Name: Die Quantifizierung der zerebrale vaskuläre Architektur unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-12T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung zerebraler Kapillarnetzwerke mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie im Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation. Diese Methode ermöglicht die physiologisch genaue Analyse vaskulärer Veränderungen.

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Wir danken Maria Jepson, Dr. Paivi Jordan und Dr. Linda Callahan von der University of Rochester Multiphoton Core für ihre technische Beratung während der Fertigstellung dieses Protokolls. Wir danken auch Dr. Changyong Feng für die fachkundige statistische Beratung und Dr. Maiken Nedergaard vom University of Rochester Medical Center für das in dieser Arbeit verwendete Kopfplattendesign. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse T32GM007356 und R01DA026325 der National Institutes of Health (NIH) unterstützt; und durch das University of Rochester Center for AIDS Research Grant P30AI078498 (NIH).

Die Universität von Rochester Universität Ausschuss für Tier Ressourcen genehmigt alle in diesem Papier durchgeführt Verfahren. 1. Präoperative Vorbereitung (und Mäusen) <ol><li> Bereiten Sie den OP-Bereich mit allen erforderlichen Geräten haben. Sterilisieren Sie alle während des Verfahrens zuvor mit 70% Ethanol verwendeten Werkzeuge. Optional können Sie eine Glasperlen Sterilisators oder Autoklaven, um die Werkzeuge zu sterilisieren. </li><li> Platzieren Sie die Maus in einer Isofluran Induktionskammer zu einer Isofluran Verdampfer verbunden ist. Eingestellt Isofluran Ebenen zu 4% bei einer Rate von 1 L / min. Anmerkung: Für die Experimente hier berichteten, Mäuse mit einer Doxycyclin (DOX) induzierbaren HIV-1-Tat-Transgens durch astrozytenspezifischer gliafibrilläres Protein (GFAP) -Promotor (HIV Tat-Tg-Mäusen) angetrieben 10 wurden verwendet, um die Wirkung von HIV zu untersuchen -1 induzierte Neuroentzündung auf die zerebrale Gefäßstruktur, wie zuvor beschrieben, 7,10. </li><li> Spitze vorsichtig die Induktionskammer, um die Maus zu beobachten &amp;# 39; s Stellreflexes. Sobald die Stellreflexes unterdrückt worden ist, setzen Sie die Isofluran-Level auf 2% und leiten den Luftstrom aus der Induktionskammer zu dem Nasenkegel an der Operationstisch. </li><li> Bewegen sich schnell mit der Maus aus der Induktionskammer zu dem Wasser aufgegossen Heizkissen. Fahren Sie mit Isofluran (1,5-2%) durch die Nase Kegel gelten. Passen Anästhesie nach individuellen Maus Toleranz durch Atemfrequenz (RR) Überwachung bewertet. Hinweis: physiologischen Gasparameter verändert Hirndurchblutung und Gefäßdurchmesser Beurteilung kann die Vertiefung der RR zu stören. Versuchen, RR zwischen 55-65 Atemzüge pro Minute zu halten. Herzfrequenz (HR) verwendet Beurteilung der Narkosetiefe ist; Halten HR zwischen 300-450 Schlägen pro Minute auf physiologische Veränderungen Gefäßdurchmesser zu verhindern. Typischerweise wird eine ausreichende Anästhesie zwischen 1,5-2,0% Isofluran werden bei 1 l / min bei einem gegebenen Maus. </li><li> Führen Sie eine Zehe Prise weiter prüfen Sie die Tiefe der Anästhesie. Wenn die Maus nicht reagiert, commENCE die chirurgischen Verfahren. </li></ol> 2. Herstellung der Thin-Schädelhirn Fenster <ol><li> Künstliche Tränen Gel für die Augen der Maus. Vollständig zu entfernen die Haare aus der Kopfhaut der Maus mit einer Schere oder einem elektrischen Rasierer. </li><li> Sterilisieren der Kopfhaut durch Anlegen Povidonjodlösung; Trocknen lassen. Dann, unter einem Lichtmikroskop, entfernen Sie die Haut von der Kopfhaut der Maus, komplett Aussetzen der Scheitelbeine, Schwanzstirnknochen und Bregma