Die Quantifizierung der zerebrale vaskuläre Architektur unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Veränderungen in den kortikalen Kapillarnetzwerken nach längerer Exposition gegenüber dem HIV-Virotoxin tat. Diese Methode kann helfen, wichtige Veränderungen in der kortikalen Kapillarmorphologie zu untersuchen, die zur Pathogenese von HIV-assoziierten neurokognitiven Störungen beitragen können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine physiologisch genaue Quantifizierung mehrerer morphologischer Parameter der Kapillare ermöglicht.

Diese Methode kann jedoch einen Einblick in die Pathogenese von HIV-assoziierten neurokognitiven Störungen geben. Es kann auch bei anderen Krankheiten angewendet werden, bei denen Gefäßveränderungen auftreten, wie z. B. bei der Alzheimer-Krankheit. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie künstliches Tränengel auf die Augen einer betäubten Maus auftragen.

Rasieren Sie anschließend den Kopf mit einem Elektrorasierer. Tragen Sie dann Povidon-Jodlösung auf, um die Kopfhaut zu sterilisieren, und lassen Sie sie trocknen. Entfernen Sie unter einem Lichtmikroskop die Kopfhaut des Tieres, um die Scheitelknochen, die kaudalen Stirnknochen und den Bregmapunkt vollständig freizulegen.

Tragen Sie eine kleine Menge einer zehnprozentigen Eisenchloridlösung auf den Schädel auf, um die Membran zu trocknen und leicht zu entfernen. Entfernen Sie anschließend die getrocknete Membran, indem Sie den Schädel vorsichtig mit der Pinzette abkratzen. Tragen Sie dann eine dünne Schicht Kleber um das Kopfplattenfenster auf.

Drücken Sie die Kopfplatte vorsichtig gegen den Schädel der Maus, um den interessierenden Bereich in der Mitte des Fensters zu halten. Tragen Sie anschließend einen Tropfen Zahnzement auf die Kopfplatte auf, um den Kleber zu polymerisieren. Tragen Sie anschließend eine dünne Schicht Kleber entlang der Kante des Kopfplattenfensters auf, um ein Reservoir für die Kochsalzlösung zu schaffen.

Sobald der Kleber getrocknet ist, schrauben Sie die Kopfplatte in den Kabelbaum der Mauskopfplatte. Entfernen Sie den Kleber von der Kopfplatte mit einem Bohrer, der an einem Mikrotorp-Bohrer befestigt ist und auf 6.000 U/min eingestellt ist. Stoppen Sie alle 10 bis 15 Sekunden, um eine Überhitzung des Mausschädels zu vermeiden.

Beginnen Sie danach mit einem neuen Bohrer, den Schädel mit einem Mikro-Torp-Bohrer auszudünnen, der auf 4.000 U/min eingestellt ist. Bewegen Sie den Bohrer sanft über den Schädel, ohne direkten Druck nach unten. Sobald der Schädel vollständig ausgedünnt ist, lösen Sie die Maus von der Halterung und legen Sie sie auf den Rücken.

Tapen Sie beide hinteren Gliedmaßen vorsichtig ab, um die medialen Oberschenkel deutlich freizulegen. Entfernen Sie dann die Haare über beiden medialen Oberschenkeln und desinfizieren Sie die Operationsstelle, indem Sie die Oberschenkel mit Povidon-Jod abdecken. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die Haut am medialen rechten Oberschenkel, oberhalb der Oberschenkelvene und der Arterie.

Tragen Sie etwa drei bis fünf Tropfen 0,9 % Kochsalzlösung auf die Operationsstelle auf. Trennen Sie dann die Oberschenkelvene von der Arterie, indem Sie stumpf in das femorale neurovaskuläre Bündel präparieren. Legen Sie nun zwei drei Zentimeter große chirurgische Nahtstücke im Abstand von etwa einem Zentimeter unter die Oberschenkelarterie.

Drehen Sie die obere Naht im Uhrzeigersinn, um ein vaskuläres Tourniquet zu schaffen, das dazu beiträgt, einen übermäßigen Blutverlust während der Katheterisierung zu verhindern. Anschließend wird mit einer Federschere ein kleiner Schnitt in die Oberschenkelarterie gesetzt, wo später der Katheter eingeführt wird, um die physiologischen Parameter der Maus zu überwachen. Entfernen Sie bei diesem Verfahren die Haut am medialen linken Oberschenkel der Maus.

Als nächstes lokalisierst du die Oberschenkelvene. Mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 30-Gauge-Nadel werden 130 Mikroliter der Fluoreszenzfarbstofflösung aufgezogen. Injizieren Sie 100 Mikroliter des Farbstoffs langsam in die Oberschenkelvene.

Nachdem Sie die Nadel entfernt haben, üben Sie gleichmäßigen, sanften Druck auf die Injektionsstelle aus, um Blutungen zu stoppen, und lassen Sie den Farbstoff fünf Minuten lang zirkulieren. Verschließen Sie dann die Operationsstelle mit Nähten. Drehen Sie die Maus vorsichtig auf den Bauch und legen Sie sie in den Gurt der Mauskopfplatte.

