Die Auflösung dynamische Kernpolarisation Besetzung für Echtzeit-enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit Messungen von NMR

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, enzymatische Prozesse in Echtzeit durch dynamisch polarisationsverstärkte Kernspinresonanz zu verfolgen. Die magnetische Resonanz im flüssigen Zustand, die durch die dynamische Kernpolarisation (DNP) verstärkt wird, kann helfen, Schlüsselfragen zu beantworten: Wie kann man beispielsweise die Raten der enzymatischen Transformation eines Molekülpaares in der Zelle oder in vivo bestimmen, ohne dieses Molekülpaar in irgendeiner Weise verändern zu müssen? Die Installation unserer Dissolution-DNP-Geräte in unserem Labor und die Ankunft von Dr. Riccardo Balzan, einem Doktor des Arnaud Comment Labors in Lausanne, ist ein großer Schritt nach vorne für unsere Forschung.

DNP erhöht die Empfindlichkeit von Experimenten, die wir mit unseren 500-Megahertz-NMR-Spektrometern durchführen können, erheblich. Dieses DNP-Gerät war das erste, das in Frankreich installiert wurde, und ich möchte erwähnen, dass bei der Funktionstüchtigung dieses Geräts alle Mitglieder unseres NMR-Teams beteiligt waren, und ich möchte insbesondere Gildas Bertho, unseren Forschungsingenieur, und Fatiha Kateb, unsere Maître de Conferences, erwähnen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine direkte Echtzeit-Quantifizierung des Substrats und seiner endogenen Derivate mit einer Zeitauflösung von Sekunden ermöglicht.

Für die Polarisationslösung bereiten Sie zwei Milliliter einer 1,12 molaren, mit Kohlenstoff 13 markierten Natriumpyruvatlösung vor, die mit 33 Millimolar TEMPO-Radikal in einem Volumen von zwei zu eins deuteriertem Wasser zu deuteriertem Ethanol für Kohlenstoff-13-Beobachtungen dotiert ist. Senken Sie die Temperatur des Kryostaten mit dynamischer Kernpolarisation (DNP) durch das Abkühlverfahren, indem Sie auf die Abklingschaltfläche auf der Benutzeroberfläche der Kryostat-Software klicken. Sammeln Sie flüssiges Helium im DNP-Kryostaten durch den Füllvorgang.

Klicken Sie auf die Schaltfläche "Befüllen" auf der Benutzeroberfläche der Kryostat-Software. Geben Sie dann 300 Mikroliter der optimierten Polarisationslösung in den Probenbehälter, der mit dem DNP-Polarisator geliefert wird. Frieren Sie den Probenbehälter mit der Probe darin ein, indem Sie ihn vorsichtig in ein Flüssigstickstoffbad tauchen.

Beseitigen Sie den flüssigen Stickstoff, der nach dem Gefriervorgang im Probenbehälter vorhanden sein kann, indem Sie den Probenbehälter aus dem Flüssigstickstoffbad nehmen und auf den Kopf stellen. Führen Sie anschließend die Probe in den Kryostaten ein, indem Sie zunächst den Probenbehälter in den Probenhalter einsetzen. Setzen Sie dann den Probenhalter in den Hauptkryostateinsatz ein, bevor Sie den Wellenleiter der Mikrowelle in den Probenhalter einsetzen.

Senken Sie die Kryostatentemperatur, indem Sie den Ein-Kelvin-Kühlvorgang starten. Klicken Sie auf die Schaltfläche für die Kelvin-Kühlung auf der Benutzeroberfläche der Kryostat-Software. Schalten Sie die Mikrowellenquelle ein und bestrahlen Sie die Probe, indem Sie auf der Benutzeroberfläche der Kryostat-Software auf die Schaltfläche Mikrowellen ein klicken.

Trennen Sie das Koaxialkabel des Detektionskanals der NMR-Konsole von der Spektrometerspule, indem Sie den Stecker um 90 Grad gegen den Uhrzeigersinn drehen und daran ziehen. Stecken Sie das Koaxialkabel des Detektionskanals in den Koaxialstecker der Kryostat-NMR-Spule. Stecken Sie dann den Stecker des NMR-Konsolenkabels in die Buchse der Kryostat-NMR-Spule und achten Sie dabei auf den Orientierungsstift.

Drücken Sie fest auf den Stecker und drehen Sie ihn um 90 Grad im Uhrzeigersinn. Messen Sie das thermische NMR-Signal im festen Zustand an der Kryostatenstelle mit einer einfachen Impulserfassungssequenz mit unkalibrierten Impulsen mit niedrigem Flip-Winkel, die in einem Intervall von t gleich fünf Minuten wiederholt werden. Nachdem Sie die Messung eingerichtet haben, schreiben Sie zg in die Befehlszeile der Software und drücken Sie die Eingabetaste auf der Tastatur.

Messen Sie nach Beginn des Polarisationsverfahrens das DNP-verstärkte NMR-Signal im festen Zustand mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Bedingungen, die für die Messung des thermischen Signals verwendet werden. Trennen Sie das Koaxialkabel des NMR-Konsolendetektionskanals von der Kryostat-NMR-Spule, indem Sie den Stecker um 90 Grad gegen den Uhrzeigersinn drehen und daran ziehen. Stecken Sie dann das Koaxialkabel des Detektionskanals in den Koaxialstecker der Spektrometerspule

Stecken Sie den Stecker des NMR-Konsolenkabels in die Buchse der Spektrometerspule und achten Sie dabei auf den Ausrichtungsstift. Drücken Sie fest auf den Stecker und drehen Sie ihn um 90 Grad im Uhrzeigersinn. Bereiten Sie eine LDH-Lösung aus Kaninchenmuskeln in einer Einheit pro Milliliter in Reaktionspuffer mit 20 Mikrogramm pro Milliliter Rinderserumalbumin frisch vor.

