Die Auflösung dynamische Kernpolarisation Besetzung für Echtzeit-enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit Messungen von NMR

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, enzymatische Prozesse in Echtzeit mittels kernmagnetischer Resonanz, die durch dynamische nukleare Polarisation verstärkt wird, zu verfolgen. Die in der Flüssigphase durch dynamische nukleare Polarisation (DNP) verstärkte Magnetresonanz kann dabei helfen, zentrale Fragen zu beantworten: beispielsweise, wie die Reaktionsgeschwindigkeiten enzymatischer Umwandlungen eines Molekülpaars in Zellen oder in vivo bestimmt werden können, ohne diesen Molekülkomplex auf irgendeine Weise verändern zu müssen. Die Installation unserer DNP-Auflösungsanlage in unserem Labor sowie die Ankunft von Dr. Riccardo Balzan, einem Doktoranden aus dem Labor von Arnaud Comment in Lausanne, stellt einen großen Fortschritt für unsere Forschung dar.

DNP erhöht signifikant die Empfindlichkeit der Experimente, die wir an unseren 500-Megahertz-NMR-Spektrometern durchführen können. Diese DNP-Ausrüstung war die erste, die in Frankreich installiert wurde, und ich möchte betonen, dass alle Mitglieder unseres NMR-Teams an der Inbetriebnahme dieser Ausrüstung beteiligt waren; insbesondere möchte ich Gildas Bertho, unseren Forschungsingenieur, und Fatiha Kateb, unsere Maître de conférences, erwähnen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine direkte, Echtzeit-Quantifizierung des Substrats und seiner endogenen Derivate mit einer Zeitauflösung von Sekunden ermöglicht.

Für die Polarisationlösung bereiten Sie zwei Milliliter einer 1,12-molaren, mit Kohlenstoff-13 markierten Natriumpyruvatlösung vor, die mit 33 Millimolar TEMPO-Radikal in einem Volumenverhältnis von zwei zu eins aus deuteriertem Wasser zu deuteriertem Ethanol für Kohlenstoff-13-Beobachtungen dotiert ist. Senken Sie die Temperatur des dynamischen nuklearen Polarisation (DNP)-Kryostaten durch den Abkühlvorgang, indem Sie im Softwareinterface des Kryostaten die Abkühl-Schaltfläche anklicken. Sammeln Sie flüssiges Helium im DNP-Kryostaten über das Befüllverfahren.

Klicken Sie auf die Fülltaste in der Software-Schnittstelle des Kryostaten. Geben Sie anschließend 300 µL der optimierten Polarisationsslösung in den mit dem DNP-Polarisator bereitgestellten Probenbehälter. Gefrieren Sie den Probenbehälter mit der Probe, indem Sie ihn vorsichtig in ein flüssiges Stickstoffbad eintauchen.

Entfernen Sie den flüssigen Stickstoff, der nach dem Einfrieren möglicherweise im Probenbehälter vorhanden ist, indem Sie den Probenbehälter aus dem flüssigen Stickstoffbad entnehmen und ihn kopfüber drehen. Danach führen Sie die Probe in das Kryostat ein, indem Sie zuerst den Probenbehälter in den Probenh alter einsetzen. Anschließend platzieren Sie den Probenh alter in den Haupteinsatz des Kryostats, bevor Sie die Mikrowellen-Wellenleiter in den Probenh alter einsetzen.

Senken Sie die Kryostattemperatur, indem Sie das Abkühlverfahren auf ein Kelvin starten. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Abkühlung auf ein Kelvin“ in der Software-Schnittstelle des Kryostaten. Schalten Sie die Mikrowellenquelle ein und bestrahlen Sie die Probe, indem Sie in der Software-Schnittstelle des Kryostaten auf die Schaltfläche „Mikrowellen einschalten“ klicken.

Trennen Sie das Koaxialkabel des NMR-Konsolendetektionskanals von der Spektrometer-Spule, indem Sie den Stecker um 90 Grad gegen den Uhrzeigersinn drehen und herausziehen. Schließen Sie das Koaxialkabel des Detektionskanals an den Koaxialanschluss der NMR-Spule des Kryostaten an. Stecken Sie dann den männlichen Stecker des Kabels der NMR-Konsole in den weiblichen Anschluss der NMR-Spule des Kryostaten, wobei Sie auf den Orientierungsstift achten müssen.

Drücken Sie fest und drehen Sie den Verbinder um 90 Grad im Uhrzeigersinn. Messen Sie das NMR-Thermalsignal im festen Zustand am Kryostatort mithilfe einer einfachen Puls-Akquisitions-Sequenz mit nicht kalibrierten, kleinen Kippwinkelpulsen, die in einem Intervall von t gleich fünf Minuten wiederholt werden. Schreiben Sie nach dem Einrichten der Messung „zg“ in die Befehlszeile der Software und drücken Sie die Eingabetaste auf der Tastatur.

Nachdem der Polarisationsvorgang eingeleitet wurde, messen Sie das DNP-verstärkte NMR-Signal im festen Zustand mit der gleichen Methode und unter denselben Bedingungen wie bei der Messung des thermischen Signals. Trennen Sie das Koaxialkabel des NMR-Konsoles-Detektionskanals von der NMR-Spule des Kryostaten, indem Sie den Stecker um 90 Grad gegen den Uhrzeigersinn drehen und herausziehen. Anschließend stecken Sie das Koaxialkabel des Detektionskanals in den Koaxialanschluss der Spektrometer-Spule.

