Kernresonanzspektroskopie zur Identifizierung von Multiple Phosphorylierungen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

Wir beschreiben hier eine Methode zur Identifizierung mehrerer Phosphorylierungen eines intrinsisch ungeordneten Proteins mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR), wobei das Tau-Protein als Fallstudie verwendet wird. Rekombinantes Tau wird vor der Datenerfassung und -analyse in vitro durch eine Kinase isotopenangereichert und modifiziert.

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist die Identifizierung der multiplen Phosphorylierung eines intrinsisch ungeordneten Proteins durch Kernspinresonanzspektroskopie am Beispiel des Tau-Proteins. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen der molekularen Regulation im Zusammenhang mit Krankheiten zu beantworten, wie z.B. den Einfluss der Phosphorylierung auf die Interaktion des Proteins mit seinem molekularen Partner. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die ortsspezifische Phosphorylierung in einem ungeordneten Protein identifizieren und mit strukturellen und funktionellen Veränderungen in Verbindung bringen können.

Diese Methode kann einen Einblick in die Funktion geben. Es kann auch auf andere Proteine angewendet werden, wie z. B. die ungeordneten Überreste des DNA-Proteins aus dem aPtc-Virus. Die Anwendungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie durch die Entwicklung von Protein-Protein-Interaktionsinhibitoren. Diese Methode wird von Clement Danis, Clement Despres, Luiza Bessa und Hamida Merzougui, den Doktoranden unserer Gruppe, demonstriert.

Mischen Sie zunächst vorsichtig 50 Mikroliter kompetenter BL21-Zellen mit 100 Nanogramm Plasmid-DNA, wobei Sie 10 bis 15 Millionen Kolonien pro Mikrogramm Plasma-DNA in einem 1,5-Milliliter-Kunststoffröhrchen bilden. Nachdem Sie das Zellgemisch 30 Minuten lang auf Eis gelegt haben, schocken Sie es 10 Sekunden lang bei 42 Grad Celsius. Stellen Sie die Tube dann wieder für fünf Minuten auf Eis, bevor Sie einen Milliliter Luria Bertani oder LB Medium bei Raumtemperatur hinzufügen.

Inkubieren Sie die Bakteriensuspension bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten unter sanftem Rühren. Verteilen Sie mit einem Spreizer 100 Mikroliter der Zellsuspension gleichmäßig auf eine Agarplatte aus LB-Medium, die 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin-Antibiotikum enthält. Inkubieren Sie die Auswahlplatte 15 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Als nächstes wird 300 Milligramm Stickstoff 15 und mit Kohlenstoff 13 angereichertes Medium, ein Gramm Stickstoff 15 Ammoniumchlorid und zwei Gramm Kohlenstoff 13 markierte Glukose in 10 Millilitern M9 Medium aufbereitet. Der Filter sterilisiert die Isotopenlösung mit einem 0,2-Mikron-Filter direkt in das M9-Medium. Mit einer Pasteurpipette suspendieren Sie eine Kolonie des rekombinanten Plasmas transformierte Bakterien aus der Selektionsplatte in 20 Milliliter LB-Medium, ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin.

Inkubieren Sie das beimpfte Medium bei 37 Grad Celsius für etwa sechs Stunden. Messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD600 mit einem Milliliter einer zehnfachen Verdünnung der Bakterienkultur in einer Kunststoffspektrometer-Küvette. Geben Sie dann 20 Milliliter der gesättigten LB-Kultur zu einem Liter M9-Wachstumsmedium, das mit Ampicillin in einem Zwei-Liter-Erlenmeyerglas-Kulturkolben ergänzt wird.

Stellen Sie den Kulturkolben in einen programmierbaren Inkubator, der auf 10 Grad Celsius und 50 U/min eingestellt ist. Programmieren Sie den Inkubator so, dass er am frühen Morgen des nächsten Tages auf 200 U/min und 37 Grad Celsius umschaltet. Messen Sie den OD600 an einem Milliliter Bakterienkultur in einer Kunststoffspektrometerküvette.

Fügen Sie 400 Mikroliter einer molaren IPTG-Stammlösung hinzu, wenn der OD600 einen Wert von etwa 1,0 erreicht, um die Expression des rekombinanten Tau-Proteins zu induzieren. Nachdem Sie die Bakterienzellen weitere drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, sammeln Sie sie durch Zentrifugation bei 5.000 mal g für 20 Minuten. Tauen Sie das bakterielle Zellpellet auf und resuspendieren Sie es gründlich in 45 Millilitern Kationenaustauscherpuffer A, frisch ergänzt mit 1x Proteasehemmer-Cocktail DNasel 1.