Bewegen Sie für die In-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung das chirurgische Gerät an das Zwei-Photonen-Mikroskop und stellen Sie sicher, dass das Anästhesieniveau des Tieres aufrechterhalten wird. Geben Sie anschließend eine kleine Menge 0,9 % Kochsalzlösung in das Kopfplattenreservoir und das untere Mikroskopobjektiv, so dass es mit der Kochsalzlösung in Kontakt kommt. Lokalisieren Sie dann den interessierenden Bereich mit dem Hellfeld-Betrachtungsobjektiv.

Beginnen Sie anschließend mit der Zwei-Photonen-Bildgebung. Lokalisieren Sie ein Kapillarbett auf dem Bildschirm und vergrößern Sie diesen Bereich auch mit dem optischen Zoom. Nehmen Sie Bilder der Kapillaren mit der Zwei-Photonen-Bildgebungssoftware auf.

Für die ex vivo Zwei-Photonen-Bildgebung machen Sie einen Schnitt in der Kopfhaut von den interparietalen Knochen bis zu den Stirnknochen der enthaupteten Maus. Befestigen Sie die Haut mit dem Zeigefinger und dem Daumen an den Seiten des Schädels, platzieren Sie die extra feine Schere unter dem medialen interparietalen Knochen und schneiden Sie den Schädel entlang der sagittalen Naht bis etwa drei Millimeter nach dem Bregmapunkt. Trennen Sie dann den Schädel vom Gehirn und entfernen Sie vorsichtig mit der Pinzette alle Hirnhäute von der Oberfläche des Gehirns.

Schieben Sie die Pinzette vorsichtig unter das Gehirn, um sie vom Schädel zu befreien. Legen Sie anschließend das Gehirn in eine Gehirnmatrix, die speziell für Mäuse geeignet ist, und waschen Sie sie mit Tropfen ACSF. Als nächstes entfernen Sie einen millimeterdicken koronalen Hirnschnitt.

Platzieren Sie den Gehirnschnitt auf einem konkaven Objektträger mit ACSF, wobei der vorderste Teil des Abschnitts nach oben zeigt. Decken Sie dann die Hirnscheibe vorsichtig mit einem Glasdeckglas ab. Übertragen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch und geben Sie eine kleine Menge 0,9 % Kochsalzlösung auf das Deckglas.

Senken Sie das Mikroskopobjektiv ab, bis es mit der Kochsalzlösung in Berührung kommt. Lokalisieren Sie anschließend die Mittellinie des Gehirns mit dem Hellfeldobjektiv. Beginnen Sie nun mit der Zwei-Photonen-Bildgebung und lokalisieren Sie die Mittellinie erneut mit dem 25x-Objektiv.

Suchen Sie dazu nach der Längsfissur an der kortikalen Oberfläche des koronalen Abschnitts. Platzieren Sie dann den rechten Rand des Bildbildschirms auf der Mittellinie und verschieben Sie den Betrachterbildschirm seitlich über drei vollständige Frames. Lokalisieren Sie die Tiefe, in der die Kapillaren auf dem Bildschirm kaum sichtbar sind.

Senken Sie dann die Fokusebene um weitere 20 Mikrometer ab, um den oberen Rand des Z-Stapels zu bestimmen. Stellen Sie die Bildstärke auf einen Mikrometer ein. Senken Sie den Bildschirm um 100 Mikrometer ab und passen Sie die Laserleistung so an, dass weniger als ein Prozent der Pixel übersättigt sind.

Rufen Sie abschließend den Z-Stack ab. In dieser Abbildung befindet sich nach der Präparation des Hirnschnitts ein Bildgebungsbereich in einem Abstand von etwa 1,5 Millimetern von der Mittellinie. Ein 100-Mikrometer-Z-Stack erzeugt ein dreidimensionales Bild, das für die Analyse in der Amira Analytical Software verwendet wird.

Das Kapillarnetzwerk wird dann manuell verfolgt, indem Knoten am Anfang und Ende einer Kapillare oder an einer beliebigen Stelle platziert werden, an der sich eine Kapillare in eine andere verzweigt. Dadurch entsteht ein vollständig skelettiertes Bild, aus dem die morphologischen Parameter automatisch extrahiert werden. Die Anzahl der Kapillarknoten, Segmente, die mittlere Segmentlänge und die Gesamtsegmentlänge können mit Hilfe von zwei Photonen ex vivo Bildgebung von Hirnschnitten von Mäusen extrahiert werden.

Hierbei wird ein zweidimensionales Bild der Kapillarnetzwerke durch in vivo Bildgebung erstellt, in dem der Kapillardurchmesser extrahiert und das Gesamtkapillarvolumen unter Verwendung des Kapillardurchmessers und der Gesamtsegmentlänge aus der ex vivo Bildgebung berechnet werden kann. Einmal gemeistert, kann dieses Verfahren in dreieinhalb Stunden abgeschlossen werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, schnell zu handeln und gleichzeitig ein konstantes Anästhesieniveau aufrechtzuerhalten, da Isofluran eine Vasodilatation der kortikalen Kapillaren verursachen kann, wodurch die Daten verzerrt werden.

Während dieses Verfahrens können andere Kapillarparameter wie die Geschwindigkeit der roten Blutkörperchen oder der Fluss der roten Blutkörperchen gewonnen werden, die ein tieferes Verständnis der pathogenen Veränderungen ermöglichen können, die bei HIV-assoziierten neurokognitiven Störungen und anderen neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet werden. Viel Glück bei Ihren Experimenten.