Kennzeichnung. </li><li> Sie eine kleine Menge einer 10% Eisenchloridlösung auf den Schädel, um die Membranen zum leichten Entfernen zu trocknen. Entfernen Sie die getrockneten Membranen mit den # 5/45 Pinzette vorsichtig Abkratzen der Schädel. </li><li> Tragen Sie eine dünne Schicht Kleber auf der Kopfplatte Fenster. Drücken Sie den Kopfplatte gegen den Schädel der Maus, halten Sie den Bereich von Interesse in der Mitte des Fensters. Einen Tropfen Zahnzement auf der Kopfplatte, um den Kleber zu polymerisieren. </li><li> Eine dünne SchichtKlebstoff entlang der Kante der Kopfplatte Fenster, ein Reservoir, in welchem ​​zu Kochsalz Halt. Nachdem der Leim getrocknet ist, schrauben Sie die Kopfplatte in die Maus Kopfplatte Baum. Hinweis: die Maus Kopfplatte Baum in diesem Verfahren verwendet wird, ist eine Struktur mit einer Metallbase und zwei Metallsäulen. In jeder Spalte gibt es einer Feder und einer Flügelmutter. Die Kopfplatte ist auf der Oberseite der Feder angeordnet, und die Flügelmutter angezogen, bis der Kopf waagerecht steht und sich nicht bewegt. </li><li> Entfernen Sie alle Kleber von der Kopfplatte Fenster mit einem Bohrer auf eine Microtorque Bohrer bei 6.000 Umdrehungen pro Minute eingestellt angebracht. Stoppen Sie alle 10-15 sec, um eine Überhitzung der Maus Schädel, die in strukturelle Schäden an Schiffen zur Folge haben können, zu verhindern. <ol><li> Mit einem neuen Bohrer, platzieren Sie den Microtorque Bohrer 1,5 mm seitlich von der Mittellinie (ein Drittel des Durchmessers der Kopfplatte Fenster). Fangen Sie an, dünnen den Schädel in der Umgebung dieser Stelle bei 4.000 Umdrehungen pro Minute. Bewegen Sie den Bohrer sanft über den Schädel, die keinen direkten Druck nach unten. </li><li> Cease drilling alle 10-15 sec Überhitzung der Maus Schädels zu verhindern. Während dieser Zeit, entfernen Sie den angesammelten Staub mit einem Totenkopf Druckluftbehälter. </li><li> Verwenden Tropfen Kochsalzlösung auf RT Schädels für 5-10 sec abkühlen. Alle Flüssigkeit entfernen Sie vorsichtig mit einem weichen Tuch, um Schädel Ausdünnung fortsetzen. </li></ol></li><li> Für die endgültige Verdünnung des Schädels, stellen ein geringes Volumen von Kochsalzlösung in der Kopfplatte und Behälter leicht fegen eine Dentalmikroklinge über den Bereich von Interesse, bis kleine Gefäße sind deutlich sichtbar. </li></ol> 3. Überwachung von physiologischen Parametern <ol><li> Sobald der Schädel vollständig ausgedünnt, trennen Sie die Maus aus der Halterung und legen Sie sie auf dem Rücken. Gently kleben Sie beide Hinterbeine, um die mediale Oberschenkel deutlich aus. </li><li> Entfernen Sie das Haar über beiden medialen Oberschenkel mit einer Schere oder einem elektrischen Rasierer. Desinfizieren Sie die Operationsstelle durch das Abdecken der Oberschenkel mit PVP-Jod. </li><li> Sie die Haut an der medialen rechten Schenkel über die Oberschenkelveneund Arterie mit Hilfe der # 5 Pinzette. Ziehen Sie die Haut nach oben und mit einer Schere zu schneiden und entfernen Sie die Haut. Anmerkung: die linken Oberschenkel im Falle von chirurgischen Komplikationen (Gefäßanomalien aufgebrochenen Zellen) vorbehalten. </li><li> Gelten etwa 3-5 Tropfen 0,9% -iger Salzlösung zur Operationsstelle. Dies ermöglicht eine größere Vergrößerung der Schiffe, sowie das Einhalten der Website mit Feuchtigkeit versorgt und verhindert das Trocknen der Gefäße. Trennen Sie die Oberschenkelvene von Arterie durch stumpf sezieren in die Oberschenkelgefäßnervenbündel mit zwei # 5/45 Pinzette. </li><li> Stellen zwei 3 cm Stücke von chirurgischem Nahtmaterial unterhalb der Femoralarterie ungefähr 1 cm auseinander. Drehen Sie den oberen Faden im Uhrzeigersinn, um eine vaskuläre Blutsperre, die helfen, übermäßigen Blutverlust während der Katheterisierung zu verhindern erstellen. