Name: Die Auflösung dynamische Kernpolarisation Besetzung für Echtzeit-enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit Messungen von NMR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Erfahren Sie, wie dynamische Kernpolarisation (DNP) die NMR-Empfindlichkeit für Echtzeit-Messungen enzymatischer Reaktionsgeschwindigkeiten erhöht. Diese Methode ermöglicht die direkte Quantifizierung von Substraten ohne molekulare Veränderung.

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Die Autoren danken Dr. JJ van der Klink für die Unterstützung bei der Auswahl und Montage der Ausrüstung, sowie Dr. F. Kateb und Dr. G. Bertho für nützliche Diskussionen. AC wurde von der Swiss National Science Foundation (Grant PPOOP2_157547) unterstützt. Wir erkennen Finanzierung von Paris Sorbonne Cité (NMR @ Com, DIM Analytics, Ville de Paris, der Fondation de la Recherche Médicale (FRM ING20130526708) und der Parteneriat Hubert Curien Brancusi 32662QK. Unser Team ist Teil Equipex Programme Paris-en-Resonanz und CACSICE.

HINWEIS: Alle Analysedaten wurde kommerzielle Software durchgeführt werden. 1. Bereiten Sie die polarisierende Lösung <ol><li> Bereiten 2 ml einer 1,12 M 13 C-markierten Natriumpyruvat (Na + [CH 3 -CO- 13 COO] -, Substrat) Lösung, dotiert mit 33 mM TEMPOL Radikal (4-Hydroxy-2,2,6,6- tetramethylpiperidin-1-oxyl, Polarisationsmittel) 4 in 2: 1 D 2 O / d 6 ethanol für 13 C-Beobachtungen. ACHTUNG: Vorsichtsmaßnahmen bei der Handhabung muss aufgrund der Entflammbarkeit von d 6 ethanol genommen werden. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Radikalkonzentration im Hinblick auf die erzielten Polarisation optimal ist. <ol><li> Ändern Sie leicht die radikale Konzentration der Lösung im Punkt 1.1 (beispielsweise bis 30 mm oder 35 mm). </li><li> Bestimmen iterativ die Solid-State-Erweiterung (siehe Schritt 3) und finden die radikale Konzentration, die zur maximalen Verbesserung führt. </li></ol></li></ol> 2. PolarizatIon <ol><li> Senken Sie die DNP Kryostat-Temperatur durch das Abkühlungsverfahren. Klicken Sie auf die &quot;Abklingzeit&quot; -Taste auf dem Kryostaten Softwareschnittstelle (2D). </li><li> Sammeln von flüssigem Helium in der DNP Kryostaten durch den Füllvorgang. Klicken Sie auf die &quot;Füllung&quot;, um auf den Kryostaten Softwareschnittstelle (2D). </li><li> Platzieren 300 ul des optimierten Polarisations Lösung aus Schritt 1.1 in den Probenbehälter mit dem DNP Polarisator vorgesehen. Frieren Sie den Probenbehälter mit der Probe im Inneren indem Sie es vorsichtig in einem Bad aus flüssigem Stickstoff getaucht. </li><li> Beseitigen des flüssigen Stickstoffs, die durch Extraktion der Probenbehälter aus dem Bad aus flüssigem Stickstoff und Drehen der Oberseite nach unten nach dem Gefrieren Prozedur (Schritt 2.3) in dem Probenbehälter vorhanden sein können. Hinweis: Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, eine gründliche Lösung der Probe zu erhalten (siehe Schritt 5). </li><li> Legen Sie die Probe in den Kryostaten. Hinweis: Dieses Step, bestehend aus den folgenden Unterschritt muß schnell durchgeführt werden (dh in weniger als 10-20 sec), um die Probe vor dem Schmelzen zu verhindern. <ol><li> Setzen Sie den Probenbehälter in den Probenhalter. Setzen Sie den Probenhalter in der Haupt Kryostaten Einsatz. Legen Sie die Mikrowellen-Wellenleiter in den Probenhalter. </li></ol></li><li> Senken Sie die Kryostat-Temperatur durch Starten des 1 K Kühlverfahren. Klicken Sie auf &quot;1K Kühl&quot; -Taste auf dem Kryostaten Softwareschnittstelle (2D). </li><li> Schalten Sie die Mikrowellenquelle auf und die Probe bestrahlen. Klicken Sie auf &#39;MW-ON &quot;-Taste auf dem Kryostaten Softwareschnittstelle (2D). </li></ol> 3. Festkörper-NMR-Messungen <ol><li> Ziehen Sie das Koaxialkabel des NMR-Konsole Detektionskanal des Spektrometers Spule durch den Stecker gegen den Uhrzeigersinn rotierenden um 90 ° und ziehen es. Stecken das Koaxialkabel des Detektionskanal zu dem Koaxialverbinder des KryostatenNMR-Spule. Setzen Sie den Stecker des NMR-Konsolenkabel in die Buchse des Kryostaten NMR-Spule, die Aufmerksamkeit auf die Ausrichtung Stift zahlen; Drücken Sie, und um 90 ° drehen den Stecker im Uhrzeigersinn. </li><li> Messen Sie die NMR thermische Signal in der Festkörper am Standort Kryostaten eine einfache Puls-acquire Sequenz mit unkalibrierten niedrig Flip-Winkelimpulse wiederholt in einem Intervall von T = 5 min verwenden. Nach der Messung der Einrichtung, in der Befehlszeile der Software &#39;zg&#39; schreiben, und drücken Sie die Tastaturtaste &quot;Enter&quot;. Wenden Sie sich an NMR-Spektrometer Bedienungsanleitung für weitere Einzelheiten über Spektrometer Betrieb und Messaufbau. </li><li> Messen Sie die DNP-verstärkten NMR-Signal. Wiederholen Sie die Schritte von Schritt 3.2 nach dem DNP-Prozess initiiert, wie in Abschnitt 2 beschrieben. </li><li> Trennen Sie das NMR-Konsole Detektionskanal Koaxialkabel aus dem Kryostaten NMR-Spule durch den Stecker gegen den Uhrzeigersinn rotierenden um 90 ° und ziehen es. Stecken Sie das Koaxialkabel des detection Kanal zu dem Koaxialverbinder des Spektrometers Spule. Setzen Sie den Stecker des NMR-Konsolenkabel in die Buchse des Spektrometers Spule, die Aufmerksamkeit auf die Ausrichtung Stift zahlen; Drücken Sie, und um 90 ° drehen den Stecker im Uhrzeigersinn. </li></ol> 4. Optimieren Sie die Homogenität des Hauptmagneten Field ( &quot;Unterlegbleche &#39;) <ol><li> Platzieren in dem Spektrometer ein Röhrchen mit 500 ul Mischung in früheren Experimenten erzeugt (das heißt, nach Schritt 6.2). </li><li> Führen NMR-Spektrometer Shim durch die aktuelle Variation in den Trimm-Gradientenspulen für die maximale suchen &#39;sperren&#39; Signal von Deuterium. Wählen Sie den entsprechenden Trimmspule durch die entsprechende Taste auf der NMR-Konsole schieben. <ol><li> Drehen Sie den Knopf auf der NMR-Konsole, um die Drehrichtung zu bestimmen, die das Sperrsignal erhöht. Weiter drehen, bis das Signal ein Maximum erreicht. Wählen Sie ein anderes Trimmspule und wiederholen Sie die Maximierung unbis ein lokales Maximum für alle Trimmspulen gefunden wird. Wenden Sie sich an NMR-Spektrometer Bedienungsanleitung für weitere Details. Am Ende, entfernen Sie die