Stecken Sie den männlichen Stecker des NMR-Konsolenkabels in den weiblichen Stecker der Spektrometer-Spule, wobei Sie auf den Orientierungsstift achten müssen. Drücken Sie fest und drehen Sie den Stecker um 90 Grad im Uhrzeigersinn. Bereiten Sie frisch eine Kaninchenmuskel-LDH-Lösung mit einer Einheit pro Milliliter in Reaktionspuffer mit 20 Mikrogramm pro Milliliter Rinderserumalbumin vor.

Mischen Sie anschließend 478 Mikroliter Reaktionspuffer, 2 Mikroliter LDH-Lösung und 20 Mikroliter Deuteriumoxid, um die Feldstabilisierung oder Verriegelung des Spektrometers zu ermöglichen. Geben Sie dann das 500-Mikroliter-Lösungsvolumen in eine 5-Millimeter-NMR-Röhre. Verbinden Sie die Transferleitung mit einer automatisierten, speziell angefertigten Injektionsvorrichtung, die die hyperpolarisierte Lösung vom zum Transfer verwendeten Heliumgas trennt.

Das Gerät gibt automatisch 500 Mikroliter hyperpolarisierte Lösung in das Probenröhrchen ab. Vor der Auflösung bringen Sie das Fünf-Millimeter-NMR-Röhrchen, das 500 Mikroliter Probe enthält, in den Isocenter des 11,74-Tesla-NMR-Spektrometers ein. Füllen Sie 5 Milliliter Deuteriumoxid in den Kessel des Auflösungseinsatzes ein.

Drücken Sie und erhitzen Sie das deuterierte Wasser mithilfe des Widerstandsdrahts, bis durch Anklicken der Schaltfläche „Heizung vorbereiten“ in der Software-Schnittstelle des Kryostaten eine Temperatur von etwa 180 bis 200 Grad Celsius erreicht ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche „SS-Betrieb“ in der Software-Schnittstelle des Kryostaten. Entfernen Sie anschließend die Mikrowellenleitung aus dem Auflösungseinsatz.

Schieben Sie den Auflösungseinsatz in den Probenhalter hinab. Der Auflösungseinsatz muss den Boden des Probenhalters erreichen und fest gedrückt werden, um eine dichte Verbindung mit dem Probenbehälter herzustellen und ein Austreten von deuteriertem Wasser in das Kryostat zu vermeiden. Drücken Sie den Hardware-Trigger, um die Auflösungssequenz zu starten, eine vorbestimmte zeitgesteuerte Abfolge von pneumatischen Ventilbetätigungen.

Kurz nach der Auflösung mischt das Injektionsgerät 500 Mikroliter hyperpolarisierte Lösung mit der Probe, die im NMR-Spektrometer platziert ist. Nach der Auflösung messen Sie das hyperpolarisierte NMR-Signal der Probe im Spektrometer mittels einer Serie von 10-Grad-Flip-Winkel-Puls-Akquisitionssequenzen, die im Abstand von 1,5 Sekunden durchgeführt werden, um den Verlauf der Magnetisierung von Substrat und Produkt zu verfolgen. Nachdem die Messung eingerichtet wurde, geben Sie „zg“ in der Befehlszeile der Software ein und drücken die Eingabetaste.

Wenn die Magnetisierung vollständig relaxiert ist, messen Sie das NMR-Thermalsignal durch eine Serie von 90-Grad-Kippwinkelpuls-Aquirier-Sequenzen, die etwa drei Minuten auseinanderliegen und etwa 3T1 entsprechen. Nachdem die Messung eingerichtet wurde, geben Sie „zg“ in der Befehlszeile der Software ein und drücken Sie die Eingabetaste. Hier zeigt der zeitliche Verlauf der Spektren, die aus wiederholten 10-Grad-Kippwinkelpulsen erhalten wurden, die Empfindlichkeit und zeitliche Auflösung der Methode.

Nach der Identifizierung der Signale für das Pyruvat-Substrat und das Lactat-Produkt erfolgt die Quantifizierung durch Signalintegration der Metaboliten. Die enzymatische Aktivität wird aus dem zeitlichen Verlauf des Produktsignals durch Anpassung an ein lineares Modell bestimmt. Zur Validierung der Messung wird dieselbe Größe anhand der Anfangsreaktionsgeschwindigkeit aus dem Verhältnis der Signale von Produkt und Substrat ermittelt.

Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann die vollständige Bestimmung der enzymatischen Aktivität in etwa zwei Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie verstehen, wie man ein hochpolarisiertes Substrat für die NMR erzeugt, es in eine Lösung, die ein Enzym enthält, injiziert und die enzymatische Aktivität mittels DNP-verstärkter NMR verfolgt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die enzymatische Lösung sorgfältig mit frischem Enzym und Cofaktoren vorzubereiten und sicherzustellen, dass keine Luftblasen im Probenröhrchen vorhanden sind.

Mit der Entwicklung der DNP-gestützten Magnetresonanz in der Flüssigphase können Forscher nun die Substrataufnahme und deren enzymatische Umwandlung in verschiedenen Zelltypen untersuchen, indem sie die Produktbildungsrate messen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit kryogenen Geräten und starken Magnetfeldern äußerst gefährlich sein kann. Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung gegen Kryogene und die Überprüfung des Fehlens magnetischer Gegenstände sollten stets beachtet werden, wenn diese Messungen durchgeführt werden.

Im Gegensatz zur klassischen NMR ist die NMR auf Basis von Auflösungs-DNP auf ein experimentelles Zeitfenster von maximal wenigen Minuten begrenzt, abhängig vom Substrat und dem aktuellen Zustand des Lebens. Dies steht einer Erweiterung über die eindimensionale Spektroskopie hinaus entgegen. Die Auflösungs-DNP-NMR muss weiterentwickelt werden, um die Vielseitigkeit der klassischen mehrdimensionalen NMR zu erreichen.