Die Quantifizierung der zerebrale vaskuläre Architektur unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Veränderungen in den kortikalen Kapillarnetzen nach längerer Exposition gegenüber dem HIV-Virotoxin Tat zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, wesentliche Veränderungen in der kortikalen Kapillarmorphologie zu untersuchen, die zur Pathogenese HIV-assoziierter neurokognitiver Störungen beitragen könnten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine physiologisch genaue Quantifizierung mehrerer morphologischer Parameter von Kapillaren ermöglicht.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Pathogenese von HIV-assoziierten neurokognitiven Störungen ermöglichen kann, ist sie ebenfalls auf andere Erkrankungen anwendbar, bei denen vaskuläre Veränderungen auftreten, wie beispielsweise die Alzheimer-Krankheit. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie künstliches Tränen-Gel auf die Augen einer anesthetisierten Maus auftragen.

Als Nächstes rasieren Sie den Kopf mit einem elektrischen Rasierer. Anschließend tragen Sie eine Povidon-Jod-Lösung auf, um die Kopfhaut zu desinfizieren, und lassen sie trocknen. Unter einem Lichtmikroskop entfernen Sie die Kopfhaut des Tieres, um die Parietalbeine, die kaudalen Frontalbeine und den Bregma-Punkt vollständig freizulegen.

Tragen Sie eine kleine Menge einer zehnprozentigen Eisen(III)-chlorid-Lösung auf den Schädel auf, um die Membran zum einfachen Entfernen zu trocknen. Entfernen Sie anschließend die getrocknete Membran, indem Sie vorsichtig mit der Pinzette über den Schädel kratzen. Tragen Sie danach eine dünne Schicht Klebstoff um das Fenster der Kopfplatte auf.

Drücken Sie die Kopfplatte vorsichtig gegen den Schädel der Maus, um den interessierenden Bereich in der Mitte des Fensters zu positionieren. Anschließend geben Sie einen Tropfen Zahnzement auf die Kopfplatte, um den Klebstoff zu polymerisieren. Danach tragen Sie eine dünne Schicht Klebstoff entlang der Kante des Fensters der Kopfplatte auf, um ein Reservoir zur Aufnahme der Kochsalzlösung zu bilden.

Nachdem der Kleber getrocknet ist, schrauben Sie die Kopfplatte in das Kopfplattenharness der Maus ein. Entfernen Sie jeglichen Kleber vom Fenster der Kopfplatte mit einem Bohrer, der an eine Mikrotorpedo-Bohrmaschine angeschlossen ist und auf 6.000 U/min eingestellt ist. Unterbrechen Sie alle 10 bis 15 Sekunden, um eine Überhitzung des Schädels der Maus zu vermeiden.

Danach mit einem neuen Bohrer beginnen, den Schädel mit einem auf 4.000 U/min eingestellten Mikrotrepanbohrer zu dünneren. Den Bohrer sanft über den Schädel bewegen, ohne direkten nach unten gerichteten Druck auszuüben. Sobald der Schädel vollständig ausgedünnt ist, das Tier vom Halter lösen und auf den Rücken legen.

Fixieren Sie beide Hintergliedmaßen vorsichtig mit Klebeband, um die mediale Oberschenkelregion deutlich freizulegen. Anschließend entfernen Sie die Behaarung über beiden medialen Oberschenkeln und desinfizieren die Operationsstelle, indem Sie die Oberschenkel mit Povidon-Iod bedecken. Entfernen Sie danach vorsichtig die Haut am medialen rechten Oberschenkel oberhalb der Vena femoralis und der Arteria femoralis.

Geben Sie etwa drei bis fünf Tropfen 0,9 % Salzlösung auf die Operationsstelle. Trennen Sie dann die femorale Vene von der Arterie, indem Sie den femoralen neurovaskulären Bündel stumpf dissezieren. Legen Sie nun zwei drei Zentimeter lange Stücke chirurgischen Nahtmaterials unter die femorale Arterie, etwa einen Zentimeter voneinander entfernt.

Drehen Sie die obere Naht im Uhrzeigersinn, um einen vaskulären Blutstau zu erzeugen, der während der Katheterisierung übermäßigen Blutverlust verhindert. Anschließend machen Sie mit einer Feder-Schere einen kleinen Schnitt in die A. femoralis, an der später der Katheter eingeführt wird, um die physiologischen Parameter der Maus zu überwachen. Entfernen Sie in diesem Verfahren die Haut am medialen linken Oberschenkel der Maus.

Als Nächstes die Vena femoralis lokalisieren. Mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 30-Gauge-Nadel 130 Mikroliter der fluoreszierenden Farbstofflösung aufziehen. Langsam 100 Mikroliter des Farbstoffs in die Vena femoralis injizieren.

Nachdem die Nadel entfernt wurde, üben Sie sanften, gleichmäßigen Druck auf die Injektionsstelle aus, um eine Blutung zu stoppen, und lassen Sie den Farbstoff fünf Minuten lang zirkulieren. Danach verschließen Sie die Operationsstelle mit Nähten. Drehen Sie die Maus vorsichtig auf den Bauch und platzieren Sie sie in den Kopfplattenhalter für Mäuse.