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Oberschenkelarterie mit Hilfe der Feder Schere. Platzieren des Katheters in der Arterie durch den Einschnitt und vorzuschieben, bis der Katheter sicher innerhalb der Arterie. </li><li&gt; Aufdrehen des oberen Fadens (Tourniquet) auf Lecks und korrekten Katheterplatzierung zu bewerten. Sicherung des Katheters in der Oberschenkelarterie durch die Kopplung zwei Knoten um den Katheter innerhalb des Behälters mit Hilfe der Nähte. </li><li> Injizieren 10 ul Heparin (100 IU / ml) durch den Katheter, um die Blutgerinnung zu verhindern. Dann schließen Sie die chirurgisch rechten Oberschenkel durch Zusammennähen der Haut zusammen mit einem 4-0 Naht in einer einfachen unterbrochenen Muster. </li><li> Injizieren Sie 50 ul Urethan (1,2 mg / g) intraperitoneal in der rechten unteren Quadranten. Fünf Minuten später wurden weitere 50 ul Einspritzung in den linken unteren Quadranten für eine Gesamtmenge von 100 ul intraperitoneale Urethan wiederholen. Isofluran Niveaus langsam zurück auf etwa 0,25%, während gleichzeitig rechecking Maus für die Tiefe der Anästhesie. Anm: Nadel oberflächlichen innerhalb der Bauchhöhle entlang der hinteren Bauchwand, so dass sie nicht den Darm zu perforieren. Dies kann durch Kneifen der Bauch rectus mu erreicht werdenscles weg von den Eingeweiden und dann Injizieren. </li><li> Verwendung einer Kapillare, sammeln eine 40 ul-Probe von arteriellem Blut aus dem Katheter. Befestigen des Katheters an die Blutdruckwandler mit einer Kochsalzlösung gefüllten Vierwegehahn und Heparin Spritze angebracht. </li><li> Band der Blutdruckwandler der chirurgischen Vorrichtung, um das unbeabsichtigte Entfernen des Katheters zu verhindern. Beginnt die Überwachung des mittleren arteriellen Drucks. </li><li> Legen Sie die Blut gefüllte Kapillare in ein Blutgasanalysegerät Eintrittsöffnung. Sobald alles Blut extrahiert worden ist, entfernen Sie die Kapillare aus der Eintrittsöffnung. Die O 2 und CO 2 Blutgaswerte werden auf einem Papier aus dem Blutgasanalysegerät gedruckt erscheinen. </li></ol> 4. Injektion des fluoreszierenden Farbstoffs <ol><li> Klemmen Sie die Haut an der medialen linken Oberschenkel mit Hilfe der # 5 Pinzette. Ziehen Sie die Haut nach oben und mit einer Schere zu schneiden und entfernen Sie die Haut. Bereiten Dextran konjugierten rot emittierenden Rhodaminfarbstoff(70 kDa) (10 mg / kg in Salzlösung). </li><li> Finde die Oberschenkel vein.Using eine 1-ml-Spritze mit einer 30-G-Nadel befestigt ist, ziehen Sie eine vorher hergestellte Lösung aus einem Fluoreszenzfarbstoff zur Bildgebung an die 130 &amp; mgr; l Linie der Spritze geeignet. Entfernen Sie alle Luftblasen, indem der Farbstoff vollständig in die Spritze und die Spritze fest flicking Wand. <ol><li> Biegen Sie die 30 G-Nadel auf einer ca. 30-Grad-Winkel, indem Sie sie gegen eine harte Oberfläche Kegel Seite nach oben. Füllen Sie die Nadel mit dem Farbstoff und entsorgen Sie überschüssige Flüssigkeit, eine 100 ul-Probe verlassen. </li></ol></li><li> Spritzen Sie die 100 ul-Probe von Farbstoff langsam in die Oberschenkelvene. Nach dem Entfernen der Nadel, gelten ruhig, und Druck auf die Injektionsstelle, um Blutungen zu stoppen. Ermöglichen, dass der Farbstoff für 5 min zirkuliert. Hinweis: Alternativ kann die rechte Femoralvene stattdessen für die Fluoreszenzfarbstoffinjektion zur weiteren Blutverlust durch die Schaffung eines weiteren Operationsstelle zu verhindern. Darüber hinaus, wenn dasTier unkontrollierbar Blutungen von der Operationsstelle, kann dies ein Hinweis darauf, dass zu viel Heparin gegeben wurde, um den Katheter zu spülen. Wenn es keine Gerinnung innerhalb von 10-15 min und