Mischen Sie anschließend 478 Mikroliter Reaktionspuffer, 2 Mikroliter LDH-Lösung und 20 Mikroliter deuteriertes Wasser, um eine Stabilisierung oder Verriegelung des Spektrometerfeldes zu ermöglichen. Geben Sie dann das Volumen der 500-Mikroliter-Lösung in ein 5-Millimeter-NMR-Röhrchen. Verbinden Sie das Transferrohr mit einer automatisierten, speziell angefertigten Injektionsvorrichtung, die die hyperpolarisierte Lösung von dem für den Transfer verwendeten Heliumgas trennt.

Das Gerät gibt automatisch 500 Mikroliter hyperpolarisierte Lösung in das Probenröhrchen ab. Legen Sie vor der Auflösung das Fünf-Millimeter-NMR-Röhrchen mit 500 Mikrolitern Probe in das Isozentrum des 11,74-Tesla-NMR-Spektrometers. Geben Sie 5 Milliliter deuteriertes Wasser in den Dissolution-Einsatzkessel.

Beaufschlagen und erhitzen Sie das deuterierte Wasser mit Hilfe des Widerstandsdrahtes, bis eine Temperatur von etwa 180 bis 200 Grad Celsius erreicht ist, indem Sie auf der Benutzeroberfläche der Kryostat-Software auf die Schaltfläche "Heizung vorbereiten" klicken. Klicken Sie auf die Schaltfläche SS-Operationen auf der Benutzeroberfläche der Kryostat-Software. Entfernen Sie dann die Mikrowellenführung vom Auflösungseinsatz.

Schieben Sie den Dissolution-Einsatz nach unten in den Probenhalter. Der Dissolution-Einsatz muss bis zum Boden des Probenhalters reichen und fest gedrückt werden, um eine leckdichte Verbindung mit dem Probenbehälter herzustellen, um ein Austreten von deuteriertem Wasser in den Kryostaten zu vermeiden. Drücken Sie den Hardware-Auslöser, um die Auflösungssequenz zu starten, eine vorgegebene zeitgesteuerte Abfolge von pneumatischen Ventilvorgängen.

Unmittelbar nach der Auflösung mischt das Injektionsgerät 500 Mikroliter hyperpolarisierte Lösung mit der Probe, die in das NMR-Spektrometer gegeben wird. Messen Sie nach dem Auflösen das hyperpolarisierte NMR-Signal der Probe im Spektrometer in einer Reihe von 10-Grad-Pulserfassungssequenzen mit Flip-Winkel-Pulserfassungssequenzen im Abstand von 1,5 Sekunden, um den Fortschritt der Magnetisierung des Substrats und des Produkts zu verfolgen. Nachdem Sie die Messung eingerichtet haben, schreiben Sie zg in die Befehlszeile der Software und drücken Sie die Eingabetaste.

Sobald die Magnetisierung vollständig entspannt ist, messen Sie das thermische NMR-Signal mit einer Reihe von Impulserfassungssequenzen mit einem Wendewinkel von 90 Grad, die in einem Abstand von etwa drei Minuten angeordnet sind, was etwa 3T1 entspricht. Nachdem Sie die Messung eingerichtet haben, schreiben Sie zg in die Befehlszeile der Software und drücken Sie die Eingabetaste. Hier zeigt der Zeitverlauf von Spektren, die aus wiederholten 10-Grad-Flip-Winkel-Pulsen erhalten wurden, die Empfindlichkeit und Zeitauflösung der Technik.

Nach der Peak-Identifizierung des Pyruvatsubstrats und des Laktatprodukts erfolgt die Quantifizierung durch Signalintegration der Metaboliten. Die enzymatische Aktivität wird aus dem Zeitverlauf des Produktsignals durch Anpassung an ein lineares Modell bestimmt. Um die Messung zu validieren, wird die gleiche Menge anhand der anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeit aus dem Verhältnis der Signale von Produkt und Substrat bewertet.

Einmal gemeistert, kann eine vollständige Messung der enzymatischen Aktivität in etwa zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie Sie ein stark polarisiertes Substrat für die NMR herstellen, es in eine Lösung injizieren, die ein Enzym enthält, und die enzymatische Aktivität mit DNP-verstärkter NMR verfolgen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die enzymatische Lösung sorgfältig mit frischem Enzym und Cosubstraten herzustellen und Luftblasen im Probenröhrchen zu vermeiden.

Mit der Entwicklung der DNP-verstärkten Magnetresonanz im flüssigen Zustand können Forscher nun die Substrataufnahme und ihre enzymatische Umwandlung in verschiedenen Zelltypen untersuchen, indem sie die Geschwindigkeit der Produktbildung messen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit kryogenen Geräten und hohen Magnetfeldern äußerst gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieser Messungen sollten immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie z. B. das Tragen eines persönlichen Schutzes gegen Kryogene und die Überprüfung, ob keine magnetischen Gegenstände vorhanden sind.

Im Gegensatz zur klassischen NMR ist die Auflösungs-DNP-basierte NMR auf ein experimentelles Zeitfenster von maximal Minuten beschränkt, abhängig vom Substrat und dem aktuellen Lebenszustand. Dies steht im Weg, über eine D-Spektroskopie hinauszugehen. Die Dissolution DNP NMR muss weiterentwickelt werden, um sie auf das Vielseitigkeitsniveau der klassischen mehrdimensionalen NMR zu bringen.