Für die in-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung bewegen Sie die chirurgische Vorrichtung zum Zwei-Photonen-Mikroskop und stellen Sie sicher, dass der Anästhesiegrad des Tieres konstant bleibt. Anschließend geben Sie eine kleine Menge 0,9 %iger Kochsalzlösung in das Reservoir der Kopfplatte und senken Sie das Mikroskopobjektiv so ab, dass es die Salzlösung berührt. Danach lokalisieren Sie mithilfe des Hellfeld-Objektivs den interessierenden Bereich.

Anschließend die Zwei-Photonen-Bildgebung starten. Ein Kapillarbett auf dem Bildschirm lokalisieren und diesen Bereich ebenfalls mithilfe des optischen Zooms vergrößern. Bilder der Kapillaren mit der Zwei-Photonen-Bildgebungsoftware aufnehmen.

Bei der in vitro-Zweiphotonen-Bildgebung einen Schnitt in die Kopfhaut des entkopften Mäuschen von den Interparietalknochen bis zu den Frontalknochen durchführen. Die Haut mit Zeigefinger und Daumen an den Seiten des Schädels fixieren, die feinen Schere unter dem medialen Interparietalknochen platzieren und den Schädel entlang der Sagittalsymphese schneiden, bis etwa drei Millimeter hinter dem Bregma-Punkt. Anschließend den Schädel vom Gehirn trennen und vorsichtig mit der Pinzette eventuelle Meningen von der Oberfläche des Gehirns entfernen.

Schieben Sie die Pinzette vorsichtig unter das Gehirn, um es vom Schädel zu lösen. Anschließend legen Sie das Gehirn in eine für Mäuse geeignete Gehirnmatrix und waschen es mit Tropfen von ACSF. Entfernen Sie danach einen millimeterdicken koronalen Gehirnschnitt.

Platzieren Sie den Gehirnschnitt auf eine konkave Objektträgerplatte mit ACSF, wobei der vordere Teil des Schnitts nach oben zeigt. Bedecken Sie den Gehirnschnitt dann vorsichtig mit einem Deckglas. Übertragen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch und geben Sie eine kleine Menge 0,9 %iger Salzlösung auf das Deckglas.

Senken Sie das Mikroskopobjektiv so weit ab, bis es mit der Salzlösung in Kontakt kommt. Suchen Sie anschließend die Mittellinie des Gehirns mit dem Hellfeld-Objektiv. Beginnen Sie nun mit der Zwei-Photonen-Bildgebung und lokalisieren Sie die Mittellinie erneut mithilfe des 25x-Objektivs.

Erreichen Sie dies, indem Sie an der kortikalen Oberfläche des koronalen Schnitts nach dem Längsspalt suchen. Platzieren Sie dann die rechte Kante des Bildschirms entlang der Mittellinie und verschieben Sie den Betrachtungsbildschirm seitlich über drei vollständige Bilder. Ermitteln Sie die Tiefe, bei der die Kapillaren auf dem Bildschirm gerade noch sichtbar sind.

Danach die Fokusebene um zusätzliche 20 Mikrometer absenken, um die Oberseite des Z-Stapels zu bestimmen. Die Bildstärke auf einen Mikrometer einstellen. Den Bildschirm um 100 Mikrometer absenken und die Laserleistung dabei so anpassen, dass weniger als ein Prozent der Pixel überbelichtet sind.

Erwerben Sie abschließend den Z-Stack. In dieser Abbildung wird nach der Vorbereitung des Gehirnschnitts ein Bildgebungsareal in einem Abstand von etwa 1,5 Millimetern von der Mittellinie lokalisiert. Ein Z-Stack mit 100 Mikrometern erzeugt ein dreidimensionales Bild, das für die Analyse in der Amira Analytical Software verwendet wird.

Das Kapillarnetz wird anschließend manuell nachgezeichnet, indem Knoten am Anfang und Ende einer Kapillare oder an jeder Stelle gesetzt werden, an der eine Kapillare in eine andere verzweigt. Dies erzeugt ein vollständig skelettisiertes Bild, aus dem die morphologischen Parameter automatisch extrahiert werden. Die Anzahl der Kapillarknoten, Segmente, die mittlere Segmentlänge sowie die gesamte Segmentlänge können mittels zweiphotonischer ex vivo-Bildgebung von Mäusehirnschnitten ermittelt werden.

Hier wird mittels In-vivo-Bildgebung ein zweidimensionales Bild der Kapillarnetze erzeugt, bei dem der Kapillardurchmesser extrahiert und das gesamte Kapillarvolumen unter Verwendung des Kapillardurchmessers und der Gesamtlänge der Segmente, die aus der Ex-vivo-Bildgebung gewonnen wurde, berechnet werden kann. Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann das Verfahren in drei Stunden und dreißig Minuten abgeschlossen werden, sofern es ordnungsgemäß durchgeführt wird. Während der Durchführung des Verfahrens ist es wichtig, schnell vorzugehen, während gleichzeitig eine stabile Anästhesietiefe aufrechterhalten wird, da Isofluran eine Vasodilatation kortikaler Kapillaren hervorrufen kann, was die Daten verfälschen würde.

Während dieses Verfahrens können weitere kapillare Parameter erfasst werden, wie beispielsweise die Erythrozyten-Geschwindigkeit oder der Erythrozyten-Fluss, die ein tieferes Verständnis der pathogenetischen Veränderungen bei HIV-assoziierten neurokognitiven Störungen und anderen neurodegenerativen Erkrankungen ermöglichen. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.