Probe zur Verriegelung verwendet. </li></ol></li></ol> 5. Die Auflösung <ol><li> Legen 5 ml D 2 O in der Auflösung Einsatz Kessel. Unter Druck setzen und den D 2 O mittels der Widerstandsdraht erwärmt, bis T ≈ 180-200 ° C erreicht wird. Klicken Sie auf das &quot;Vorbereiten Heater&quot; -Taste auf dem Kryostaten Softwareschnittstelle (2D). </li><li> Nach Beendigung der Probenpolarisationsverfahren (beispielsweise nach 3 T DNP), unter Druck der Kryostat etwas über Raumdruck. Klicken Sie auf die &quot;SS-Operations-Taste auf der Kryostat Softwareschnittstelle (2D). Entfernen Sie den Mikrowellenleiter aus der Auflösung Einsatz. </li><li> Gleiten die Auflösung Einsatz (3B) nach unten in den Probenhalter (3A-c). Die Auflösung Einsatz hat den Boden des Probenhalters zu erreichen und fest eine dichte Verbindung mit dem Probenbehälter zu machen, um gedrückt werden müssen D 2 O undicht im Kryostaten zu vermeiden. </li><li> Drücken Sie die Hardware-Trigger (3C-h) die Auflösung Sequenz zu beginnen, eine vorbestimmte Zeitabfolge von pneumatischen Ventilen Operationen. </li></ol> 6. Injection <ol><li> Vor Auflösung Ort ein 5 mm NMR-Röhrchen, das 500 &amp; mgr; l Probe (zB D 2 O für <img alt="Equation13" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" /> Messung in Schritt 7 oder LDH-Lösung aus Schritt 8 zur enzymatischen Aktivitätsmessungen in Schritt 9), in dem Isozentrum des T 11,74 NMR-Spektrometer (siehe Schritt 4). </li><li> Kurz nach der Auflösung (Schritt 5), Mischung 500 ul hyperpolarisierten Lösung mit der in dem NMR-Spektrometer in Schritt 6.1 gesetzt Probe. <ol><li> Manuelle Injektion: sammeln, um die hyperpolarisiertenLösung am Ende einer 2,5 m langen Rohrweiche in einem Becherglas nahe dem NMR-Spektrometer Magnet platziert. Manuell 500 ul hyperpolarisierte Lösung in das Probenröhrchen durch eine maßgeschneiderte Kapillarsystem NMR injizieren. </li><li> Automatische Injektion: vor dem Auflösungsprozess, schließen Sie das Übertragungsrohr auf eine automatisierte maßgeschneiderte Einspritzvorrichtung, die die hyperpolarisierte Lösung aus dem Heliumgas für die Übertragung verwendet trennt. Das Gerät liefert automatisch 500 &amp; mgr; l von hyperpolarisiertem Lösung in das Probenröhrchen. </li></ol></li></ol> 7. Flüssige-NMR-Messung <ol><li> Nach der Auflösung, messen die NMR hyperpolarisierten Signal aus der Probe in das Spektrometer durch eine Reihe von 10 ° Kippwinkel Puls-acquire Sequenzen von 1,5 sec im Abstand des Fortschreitens der Magnetisierung des Substrats (A) und das Produkt (B) zu folgen. Nach der Messung der Einrichtung, in der Befehlszeile der Software &#39;zg&#39; schreiben und drücken Sie die &amp; #39; Enter &#39;Tastaturtaste. Wenden Sie sich an NMR-Spektrometer Bedienungsanleitung für weitere Einzelheiten über Spektrometer Betrieb und Messaufbau. </li><li> Sobald die Magnetisierung vollständig entspannt (dh nach T = 10 T 1), thermisches Signal durch eine Reihe von 90 ° Kippwinkel Pulssequenzen erwerben die NMR messen Abstand von t = 3 T 1 ≈ 3 min. Nach der Messung der Einrichtung, in der Befehlszeile der Software &#39;zg&#39; schreiben, und drücken Sie die Tastaturtaste &quot;Enter&quot;. Wenden Sie sich an NMR-Spektrometer Bedienungsanleitung für weitere Einzelheiten über Spektrometer Betrieb und Messaufbau. </li></ol> 8. Herstellung von Enzym-haltigen Proben (spezifisch für die Pyruvat-to-Lactat-Transformation) <ol><li> Bereiten Sie die Reaktionspuffer mit folgender Rezeptur: 50 mM reduziertes Nicotinamidadenindinucleotid (NADH), 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,1 mM Dithiothreitol (DTT) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH =7.0. </li><li> Bereiten Sie eine Kaninchenmuskel LDH-Lösung 1 U / ml frisch zubereitet in Reaktionspuffer mit 20 ug / ml Rinderserumalbumin, BSA. </li><li> Mischen Sie 478 ul Reaktionspuffer (Schritt 8.1), 20 &amp; mgr; l D 2 O zu ermöglichen Spektrometer Feldstabilisierung ( &quot;Sperr &#39;) und 2 ul LDH-Lösung (Schritt 7.2). </li><li> Legen Sie die 500 ul Lösungsvolumen hergestellt in Schritt 8.3 in ein 5 mm NMR-Röhrchen und setzen Sie den Schlauch in die 500-MHz-NMR-Spektrometer. </li></ol> 9. Vollständige enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit Messverfahren <ol><li> Bereiten Sie die polarisierende Probe (Schritt 1) ​​und polarisieren sie (Schritt 2). </li><li> Führen Sie auf dem Spektrometer Shim (Schritt 4) und bereiten die enzymatische Probe (Schritt 8). </li><li> Führen die Auflösung (Schritt 5) und der Injektion (Schritt 6). </li><li> Messen einer Reihe von Signalen von der hyperpolarisierten Probe mit 10 ° Kippwinkel Impulse Nahmen Abstand von 1,5 s (Schritt 7). Dieser Schritt ermöglicht das hyperpolarisierte MessSignalabfall und das Signal Anhäufung von Stoffwechselprodukten. </li></ol> 10. Fitting <ol><li> Für jedes Spektrum in Schritt erworben 9.4, identifizieren die Spitzen entsprechend Substrat (A) und Produkt (B) bzw. und integrieren sie (Bestimmung der Fläche der Peaks). Die Spitzen Integrale geben die Kurssignale Magnetisierungszeit (M (A, B) (t), siehe Gleichung 2). </li><li> Unter Verwendung der Lösung der Gleichung (2) bestimmen den Wert F = (R + A k eff ) Aus einem einfachen exponentiellen Anpassung der in Schritt 10.1 integriert Substrat Signals. </li><li> Mit dem Wert F = (R A + k eff ) Bestimmt in Schritt 10.2, k eff und R B aus einer Anpassung des Produktsignals M B (t) mit der Funktion bestimmen, durch die Integration der Gleichung (2) erhalten. Wenden Sie sich an repräsentativen Ergebnisse Abschnitt (Enzymatic Aktivität und Stoffwechselmessungen) für Details auf die Reaktion Modellierung, Anpassung und HF-Korrektur. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben

Die kritischen Punkte der Auflösung DNP-NMR-Experiment sind: (i) das Niveau der Polarisation für das Substrat erreicht, das die niedrigste Produktkonzentration, die für Experimente sowie die Anzahl der Signalnahmen bestimmt, die durchgeführt werden können, und (ii) die Lebensdauern der Magnetisierung auf die Dauer der Übertragung zwischen der Polarisation und der Detektionsorte und auf die Geschwindigkeit der Substrat Transformation verglichen. Das Einspritzsystem der DNP-Setup Auflösung hierin ermöglicht in weniger als...