die Maus immer noch Blutungen, sollten Sie einen Neustart des Experiments mit einer neuen Maus. </li><li> Schließen Sie den linken Oberschenkel durch Zusammennähen der Haut zusammen mit einem 4-0 Naht, dann vorsichtig drehen Sie die Maus auf dem Bauch, und legen Sie sie in die Maus Kopfplatte Baum. </li></ol> 5. In Vivo Zwei-Photon Imaging <ol><li> Bewegen Sie die chirurgische Vorrichtung zu der Zwei-Photonen-Mikroskop, um sicherzustellen, um eine kontinuierliche Anästhesie Niveau zu halten. Eine kleine Menge an 0,9% iger Kochsalzlösung in der Kopfplatte Reservoir und Absenken des Mikroskopobjektivs, so daß er in Kontakt mit der Salzlösung kommt. Suchen Sie den Bereich von Interesse unter Verwendung der Hellfeld-Betrachtung Ziel </li><li> Stellen Sie die Zwei-Photonen-Laser-Anregung zu einer Wellenlänge für das Fluoreszenz-Farbstoff geeignet. Beginnen Zwei-Photonen-Imaging mit der 25x oIEL. Man beachte, dass in diesen Experimenten verwendeten wir eine Dextran zu einem rot emittierenden Leucht Rhodamin-Farbstoff, der bei einer Wellenlänge von 780 nm angeregt wurde, konjugiert. A 607/36 Emissions Filterdurchlaßbereich, um die Fluoreszenz von dem Farbstoff zu erfassen, und eine Bandpassemissionsfilter 480/20 wurde verwendet, um den arteriellen Autofluoreszenz nachzuweisen </li><li> Suchen Sie eine Kapillare auf dem Sichtschirm Bett, und vergrößern diesen Bereich mit dem optischen Zoom 2. Acquire Bilder der Kapillaren mit Hilfe der Zwei-Photonen-Imaging-Software. </li><li> Nach der vollständigen Bildgebung ist, zu opfern, die Maus durch Genickbruch folgte durch Enthauptung. </li></ol> 6. Ex Vivo Zwei-Photonen-Imaging <ol><li> Mit den extra feine Schere, einen Einschnitt in die Kopfhaut vor den interparietal Knochen zu den Stirnknochen der Maus. Sichern Sie die Haut an den Seiten des Schädels mit dem Zeigefinger und Daumen. </li><li> Legen Sie die zusätzlichen feinen Schere unter dem medialen Inkabein und schnitt den Schädel entlang der Pfeilnaht. Stoppen Schneiden des Schädels ca. 3 mm nach dem Bregma Kennzeichnung. Anmerkung: Bewerben Aufwärtsdruck beim Schneiden des Schädels Schneiden des Gehirns zu verhindern. </li><li> Mit Hilfe der # 5 Zangen, trennen den Schädel aus dem Gehirn und entfernen Sie vorsichtig alle Hirnhäute von der Oberfläche des Gehirns. Verbleibende Hirnhäute kann versehentlich zerfleischen das Gehirn; extreme Vorsicht ist geboten, um dies zu vermeiden. Schieben Sie die # 5 Zange unter dem Gehirn fort langsam nach vorne, bis Gehirn frei von Schädel. Hinweis: dass Abwärtsdruck sollten, um verwendet werden, um zu vermeiden Punktion des Gehirns. </li><li> Legen Sie das Gehirn in einer Hirnschnittwerkzeug speziell für Mäuse. Durch Tüpfeln künstliche Zerebrospinalflüssigkeit über das Gehirn waschen das Gehirn. </li><li> Entfernen Sie einen 2 mm koronalen Abschnitt des Gehirns von Bregma 0 bis Bregma -2. Setzen Sie den Frontalschnitt auf einen konkaven Glasobjektträger, die künstliche Zerebrospinalflüssigkeit mit dem 0 Bregma (die meisten Hirn Teil des Abschnitts) nach oben zeigt. Abdeckung vorsichtig das Gehirn slEis mit einem Deckglas. Hinweis: Vermeiden Sie Druck auf die Glas einmal auf das Gehirn Abschnitt gelegt, da dies die Gefäßarchitektur verformen. </li><li> Die Objektträger in dem Mikroskoptisch und legen Sie eine kleine Menge von 0,9% Salzlösung auf das Deckglas. Senken das Mikroskopobjektiv, bis es in Kontakt mit der Salzlösung kommt. Suchen Sie die Mittellinie des Gehirns mit Hilfe der Hellfeld Ziel. </li><li> Beginnen Zwei-Photonen-Imaging und suchen Sie die Mittellinie wieder mit dem 25x Ziel. Erreichen dies durch die Suche nach der Längsfissur an der kortikalen Oberfläche des Frontalschnitt. Setzen Sie den rechten Rand des Abbildungsschirm