Einlass des Mikrofluidik-Chips. Füllen Sie dann die mikrofluidischen Chips vollständig mit der Lipidölphase aus dem zweiten Einlass.

Als nächstes führen Sie eine MRB-80-basierte Wasserphase aus dem ersten Einlass ein. Kontrollieren Sie die Tröpfchengröße, indem Sie den Druck der Lipidölphase und der Wasserphase ändern, um Tröpfchen mit einem Durchmesser von etwa 15 Mikrometern zu erzeugen. Etwa 800 Millibar für die Lipidölphase und 200 Millibar für die Wasserphase sind ein guter Ausgangspunkt.

Nachdem Sie die gewünschte Tröpfchengröße erreicht haben, füllen Sie die Durchflusszelle vollständig mit Tröpfchen. Diese Tröpfchen werden mit kleinen Volumina der Wasserphase gebildet. Das bedeutet, dass der mikrofluidische Aufbau schnell ablaufen muss, um nicht die gesamte Wasserphase zu verlieren, bevor sich Tröpfchen in der richtigen Größe gebildet haben.

Nach dem Befüllen verschließen Sie die Enden der Durchflusszelle vorsichtig mit Valap. Wenn die Tröpfchen nicht aufhören, sich zu bewegen, ist die Versiegelung nicht vollständig oder es könnten Luftblasen eingeführt worden sein. Für die Langzeitbildgebung geben Sie die Tröpfchen in einen PDMS-Becher und bedecken sie mit einer Schicht Öl-Lipid-Mischung.

Tauen Sie die Zentrosomen bei Raumtemperatur auf und stellen Sie sie 20 Minuten lang auf 37 Grad Celsius, um eine ordnungsgemäße Keimbildung der Mikrotubuli zu gewährleisten. Bereiten Sie während des Wartens die Assay-Mischung auf Eis vor. Dieses sollte Tubulin, GTP, ein Sauerstofffängersystem, molekulare Kraftgeneratoren wie Mikrotubuli-Vernetzer, ATP und ein ATP-Regenerationssystem enthalten.

Nach dem Mischen wird die Probe im gekühlten Airfuge-Rotor drei Minuten lang bei 30 psi heruntergeschleudert. Fügen Sie dann die vorgewärmten Zentrosomen zur Mischung hinzu. Optimieren Sie die Menge der hinzugefügten Zentrosomen, um ein oder zwei Zentrosomen pro Tröpfchen zu erhalten.

Verwenden Sie dann diese Mischung, um Emulsionströpfchen wie zuvor beschrieben herzustellen. Um Dynein zu biotinylierten Lipiden in der Tröpfchenrinde zu rekrutieren, schließen Sie GFP-Dynein TMR und Streptavidin in die Wasserphase ein. Visualisieren Sie an einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop das Wachstum der Mikrotubuli nach 30 Minuten bei 26 Grad Celsius.

Während der Bildgebung kann das Wachstum der Mikrotubuli gefördert werden, indem die Temperatur auf 28 oder sogar 30 Grad Celsius erhöht wird. Nehmen Sie für Z-Projektionen Stapel mit einem Mikrometer-Intervall, was etwa 20 Bilder pro Tröpfchen erfordern sollte. Gehen Sie zum Hauptkamera-Panel, klicken Sie auf Edit Z und stellen Sie Z Step auf 1.0 ein.

Klicken Sie auf Weiter, um die Einstellungen zu speichern. Stellen Sie als Nächstes die maximale lineare EM-Verstärkung ein, indem Sie im Erfassungsfenster auf die Registerkarte Kamera klicken und den EM-Verstärkungsbalken auf 300 schieben. Stellen Sie dann die Belichtungszeit auf derselben Registerkarte auf 200 Millisekunden ein.

Klicken Sie auf Aufnehmen, um die Einstellungen zu speichern. Führen Sie für Live-Imaging-Experimente zwei Stunden lang alle zwei Minuten Z-Projektionen durch, indem Sie die Belichtungszeiten auf etwa 100 Millisekunden reduzieren und die Z-Intervalle auf zwei Mikrometer erhöhen. Verwenden Sie für Live-Imaging-Experimente einen PDMS-Becher anstelle einer normalen Durchflusszelle, um eine maximale Immobilisierung der Probe zu gewährleisten.

Unter Verwendung der beschriebenen Protokolle wurde die Asterbildung in Wasser- und Ölemulsionströpfchen, die Zentrosomen enthalten, untersucht. Zunächst diffundieren die Zentrosomen frei innerhalb der begrenzten Volumina. Nach etwa 20 bis 30 Minuten werden die ersten Mikrotubuli sichtbar, und die Zentrosomdiffusion wird eingeschränkt, da die Mikrotubuli in alle Richtungen gegen die Rinde wachsen.

Wenn die Mikrotubuli länger als die Hälfte des Tröpfchendurchmessers werden, werden die Zentrosomen an entgegengesetzte Grenzen gedrückt, wobei die Mikrotubuli entlang der Tröpfchenrinde wachsen. Ohne Streptavidin ist Dymein innerhalb des Tröpfchens diffus. Mit Streptavidin wird Dynein jedoch innerhalb von etwa 10 Minuten nach der Tröpfchenbildung mit den biotinylierten Lipiden verknüpft.

Bei der Betrachtung von fluoreszierendem Tubulin in Gegenwart von kortikalem Dynein ist klar, dass die Zentrosomen zentral positioniert sind. In Abwesenheit von Dynein hingegen werden die Zentrosomen auf gegenüberliegende Seiten des Tröpfchens geschoben. Dies ist wahrscheinlich auf das Dynein zurückzuführen, das Mikrotubuli-Katastrophen fördert, und auf kortikale Zugkräfte, die zu einer Zentrierung der Astern führen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mikrofluidische Technologien einsetzen können, um spindelartige Strukturen in kugelförmigen Emulsionströpfchen zu erzeugen. Einmal gemeistert, können die Tröpfchenbildung und die Bildgebung in zwei bis drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt werden. Mit diesem Verfahren können weitere Faktoren der Spindelanordnung eingekapselt werden, um deren Einfluss auf die Spindelmorphologie und -positionierung zu untersuchen.

Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen sollten bei der Verwendung von Chloroform oder PDMS immer getroffen werden.