Dynamische Kernpolarisation (DNP), 1,2 eine Technik entwickelt, um die Kernspinpolarisation zu erhöhen, das heißt, das Ungleichgewicht zwischen &quot;oben&quot; und &quot;unten&quot; Spinpopulationen (P = [N ↑ - N ↓] / [N ↑ + N ↓]), wurde zum ersten Mal in den 1950er Jahren eingeführt. Kernspins wie 13 C bis zu P = 10 -1 unter günstigen Bedingungen polarisiert werden, typischerweise bei einer Temperatur in der Größenordnung von 1 K und in einem Magnetfeld von 3,357 T. 3,4 ein Durchbruch für biologische Anwendungen kamen in der frühen 2000er Jahren mit der Entwicklung von Lösungs DNP, die bei der Auflösung von gefrorenen polarisierten Proben in überhitztem Wasser besteht, während die hohe Kernpolarisation Ebene bei niedriger Temperatur erhalten Halte. 5 die Flüssigkeit-NMR-Signal um einen Faktor 10 3 -10 4 verstärkt wird im Vergleich zu verbreitetRT NMR Bedingungen thermisch polarisiert. Dissolution DNP ist daher ein Weg, um nicht-invasiv messen biochemischen Reaktionsgeschwindigkeiten in situ in Echtzeit, so dass die Überwachung Dynamik durch NMR mit einer zeitlichen Auflösung von 1 s oder weniger. 6 - 10 wurde es möglich, auch sehr geringe Konzentrationen von Analyten in erkennen 11. Unter den nicht-invasive Bildgebungsverfahren Molekül ist hyperpolarisierten NMR die einzige Technik, die ein Substrat und seine Stoffwechselprodukte in Echtzeit gleichzeitige Messung ermöglicht. Dissolution DNP mit Enthusiasmus in verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen empfangen wurde im Bereich von in vitro NMR zu klinischen MRI 12 und den vielversprechendsten Anwendungen der in situ verbunden sind Überwachung des Stoffwechsels. 13,14 Die Hauptbegrenzung der Auflösung DNP ist, dass nach einer Zeit auf die Reihenfolge der fünffachen Längs Relaxationszeitkonstante T 1, das polare verbesserterung verloren. Kernspins Lager ausstellenden relativ lange T 1 ist es daher notwendig, Moleküle zu verwenden. Um die Zeitspanne des Polarisationsverstärkung erstrecken, langsam entspannende Kernspinzuständen, bekannt als langlebige Zustände (LLS), verwendet werden. 15 - 17 LLS sind unempfindlich gegenüber der intra-Paar Dipol-Dipol-Wechselwirkung, so dass ihre charakteristische Relaxationszeit, T LLS kann als T 1 viel länger sein. 18 eine Magnetisierungs Lebensdauer von zehn Minuten bis zu 1 Stunde daher erhalten werden konnte, 19,20 und LLS wurden sowohl für magnetische Resonanzspektroskopie (MRS) vorgeschlagenen und MRT. 21 Die wichtigsten Punkte, die für das Studium enzymatische Reaktionsgeschwindigkeiten von hyperpolarisierten NMR sind sorgfältig optimiert werden müssen: (i) maximieren die Solid-State-Polarisation und (ii) die Polarisationsverlust während der Übertragung des hyperpolarisierten Lösung aus der minimierenPolarisator zur NMR-Spektrometer. Dieser Artikel beschreibt die Anpassung eines maßgeschneiderten Auflösung DNP Gerät und Einspritzsystem enzymatischen Reaktionen zu untersuchen. Die Eigenschaften und die Leistung der Einrichtung wird mit der bekannten und weit verbreiteten hyperpolarisiertem Substrat [1- 13 C] Pyruvat nachgewiesen werden. Die Hauptgründe für diese Entscheidung sind erstens seine natürlich lange 13 C longitudinale Relaxationszeit (T 1&gt; 50 sec bei hohen Magnetfeldern und Temperaturen über 293 K), die Überwachung Reaktionen während mehrerer Minuten erlaubt, und zweitens, ihre zentrale Rolle in Krebsstoffwechsel. 13,14 mit Auflösung DNP-NMR und eine kundenspezifisch entwickelte Einspritzsystem, um die Oxidation von Pyruvat durch Laktat-Dehydrogenase (LDH) katalysiert wird, kann in Gegenwart eines anfänglichen Pool von unmarkierten Laktat 9,22 oder ohne unmarkierte Laktat überwacht werden hinzugefügt , wie hier gezeigt. Es hat sich gezeigt, dass die [1- 13 C] Laktat Signal in vi gemessenvo (einschließlich in Zellen) nach der Injektion von hyperpolarisiertem [1- 13 C] Pyruvat ist vor allem auf eine schnelle Etikettenaustausch zwischen Pyruvat und Lactat anstatt Laktatproduktion. 6 Wir präsentieren hier die Echtzeit-Produktion von [1- 13 C] Laktat von hyperpolarisierten [1- 13 C] Pyruvat in einem NMR-Röhrchen eingespritzt LDH, jedoch zunächst ohne Laktat. Systembeschreibung Es gibt zwei Hauptteile in einem Löse DNP setup (Abbildung 1): Die DNP Polarisator und dem NMR-Spektrometer. Das Hauptelement des DNP Polarisator ist ein Kryostat die Probe um 1 K in einem Pump Heliumbad zu kühlen. Der Kryostat ist in einem 3,35 T supraleitenden Magneten eingesetzt und hat eine Geometrie, die die Polarisations Probe im Isozentrum des Magneten (1) zu haben, sicherstellt. Im Innern des Kryostaten wird die Probe (a) durch eine NMR-Spule (b), umgeben die Polarisation b zu messenuildup, enthalten in einer übermodierten Mikrowellenkavität (c). Die gesamte Probe wird bei niedriger Temperatur in einem Pump Heliumbad (d) und Bestrahlung mit Mikrowellen durch den Wellenleiter gehalten wird. Das gesamte System wird durch maßgeschneiderte Software (2D) verwaltet. Die Hardware und die Tieftemperatur-Ausrüstung benötigt DNP und die anschließende Auflösung durchzuführen, sind nach wie vor eine technologische Herausforderung. Eine neue DNP Kryostaten 23,24 wurde entwickelt und getestet, um seine Tieftemperatur Leistungen zu bestimmen und dann für eine schnelle Abkühlung, Helium Haltezeit und insgesamt noch geringen Heliumverbrauch im Betrieb optimiert. Der Kryostat besteht aus zwei Teilen. Der erste Teil des Kryostaten ist die Isolierung Dewar (2A), die in etwa in Oberteil getrennt werden kann (a) der Schwanz oder Probenraum (b), und die äußere Vakuumkammer (OVC) im Hochvakuum und Gehäuse gehalten dem Strahlungsschirme (c). Der zweite Teil des Kryostaten ist der Haupt insert (2B), in die Isolierung Dewar platziert, wo alle Wasserregelung gesteuert werden. Das flüssige Helium aus der externen Speicher Dewar durch die Leitung übertragen sind (a), in der ersten Stufe in den Separator (B) kondensiert ist, verwendet eine Zwischenkammer sowohl den oberen Teil des Kryostaten kalt zu halten und die Helium verdampft zu entfernen bei der Übergabe. Der Separator Druck wird um den oberen Teil des Kryostaten gewickelt abgesenkt durch Pumpen durch eine Kapillare (c); der Fluss des kalten Helium in dieser Kapillare werden die Leitbleche (d) und der Strahlungsschirme in der Isolations Dewar (OVC) abkühlen. Die Probe wird angeordnet und polarisiert in den Probenraum. Der Probenraum ist mit dem Separator durch eine andere Kapillare (e) verbunden ist, um den Schwanz des Haupt Kryostaten Einsatz gewickelt. Diese Kapillare kann durch ein Nadelventil manuell von außen betätigt geöffnet oder geschlossen werden. die niedrige Temperatur während der DNP pr verwendet zu erreichenocess muss flüssiges Helium in den Kryostaten Probenraum gesammelt werden und der Druck auf den mbar Bereich abgesenkt. Die Operationen für Kryostaten Betrieb notwendig sind über einen ziemlich komplexen Pumpensystems mit drei Sätzen von Pumpen durchgeführt, überwacht und in verschiedenen Punkten mit elektronischen und elektromechanischen Instrumente (2C) betrieben. Der Kryostat OVC muss durch den ersten Pumpsystem zu Hochvakuum gepumpt werden. Dieses System besteht aus einer Turbomolekularpumpe bestehend aus einer Kreiselpumpe (a) gesichert. Das flüssige Helium wird von der Speicher Dewar (b) durch die Transferleitung Kryostaten Einlass zu dem Kryostaten Separator überführt. Der Separator hat einen Zugang zum zweiten Pumpenaggregat angeschlossen. Dieses Set besteht aus einer Pumpe 35 m 3 / h Membran besteht (c). Diese Linie ermöglicht das Entfernen der Heliumgas während der Übertragung aus dem Dewar und bei Trennkühlung gekocht. Das flüssige Helium im Abscheider kann dann an den Probenraum durch die Kappe übertragen werdenIllary Rohre oben beschrieben. Zur Übertragung von flüssigem Helium aus dem Abscheider in den Raum Probe und anschließend auf niedrigere Probenraum Druck auf mbar Bereich, ein System dritte Pump bestehend aus einem 250 m 3 / h Rootspumpe durch eine 65 m 3 / h Kreiselpumpe (d) gesichert ist mit dem Kryostaten durch eine manuelle Drosselventil (e). Alle Vakuumsystemoperationen gesteuert und geregelt durch eine elektropneumatische Sonderanfertigung (f). Dieses Gerät steuert Vakuumleitungsverbindungen zwischen dem Kryostaten Separator (g) und Probenraum (h) Verkaufsstellen, die zweite / dritte Pumpsysteme (c, d), eine komprimierte Heliumflasche (i) und der Außenseite. Die Kommunikation zwischen (f) und der Außenseite durchläuft ein Einwegventil (j). Der elektro-pneumatische Einrichtung (f) sowie alle Systemparameter und die Auflösung Hardware sind durch eine maßgeschneiderte elektronische Gerät angeschlossen USB mit einem handelsüblichen PC gesteuert und betrieben. Schließlich alle das System, durch das elektronischeGerät wird durch maßgeschneiderte Standalone-Software (2D) verwaltet gegebenenfalls Operationen über eine Schnittstelle ins Leben gerufen werden