Zerstören Sie die Bakterienzellen mit einem Hochdruck-Homogenisator bei 20.000 PSI, drei bis vier Durchgänge sind notwendig, um die Zellen angemessen aufzubrechen. Zentrifugieren Sie die zerfallenen Zellen 40 Minuten lang bei 20.000 g g, um das unlösliche Material zu entfernen. Erhitzen Sie den Bakterienzellextrakt 15 Minuten lang bei 75 Grad Celsius im Wasserbad.

Nach einigen Minuten wird ein weißer Niederschlag beobachtet. Zentrifugieren Sie dann den erhitzten Extrakt bei 15.000 g für 20 Minuten und halten Sie den Überstand mit dem hitzestabilen Tau-Protein haltbar. Führen Sie anschließend eine Kationenaustauschchromatographie auf einem starken CEX-Harz durch, das als 5-Milliliter-Bettsäule mit einem schnellen Proteinflüssigkeitschromatographiesystem verpackt ist.

Stellen Sie die Flussrate auf 2,5 Milliliter pro Minute ein und äquilibrieren Sie die Säule in CEX A-Puffer. Laden Sie als Nächstes den 60 bis 70 Milliliter erhitzten Tau-Extrakt mit einer Probenpumpe und sammeln Sie den Durchfluss für die Analyse, um zu überprüfen, ob das Tau-Protein effizient an das Harz bindet. Waschen Sie das Harz mit CEX A-Puffer, bis die Extinktion bei 280 Nanometern wieder auf dem Ausgangswert liegt.

Programmieren Sie den FPLC mit einem Gradienten von bis zu 25 % CEX B-Puffer in 10 Säulenvolumina, um 250 Millimolar Natriumchlorid zu erreichen. Anschließend wird 50 % CEX B-Puffer in fünf Säulenvolumina verwendet, um 500 millimolare Natriumchloride zu erreichen. Erhöhen Sie schließlich den Gradienten auf 100 % CEX B-Puffer in zwei Säulenvolumina, um ein molares Natriumchlorid zu erreichen.

Sammeln Sie 1,5 Milliliter Fraktionen während der Elutionsschritte. Führen Sie dann einen Pufferaustausch auf dem Tau durch, das gepoolte Fraktionen enthält. Äquilibrieren Sie eine Entsalzungssäule mit einem 53-Milliliter-G25-Harz-Füllbett in 15 Millimolar Ammoniumbicarbonat-Puffer unter Verwendung eines FPLC-Systems.

Stellen Sie die Flussrate auf fünf Milliliter pro Minute ein und injizieren Sie die Tau-Probe über eine Fünf-Milliliter-Injektionsschleife auf die Säule. Sammeln Sie die Fraktionen, die dem Absorptionspeak bei 280 Nanometern entsprechen. Bündeln Sie alle Tau-Fraktionen, bevor Sie die Probe in die Röhrchen verteilen.

Wählen Sie diese Röhrchen so, dass das Volumen der Lösung im Vergleich zum Volumen des Röhrchens klein ist. Anschließend werden mit einer Nadel Löcher in die Röhrchenkappen gestanzt, bevor die Tau-Proben bei minus 80 Grad Celsius für die spätere Gefriertrocknung eingefroren werden. Solubilisieren Sie vier Milligramm lyophilisierten Stickstoff 15 und Kohlenstoff 13, angereichert mit phosphoryliertem Tau, in 400 Mikrolitern NMR-Puffer.

Fügen Sie fünf Prozent Deuteriumoxid für die Feldkopplung des NMR-Spektrometers und ein millimolares TMSP als interne NMR-Signalreferenz hinzu. Fügen Sie außerdem 10 Mikroliter einer 40-EK-Stammlösung eines vollständigen Proteasehemmer-Cocktails hinzu. Übertragen Sie die Probe in ein Fünf-Milliliter-NMR-Röhrchen mit einer elektronischen Spritze mit langer Nadel oder mit einer Pasteurpipette.

Verschließen Sie den NMR-Schlauch mit dem Kolben. Entfernen Sie alle Luftblasen, die zwischen dem Kolben und der Flüssigkeit eingeschlossen sind, indem Sie den Kolben bewegen. Setze den NMR-Schlauch in einen Spinner ein.