Software-Tasten. Um die Probe zu verwalten und zu messen NMR-Signal Aufbau im Festkörper eine Reihe von Einsätzen verwendet werden (3A). Um den Kryostaten für Polarisation vorzubereiten, legen Sie die Hauptprobeneinsatz (a), in den Kryostaten. Der Hauptprobeneinsatz im Inneren eines übermodierten vergoldet Mikrowellenhohlraum gegeben, der mit einem NMR-Spule (b) zur Verfügung gestellt. Vor dem Einfrieren der Substratlösung, die in einem geeigneten Probenbehälter bei Temperatur von flüssigem Stickstoff polarisiert (Polarisations Lösung) zu werden, und es am Ende Unterseite des Glasfaserprobenhalter (c) platzieren. Schieben Sie den Probenhalter in die Hauptprobeneinsatz zu den Magneten Isozentrum erreichen. Legen Sie die vergoldet Wellenleiter (d) in den Probenhalter. Der Wellenleiter kann der Mikrowelle von einer externen Mikrowellenquelle erzeugt mit minimalen Verlusten t zu reiseno die Probe. Maßgeschneiderte Software für Kryostaten Management kümmert sich automatisch um, nach dem Klicken auf die entsprechende Schnittstelle Taste, verschiedene Operationen wie Abklingzeit (der Kryostat Temperatur Temperatur von flüssigem Helium nahe gesenkt wird), Füllung (der Kryostat mit flüssigem Helium auf einen vorbestimmten Pegel gefüllt ist ) ein zusätzlicher Schritt zu T 1 ≈ K (das flüssige Heliumbad gepumpt der Kühlung zu erreichen ist die niedrigste Temperatur möglich), Unterdrucksetzen (der Kryostat etwas über Raumdruck bei unter Druck P = 10-30 mbar Kryostaten Öffnung ohne Risiken zu ermöglichen, der Verschmutzung des Kryostaten durch die Luft) und Auflösung (automatisches Verfahren die DNP Probe und gibt das resultierende hyperpolarisierten Lösung Meßort, das heißt die NMR-Spektrometer) aufzulösen. Die Polarisation wird durchgeführt, bei 94 GHz, die Probe mit Mikrowellen bestrahlt wird (in einem Polarisationsfeld B 0 </sub&gt; = 3,35 T). Eine Patientenprobe gilt als vollständig polarisiert nach 3 T DNP, wobei T DNP ist die Polarisation Aufbauzeit. T DNP der gleichen Größenordnung ist als die longitudinale Relaxationszeit der Zielkerne im festen Zustand bei dem betreffenden Bereich und Temperatur. In allen Experimenten wurde die Probe für mehr als 5 T DNP polarisiert. Am Ende der Polarisationszeit muss die Probe in einer RT-Lösung, um aufgelöst zu werden, um für die Messung der Enzymaktivität verwendet werden. Während des Auflösungsprozesses, 5 ml von überhitztem D 2 O aus dem Kessel der Auflösung Einsatz (3B) durch komprimierte Heliumgas geschoben (P = 6-8 bar), um die DNP-verstärkten Probe zu erreichen und es aufzulösen. Das resultierende hyperpolarisierten Lösung wird die Auflösung Einsatz durch die komprimierte Heliumgas ausgestoßen, durch die Auflösung Einsatz Steckdose (3C-b </strong&gt;), einem 2 mm Innendurchmesser Teflon Rohrweiche. Die Zeit für den Auflösevorgang benötigt wird, ist 300 msec. 23 die Zeit für den Probentransfer von der benötigten DNP Polarisator zum Aufstellungsort NMR Spektrometer beträgt etwa 3 sec. Der Lösevorgang wird durchgeführt, eine Auflösungs Einsatz (3B) verwenden. Die Auflösung Einsatz besteht aus einem elektronischen pneumatischen Baugruppe (a) eine Kohlenstofffaser-Stick (b) Verbindungsrohre zwischen dem Kessel in die pneumatische Anordnung und dem Probenbehälter Schließfach (c) enthält, die mit der Probe dichte Kopplung ermöglicht out zum Auslass Behälter und zurück. Die elektropneumatischen Baugruppe (3C) verwendet überhitzten D 2 O durch die Kohlefaserstab zu dem Probenbehälter zu erzeugen und fahren und dann die hyperpolarisierte Lösung aus dem Kryostaten zu extrahieren. Der elektropneumatische Baugruppe wird von Pneumatikventilen (a) zusammengesetzt, die die Verbindungen zwischen der CO-Regelungmpressed Helium (P = 6-8 bar) Linie (b), der Kessel (c), wo die D 2 O durch das Ventil (d) eingespritzt wird, und der Ausgang (e) durch die Kohlenstofffaser-Stick (f). Das System wird durch einen Druck G, einem Thermometer und einem Wärmewiderstandsdraht in dem Kessel (c), einem Abzug (h) und einem Anschlusskasten (i) verwendet, um eine Schnittstelle, das System mit dem elektronischen Verwaltungsvorrichtung abgeschlossen. Die DNP Kryostaten und das NMR-Spektrometer sind durch eine Transferleitung, dh eine PTFE-Röhre von 2 mm Innendurchmesser innerhalb dessen das hyperpolarisierte Lösung durch unter Druck stehende Helium (P = 6-8 bar) gedrückt wird verbunden, wenn die Auflösung ausgelöst wird. Die Auflösung Sequenz besteht aus den folgenden Operationen besteht: in den ersten 300 ms, überhitztem D 2 O wird zu dem Probenbehälter geschoben, um das hyperpolarisierte gefrorenen Lösung zu schmelzen und aufzulösen. Danach wird das hyperpolarisierte Lösung aus dem Kryostaten durch Mittel der pres extrahiertensurized (P = 6-8 bar) Heliumgas und schob durch die 2 mm Innendurchmesser PTFE-Schlauch (3C-E) an die Messstelle an der Injektionsstelle mit einem der Verfahren beschrieben in Schritt durchgeführt wird, 6.2.1 oder 6.2 Schritt 0,2. Die zweite Komponente des Lösungs DNP-NMR-Einrichtung ist das NMR-Spektrometer. Im Setup hier beschrieben ist, arbeitet der NMR-Spektrometer bei einer Feld B 0 = 11,7 Tesla. Ein 5 mm NMR-Sonde wird verwendet, um das hyperpolarisierte Signal nach der Auflösung zu messen. Die NMR-Spektrometers wird durch die NMR-Konsole bedient, für verwendet, um sowohl Festkörper- und Flüssig-NMR-Messungen und die Firma bereitgestellte Software xwinnmr. Eine typische Messung eines niedrigen Kippwinkel harten Puls besteht (entweder kalibriert, für liquidstate oder unkalibrierten, für Solid-State-Messungen) durch Signalübernahmen verfolgt. Messungen des Festkörperwärmepolarisationssignal und DNP-derived signal Aufbau werden unter Verwendung des maßgeschneiderten durchgeführt 13 C-Spule an der Stelle des DNP Polarisator (Abbildung 3Ab), die mit der NMR-Spektrometer. In dieser besonderen Situation führen die NMR-Spektrometer Signal Verriegelungs nicht. Wenn Festkörper-Messungen durchgeführt werden, um zu verhindern signifikante Störungen der Polarisation, sollte die Zeitverzögerung zwischen Akquisitionen lang genug sein, etwa mehr als 0,5 T DNP. Die Solid-State-Erweiterung ist definiert als <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation4.jpg" width="100" /> woher <img alt="Equation5" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation5.jpg" width="31" /> wird das hyperpolarisierte Signal (in Schritt 3.3 erhalten) und <img alt="Equation6" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation6.jpg" width="23" /> ist die Festkörpersignal (4A) (im thermischen Gleichgewicht bei gepumpt Temperatur von flüssigem Helium in Schritt 3.2 erhalten). Dieser Parameter ddefiniert den maximalen Polarisation für NMR-Experimente zur Verfügung, vor unvermeidlichen Verluste während der Übertragung des hyperpolarisierten Lösung. Die Messung wird mit einem einfachen Puls-acquire Reihenfolge ausgeführt, um eine nicht-abgeglichenen geringen Kippwinkel Puls verwenden. Pulse Kalibrierung wird für Festkörpermessungen häufig übersprungen. Eine analoge Vorgehensweise kann das hyperpolarisierte Signalverstärkung in den flüssigen Zustand zu bestimmen. In diesem Fall wird die in dem Spektrometerrohr platziert Probe vor der Injektion (Schritt 6.2) besteht aus 500 &amp; mgr; l von D 2 O. Nach dem Auflösen und Injektion, gibt es zwei wichtige Parameter zu überwachen. Das erste ist das hyperpolarisierte Enhancement im NMR-Spektrometer Ort, <img alt="Equation7" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation7.jpg" width="95" /> (4B), wobei <img alt="Equation8" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation8.jpg" width="30" /> ist das Signal direkt nach dem Einspritzen des hyper<html> polarisiert Lösung (erhalten in Schritt 7.1) und <img alt="Equation9" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation9.jpg" width="20" /> ist die thermische Polarisationssignal (im Schritt 7.2 erhalten). Die zweite ist die longitudinale Relaxationszeit, T 1 (4B, Einschub), verbunden mit dem Substrat und jede Stoffwechselprodukt (erhalten durch exponentielle Anpassung Signale, erhalten in Schritt 7.1). Diese beiden Parameter definieren die minimale Substratkonzentration erforderlich, um eine ausreichende Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) und der verfügbaren Zeitfenster zur Messung der metabolischen Umwandlungen zu erhalten. Das Verhältnis zwischen Festkörper Polarisation <img alt="Equation10" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation10.jpg" width="30" /> und liquidstate Polarisation <img alt="Equation11" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation11.jpg" width="29" /> gibt bei der hyperpolarisierten Lösung Übertragung einer Schätzung der Polarisationsverluste aufgrund Entspannung. Ein Wertation12 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg &quot;width =&quot; 80 &quot;/&gt; sollten in Abwesenheit der Entspannung Verluste beobachtet werden.

<table><tbody><tr><td>DNP-Polarisator</td><td>Vanderklink s.a.r.l (Schweiz)</td><td></td><td>Kryostat und elektronische Ausrüstung für die Polarisation von Proben</td></tr><tr><td>Komponenten für das Vakuumsystem</td><td>Edwards vacuum (Frankreich)</td><td>Verschiedene</td><td> - Turbomolekularpumpen-Setup - Membranpumpen-Setup - Hochleistungs-Roots-Pumpsystem - Vakuumarmaturen und -komponenten </td></tr><tr><td>DNP 3.35T Magnet</td><td>Bruker (Frankreich)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 MHz NMR-Spektrometer</td><td>Bruker (Frankreich)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 8.0</td><td>OriginLab (US)</td><td></td><td>Datenanalyse-Software</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C</td><td>Sigma Aldrich (France)</td><td>490709</td><td></td></tr><tr><td>ETHANOL-D6, WASSERFREI, 99,5 ATOM % D</td><td>Sigma Aldrich (Frankreich)186414</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 4-Hydroxy-TEMPO 97%</td><td>Sigma Aldrich (Frankreich)</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>Deuteriumoxid</td><td>Sigma Aldrich (Frankreich)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>reduziertes Nicotinamidadenindinukleotid (NADH)</td><td>Sigma Aldrich (Frankreich)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethylen-Diamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich (Frankreich)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich (Frankreich)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer, pH&nbsp;=&nbsp; 7.0</td><td>Sigma Aldrich (Frankreich)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LDH-Enzym in&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich (Frankreich)</td><td>L-2500</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin, BSA</td><td>Sigma Aldrich (Frankreich)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