Verwenden Sie das entsprechende Messgerät, um die vertikale Position im Spinner so einzustellen, dass sich der größte Teil der Probenlösung in der NMR-Spule befindet. Starten Sie anschließend den Luftstrom im NMR-Instrument, indem Sie im Fenster Magnet Control System auf Lift klicken. Platzieren Sie den Spinner vorsichtig mit dem Rohr im Luftstrom oben an der Magnetbohrung.

Stoppen Sie dann den Luftstrom und lassen Sie den Schlauch in den Sondenkopf innerhalb des Magneten absinken. Nachdem Sie die Probe auf 25 Grad Celsius äquilibriert haben, geben Sie ATMM in die Befehlszeile ein, um eine halbautomatische Abstimmung und Anpassung des Sondenkopfes durchzuführen und die Energieübertragung zu optimieren. Klicken Sie dann im Fenster Magnetsteuerungssystem auf Sperre, um die Feldfrequenzsperre des Spektrometers zu aktivieren.

Starten Sie den Shimming-Vorgang, um die Homogenität des Magnetfelds an der Position der Probe zu optimieren, indem Sie zuerst TopShim GUI in die Befehlszeile eingeben, um das Shim-Fenster zu öffnen. Klicken Sie dann im Shim-Fenster auf Start. Überprüfen Sie die verbleibende B0-Standardabweichung, um sicherzustellen, dass die Unterlegscheiben optimal sind.

Kalibrieren Sie als Nächstes den P1-Parameter, der die Länge eines Protonen-Hochfrequenzpulses in Mikrosekunden angibt. Dieser Parameter ist notwendig, um eine 90-Grad-Drehung der Protonenspinmagnetisierung zu erhalten. Streben Sie den 360-Grad-Puls mit einem eindimensionalen Spektrum von Wasserprotonen an.

Passen Sie den Frequenzversatz an, indem Sie den Parameter O1 auf die Protonenwasserfrequenz im eindimensionalen Spektrum einstellen. Starten Sie schließlich die Erfassung des eindimensionalen Protonenspektrums, indem Sie ZG in die Befehlszeile eingeben. Ein repräsentatives Ergebnis der Aufreinigung von rekombinantem Tau zeigt einen großen Absorptionspeak bei 280 Nanometern, der während des Elutionsgradienten beobachtet wurde.

Dieser Peak entspricht dem gereinigten Tau-Protein, wie es auf dem Acrylamid-Gel über dem Chromatogramm zu sehen ist. Das Chromatogramm zur Entsalzung des rekombinanten gereinigten Tau zeigt, dass der Absorptionspeak bei 280 Nanometern und der Peak der Leitfähigkeit gut voneinander entfernt sind, um sicherzustellen, dass die Entsalzung des Proteins für den Lyophilisationsschritt effizient ist. Das eindimensionale NMR-Spektrum des rekombinanten Stickstoffs 15 tau bei 900 Megahertz bestätigt, dass ein NMR-Signal aus der Proteinprobe nachgewiesen werden kann.

Ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zeigt an, dass die grundlegenden Erfassungsparameter korrekt eingestellt wurden. Das zweidimensionale Spektrum des phosphorylierten Proteins zeigt eine gute Auflösung, die Resonanzen sind schmal und gut getrennt. Die Resonanzen im Bereich des rot umrandeten Spektrums entsprechen den phosphorylierten Resten.

Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie in der Lage sein, ein rekombinantes Protein mit einfach zu pickender Markierung herzustellen, dieses Protein aufzureinigen und den Basisparameter für die Spektraldatenerfassung einzurichten. Sobald dieses Protokoll gemeistert ist, kann es in zwei Wochen erstellt werden, wenn es richtig organisiert ist. Vergessen Sie nicht, dass bei der NMR-Spektroskopie sehr starke Magnete verwendet werden, die nicht mit metallischen Objekten angenähert werden dürfen.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese anderen Proteine empfindlich auf die Proteaselyse reagieren und eine Reihe von Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden müssen, um den Abbau der Probe zu vermeiden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Festkörper-NMR angewendet werden, um die Amyloid-ähnlichen Aggregate zu untersuchen, die oft von ungeordneten Proteinen gebildet werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der chemischen Biologie den Weg, Wirkstoffe mit serapatischem Potenzial in vitro-Modellsystemen zu erforschen.