die auflösung dynamische kernpolarisation besetzung für echtzeit-enzymatische reaktionsgeschwindigkeit messungen von nmr

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

Die wichtigste Einschränkung der NMR-basierten Untersuchungen ist niedriger Empfindlichkeit. Dies fordert für lange Aufnahmezeiten, also in Echtzeit NMR-Messungen von Stoffwechselumwandlungen zu verhindern. Hyperpolarisation über Auflösung DNP umgeht Teil der Empfindlichkeit gibt dank der großen Out-of-Gleichgewicht Kernmagnetisierungs aus dem Assoziierungsabkommen Elektron-zu-Kern-Spin Polarisationstransfer. Die hohe NMR-Signal erhalten werden, können chemische Reaktionen in Echtzeit zu überwachen. Die Kehrseite der hyperpolarisierten NMR liegt in der begrenzten Zeitfenster für die Signalerfassung, die in der Regel in Längsrichtung in der Größenordnung des Kernspins ist Relaxationszeit, T 1, oder, in günstigen Fällen in der Größenordnung des konstanten Relaxationszeit im Zusammenhang mit der Singulett-Zustand gekoppelt Kerne, T LLS. Die zelluläre Aufnahme von körpereigenen Molekülen und Stoffwechselraten können wichtige Informationen auf die Tumorentwicklung und Drogen Antwort liefern. Numerous vorherigen hyperpolarisierten NMR-Untersuchungen haben zur Überwachung der enzymatischen Aktivität in vivo die Relevanz von Pyruvat als metabolisches Substrat demonstriert. Diese Arbeit enthält eine detaillierte Beschreibung des experimentellen Aufbaus und Verfahren zur Untersuchung von enzymatischen Reaktionen erforderlich, um insbesondere die Pyruvat zu Lactat Umwandlungsrate in Gegenwart von Lactatdehydrogenase (LDH), die von hyperpolarisierten NMR.

NMR-Signal gewinnt Auflösung DNP mit Die DNP-Effekt besteht in der Übertragung des hohen Polarisation der ungepaarten Elektronenspins, typischerweise von stabilen Radikale Moleküle, NMR-aktiven Kernen, unter Mikrowellenbestrahlung der Probe. Die am häufigsten verwendeten freien Radikale sind TAM (OXO63) und TEMPOL. 4 Polarisationsverfahren TEMPOL Verwendung kann durch &quot;Kreuzpolarisation&quot; optimiert werden. 25 <p class="jove_content" fo:keep-toget...

Die Empfindlichkeitssteigerung durch die auflösungsdynamische Kernpolarisation (DNP) ermöglicht es, Stoffwechselprozesse in Echtzeit mittels NMR und MRT zu verfolgen. Die Eigenschaften und Leistungen eines dedizierten Dissolution-DNP-Setups, das für die Untersuchung enzymatischer Reaktionen entwickelt wurde, werden diskutiert.

Die Auflösung dynamische Kernpolarisation Besetzung für Echtzeit-enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit Messungen von NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, enzymatische Prozesse in Echtzeit mittels kernmagnetischer Resonanz, die durch dynamische nukleare Polarisation verstärkt wird, zu verfolgen. Die in der Flüssigphase durch dynamische nukleare Polarisation (DNP) verstärkte Magnetresonanz kann dabei helfen, zentrale Fragen zu beantworten: beispielsweise, wie die Reaktionsgeschwindigkeiten enzymatischer Umwandlungen eines Molekülpaars in Zellen oder in vivo bestimmt werden können, ohne diesen Molekülkomplex auf irgendeine Weise verändern zu müssen. Die Installation unserer DNP-Auflösungsanlage in unserem Labor sowie die Ankunft von Dr. Riccardo Balzan, einem Doktoranden aus dem Labor von Arnaud Comment in Lausanne, stellt einen großen Fortschritt für unsere Forschung dar.DNP erhöht signifikant die Empfindlichkeit der Experimente, die wir an unseren 500-Megahertz-NMR-Spektrometern durchführen können. Diese DNP-Ausrüstung war die erste, die in Frankreich installiert wurde, und ich möchte betonen, dass alle Mitglieder unseres NMR-Teams an der Inbetriebnahme dieser Ausrüstung beteiligt waren; insbesondere möchte ich Gildas Bertho, unseren Forschungsingenieur, und Fatiha Kateb, unsere Maître de conférences, erwähnen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine direkte, Echtzeit-Quantifizierung des Substrats und seiner endogenen Derivate mit einer Zeitauflösung von Sekunden ermöglicht.Für die Polarisationlösung bereiten Sie zwei Milliliter einer 1,12-molaren, mit Kohlenstoff-13 markierten Natriumpyruvatlösung vor, die mit 33 Millimolar TEMPO-Radikal in einem Volumenverhältnis von zwei zu eins aus deuteriertem Wasser zu deuteriertem Ethanol für Kohlenstoff-13-Beobachtungen dotiert ist. Senken Sie die Temperatur des dynamischen nuklearen Polarisation (DNP)-Kryostaten durch den Abkühlvorgang, indem Sie im Softwareinterface des Kryostaten die Abkühl-Schaltfläche anklicken. Sammeln Sie flüssiges Helium im DNP-Kryostaten über das Befüllverfahren. Klicken Sie auf die Fülltaste in der Software-Schnittstelle des Kryostaten. Geben Sie anschließend 300 µL der optimierten Polarisationsslösung in den mit dem DNP-Polarisator bereitgestellten Probenbehälter. Gefrieren Sie den Probenbehälter mit der Probe, indem Sie ihn vorsichtig in ein flüssiges Stickstoffbad eintauchen.Entfernen Sie den flüssigen Stickstoff, der nach dem Einfrieren möglicherweise im Probenbehälter vorhanden ist, indem Sie den Probenbehälter aus dem flüssigen Stickstoffbad entnehmen und ihn kopfüber drehen. Danach führen Sie die Probe in das Kryostat ein, indem Sie zuerst den Probenbehälter in den Probenh alter einsetzen. Anschließend platzieren Sie den Probenh alter in den Haupteinsatz des Kryostats, bevor Sie die Mikrowellen-Wellenleiter in den Probenh alter einsetzen.Senken Sie die Kryostattemperatur, indem Sie das Abkühlverfahren auf ein Kelvin starten. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Abkühlung auf ein Kelvin“ in der Software-Schnittstelle des Kryostaten. Schalten Sie die Mikrowellenquelle ein und bestrahlen Sie die Probe, indem Sie in der Software-Schnittstelle des Kryostaten auf die Schaltfläche „Mikrowellen einschalten“ klicken.Trennen Sie das Koaxialkabel des NMR-Konsolendetektionskanals von der Spektrometer-Spule, indem Sie den Stecker um 90 Grad gegen den Uhrzeigersinn drehen und herausziehen. Schließen Sie das Koaxialkabel des Detektionskanals an den Koaxialanschluss der NMR-Spule des Kryostaten an. Stecken Sie dann den männlichen Stecker des Kabels der NMR-Konsole in den weiblichen Anschluss der NMR-Spule des Kryostaten, wobei Sie auf den Orientierungsstift achten müssen.Drücken Sie fest und drehen Sie den Verbinder um 90 Grad im Uhrzeigersinn. Messen Sie das NMR-Thermalsignal im festen Zustand am Kryostatort mithilfe einer einfachen Puls-Akquisitions-Sequenz mit nicht kalibrierten, kleinen Kippwinkelpulsen, die in einem Intervall von t gleich fünf Minuten wiederholt werden. Schreiben Sie nach dem Einrichten der Messung „zg“ in die Befehlszeile der Software und drücken Sie die Eingabetaste auf der Tastatur.Nachdem der Polarisationsvorgang eingeleitet wurde, messen Sie das DNP-verstärkte NMR-Signal im festen Zustand mit der gleichen Methode und unter denselben Bedingungen wie bei der Messung des thermischen Signals. Trennen Sie das Koaxialkabel des NMR-Konsoles-Detektionskanals von der NMR-Spule des Kryostaten, indem Sie den Stecker um 90 Grad gegen den Uhrzeigersinn drehen und herausziehen. Anschließend stecken Sie das Koaxialkabel des Detektionskanals in den Koaxialanschluss der Spektrometer-Spule.Stecken Sie den männlichen Stecker des NMR-Konsolenkabels in den weiblichen Stecker der Spektrometer-Spule, wobei Sie auf den Orientierungsstift achten müssen. Drücken Sie fest und drehen Sie den Stecker um 90 Grad im Uhrzeigersinn. Bereiten Sie frisch eine Kaninchenmuskel-LDH-Lösung mit einer Einheit pro Milliliter in Reaktionspuffer mit 20 Mikrogramm pro Milliliter Rinderserumalbumin vor.Mischen Sie anschließend 478 Mikroliter Reaktionspuffer, 2 Mikroliter LDH-Lösung und 20 Mikroliter Deuteriumoxid, um die Feldstabilisierung oder Verriegelung des Spektrometers zu ermöglichen. Geben Sie dann das 500-Mikroliter-Lösungsvolumen in eine 5-Millimeter-NMR-Röhre. Verbinden Sie die Transferleitung mit einer automatisierten, speziell angefertigten Injektionsvorrichtung, die die hyperpolarisierte Lösung vom zum Transfer verwendeten Heliumgas trennt.Das Gerät gibt automatisch 500 Mikroliter hyperpolarisierte Lösung in das Probenröhrchen ab. Vor der Auflösung bringen Sie das Fünf-Millimeter-NMR-Röhrchen, das 500 Mikroliter Probe enthält, in den Isocenter des 11,74-Tesla-NMR-Spektrometers ein. Füllen Sie 5 Milliliter Deuteriumoxid in den Kessel des Auflösungseinsatzes ein.Drücken Sie und erhitzen Sie das deuterierte Wasser mithilfe des Widerstandsdrahts, bis durch Anklicken der Schaltfläche „Heizung vorbereiten“ in der Software-Schnittstelle des Kryostaten eine Temperatur von etwa 180 bis 200 Grad Celsius erreicht ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche „SS-Betrieb“ in der Software-Schnittstelle des Kryostaten. Entfernen Sie anschließend die Mikrowellenleitung aus dem Auflösungseinsatz.Schieben Sie den Auflösungseinsatz in den Probenhalter hinab. Der Auflösungseinsatz muss den Boden des Probenhalters erreichen und fest gedrückt werden, um eine dichte Verbindung mit dem Probenbehälter herzustellen und ein Austreten von deuteriertem Wasser in das Kryostat zu vermeiden. Drücken Sie den Hardware-Trigger, um die Auflösungssequenz zu starten, eine vorbestimmte zeitgesteuerte Abfolge von pneumatischen Ventilbetätigungen.Kurz nach der Auflösung mischt das Injektionsgerät 500 Mikroliter hyperpolarisierte Lösung mit der Probe, die im NMR-Spektrometer platziert ist. Nach der Auflösung messen Sie das hyperpolarisierte NMR-Signal der Probe im Spektrometer mittels einer Serie von 10-Grad-Flip-Winkel-Puls-Akquisitionssequenzen, die im Abstand von 1,5 Sekunden durchgeführt werden, um den Verlauf der Magnetisierung von Substrat und Produkt zu verfolgen. Nachdem die Messung eingerichtet wurde, geben Sie „zg“ in der Befehlszeile der Software ein und drücken die Eingabetaste.Wenn die Magnetisierung vollständig relaxiert ist, messen Sie das NMR-Thermalsignal durch eine Serie von 90-Grad-Kippwinkelpuls-Aquirier-Sequenzen, die etwa drei Minuten auseinanderliegen und etwa 3T1 entsprechen. Nachdem die Messung eingerichtet wurde, geben Sie „zg“ in der Befehlszeile der Software ein und drücken Sie die Eingabetaste. Hier zeigt der zeitliche Verlauf der Spektren, die aus wiederholten 10-Grad-Kippwinkelpulsen erhalten wurden, die Empfindlichkeit und zeitliche Auflösung der Methode.Nach der Identifizierung der Signale für das Pyruvat-Substrat und das Lactat-Produkt erfolgt die Quantifizierung durch Signalintegration der Metaboliten. Die enzymatische Aktivität wird aus dem zeitlichen Verlauf des Produktsignals durch Anpassung an ein lineares Modell bestimmt. Zur Validierung der Messung wird dieselbe Größe anhand der Anfangsreaktionsgeschwindigkeit aus dem Verhältnis der Signale von Produkt und Substrat ermittelt.Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann die vollständige Bestimmung der enzymatischen Aktivität in etwa zwei Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie verstehen, wie man ein hochpolarisiertes Substrat für die NMR erzeugt, es in eine Lösung, die ein Enzym enthält, injiziert und die enzymatische Aktivität mittels DNP-verstärkter NMR verfolgt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die enzymatische Lösung sorgfältig mit frischem Enzym und Cofaktoren vorzubereiten und sicherzustellen, dass keine Luftblasen im Probenröhrchen vorhanden sind.Mit der Entwicklung der DNP-gestützten Magnetresonanz in der Flüssigphase können Forscher nun die Substrataufnahme und deren enzymatische Umwandlung in verschiedenen Zelltypen untersuchen, indem sie die Produktbildungsrate messen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit kryogenen Geräten und starken Magnetfeldern äußerst gefährlich sein kann. Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung gegen Kryogene und die Überprüfung des Fehlens magnetischer Gegenstände sollten stets beachtet werden, wenn diese Messungen durchgeführt werden.Im Gegensatz zur klassischen NMR ist die NMR auf Basis von Auflösungs-DNP auf ein experimentelles Zeitfenster von maximal wenigen Minuten begrenzt, abhängig vom Substrat und dem aktuellen Zustand des Lebens. Dies steht einer Erweiterung über die eindimensionale Spektroskopie hinaus entgegen. Die Auflösungs-DNP-NMR muss weiterentwickelt werden, um die Vielseitigkeit der klassischen mehrdimensionalen NMR zu erreichen.

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Forschung

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Chemie

Ein dynamisches Phantom mit mehreren Kompartimenten wird verwendet, um einige biologische Aspekte zu simulieren, die für Stoffwechselstudien mit hyperpolarisierten Magnetresonanzmitteln von Interesse sind.

Die Verwendung eines Mehrfach Dynamische einzelner Enzym-Phantom für Studien von hyperpolarisiertem Magnetic Resonance Agents

Eine neue Elektronenspinresonanz (EPR) Verfahren, schnelle Scan - EPR (RS-EPR) wird für 2D - spektrale räumliche Abbildung gezeigt , die auf die traditionelle kontinuierliche Welle (CW) Technik überlegen ist , und eröffnet neue Orte für in - vivo - Bildgebung. Die Ergebnisse werden bei 250 MHz gezeigt, aber die Technik ist bei jeder Frequenz anwendbar.

Rapid-Scan-Elektronenspinresonanz eröffnet neue Wege für Imaging Physiologisch Wichtige Parameter<em&gt; In Vivo</em

Die dynamische Kernpolarisation mit anschließender Probenauflösung hat Echtzeitstudien des Stoffwechsels in biologischen Systemen ermöglicht. Hyperpolarisiertes [1-13C]pyruvat wurde verwendet, um die Laktatdehydrogenase-Aktivität in einer Prostatakarzinom-Zelllinie in vitro zu untersuchen.

hyperpolarisiertem 13 C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Wir beschreiben hier eine Methode zur Identifizierung mehrerer Phosphorylierungen eines intrinsisch ungeordneten Proteins mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR), wobei das Tau-Protein als Fallstudie verwendet wird. Rekombinantes Tau wird vor der Datenerfassung und -analyse in vitro durch eine Kinase isotopenangereichert und modifiziert.

Kernresonanzspektroskopie zur Identifizierung von Multiple Phosphorylierungen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

Ein Protokoll für die Probenvorbereitung 13C,15N-Label Pilz und Pflanze für multidimensionale Festkörper-NMR-Spektroskopie und dynamische atomare Polarisation (DNP) Untersuchungen wird vorgestellt.

Vorbereitung von Pilz und Pflanze-Materialien für strukturelle Aufklärung mittels dynamischen atomare Polarisation Festkörper-NMR

Wir präsentieren ein Protokoll zur Messung der Magnetfeldabhängigkeit der Spin-Gitter-Entspannungszeit von 13C-angereicherten Verbindungen, die mittels dynamischer kernatischer Polarisation mit schneller feldzyklusweiseer Entspannungsometrie hyperpolarisiert werden. Insbesondere haben wir dies mit [1-13C]pyruvat nachgewiesen, aber das Protokoll könnte auf andere hyperpolarisierte Substrate ausgedehnt werden.

Messung der Spin-Lattice Relaxation Magnetfeldabhängigkeit von hyperpolarisiertem [1-13C]pyruvat

Hier wird eine detaillierte Beschreibung des im Labor implementierten Protokolls zur Erfassung und Analyse von 15 NRelaxationsdispersionsprofilen mittels Lösungs-NMR-Spektroskopie bereitgestellt.

15 N CPMG Relaxation Dispersion zur Untersuchung der Proteinkonformationsdynamik auf der μs-ms Zeitskala

Die Neutronenrückstreuspektroskopie bietet einen zerstörungsfreien und markierungsfreien Zugang zur ps-ns-Dynamik von Proteinen und deren Hydratationswasser. Der Workflow wird anhand von zwei Studien zu Amyloid-Proteinen vorgestellt: zur zeitaufgelösten Dynamik von Lysozym während der Aggregation und zur Hydratationswasserdynamik von Tau bei der Faserbildung.

Hochauflösende Neutronenspektroskopie zur Untersuchung der Pikosekunden-Nanosekunden-Dynamik von Proteinen und Hydratationswasser

Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) kann die Dynamik von Strukturproteinen rückstandsspezifisch charakterisieren. Wir bieten ein praxisorientiertes Protokoll für die Aufzeichnung von NMR 15N R1 und R2 Relaxations- und {1H}-15N heteronuklearen Overhauser Effekt (hetNOE) Experimenten, das für die Zeitskala von Pikosekunden bis Nanosekunden empfindlich ist.

NMR 15N-Relaxationsexperimente zur Untersuchung der Strukturdynamik von Proteinen in Pikosesekunden bis Nanosekunden

Dieses Protokoll integriert ein speziell angefertigtes Bioreaktorsystem mit hyperpolarisierter ¹³C-NMR-Spektroskopie zur Messung des Pyruvatstoffwechsels in lebenden Zellen in Echtzeit und verbessert so die Reproduzierbarkeit und kinetische Genauigkeit für Stoffwechselstudien und Wirkstoffscreening-Anwendungen.

Echtzeit-Stoffwechselnachweis in lebenden Zellen mittels hyperpolarisierter 13C NMR

Erfahren Sie, wie dynamische Kernpolarisation (DNP) die NMR-Empfindlichkeit für Echtzeit-Messungen enzymatischer Reaktionsgeschwindigkeiten erhöht. Diese Methode ermöglicht die direkte Quantifizierung von Substraten ohne molekulare Veränderung.

Die Auflösung dynamische Kernpolarisation Besetzung für Echtzeit-enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit Messungen von NMR

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