auf der Mittellinie und bewegen Sie den Viewer-Bildschirm über seitlich drei komplette Frames (etwa 1,5 mm von der Mittellinie). Man beachte, dass in diesen Experimenten identisch mit denen in der Anmerkung zu Schritt 5.2 wurden die Bildaufnahmeparameter. </li><li> Suchen Sie die Tiefe, in der Kapillaren auf dem Sichtschirm kaum sichtbar. Senken Sie die Fokusebene eine zusätzliche 20&amp; mgr; m, um die Spitze der z-Stapel zu bestimmen. </li><li> Stellen Sie die Bilddicke bis 1 um. Senken Sie den Blick auf Bildschirm 100 um und passen Laserleistung im ganzen, so dass weniger als 1% der Pixel übersättigt sind. Hinweis: Die Z-Stapel-Bilder werden aus einer Reihe von 100 aufeinanderfolgenden 500x500x1 um Bilder zusammengestellt. Je größer der Z-Stapel desto genauer die Nachbearbeitung Berechnungen wird. Im Allgemeinen versuchen, einen z-Stapel 100 um oder mehr zu sammeln. </li><li> Drücken Sie auf das Symbol XY Wiederholen gefolgt von der benachbarten XY-Symbol. Sobald die Z-Stapel abgeschlossen ist, drücken Sie die Serie Fertig Symbol und speichern Sie die Datei. </li></ol> 7. Datenverarbeitung <ol><li> Öffnen Sie ein in-vivo-Bild Kapillare im ImageJ Software. Die Pixel zu Abstandsverhältnis auf Basis der Zwei-Photonen-Software erhaltenen Werte manuell einstellen. <ol><li> Wählen Sie die * gerade * Symbol aus dem Menü Werkzeuge. Zeichnen Sie eine Linie, die sich von einer Kapillarwand auf die oppoWebsite Kapillarwand, und notieren Sie die Länge von ImageJ vorgesehen. Man beachte, daß es notwendig sein kann, um in dem Bild, um die Kanten der Kapillarwände anschaulich machen zoomen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 7.1.1 an verschiedenen Stellen entlang der Kapillare sowie für mehrere Kapillaren in dem Bild. </li></ol></li><li> Öffnen Sie die Datei z-Stapel in die Analysesoftware wie Amira. Wählen Sie das Filament Editor-Symbol aus der Unterdrucktastenleiste <ol><li> Gesetzt den Betrachter Dicke auf etwa 20 zu bewegen, um den Betrachter entweder oben oder unten in der z-Stack. </li><li> Wählen Sie das Trace-Symbol und bewegen Sie den Cursor über das geladene Bild. Platz Knoten auf den Kapillaren an den in 2C beschriebenen Standorten; Segmente werden automatisch zwischen benachbarten Knoten angezeigt. Spuren Kapillaren während des gesamten Z-Stapel. Hinweis: es wird notwendig sein, um Knoten zwischen Endpunkten und Verzweigungspunkten, um die Kapillaren thr Spuren platzierenoughout der Z-Stapel. </li><li> Um diese Knoten zu entfernen, klicken Sie auf Entfernen Zwischensymbol. Hinweis: Dies kann eine fehlerhafte geschleift Segmente, die manuell durch Auswahl der Schleife mit dem Buchen Einzelsymbol, und wählen Sie den Remove Selected Symbol entfernt werden müssen, zu erstellen. Wenn Schleifen weiterhin während der Ablaufverfolgung in der Umgebung angezeigt werden, ist es wahrscheinlich, dass die Knoten wurden auf verschiedenen Kapillaren platziert. </li><li> Sobald die Rückverfolgung abgeschlossen ist, wählen Sie das Symbol Graph Info, eine Tabellenkalkulation, die automatisch extrahierten Gefäßparameter enthält, zu öffnen. Die Anzahl der Knoten und Segmente sind auf der Hauptansicht Bildschirm zur Verfügung. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das hier beschriebene Verfahren kann angewendet werden, um Gehirn mikrovaskulären Strukturen in einer breiten Palette von experimentellen Modellen / Einstellungen zu analysieren. Für den Erfolg dieser Methode müssen drei wichtige Schritte gemeistert werden. Erstens muss die dünne Schädelfenster den Schädel oder die zugrunde liegenden Hirn nicht beschädigen. Es ist leicht, den Schädel während der Ausdünnung zu durchstechen oder zu einem Hitze induzierte Gefäßdurchlässigkeit. Dies kann mit einer Abbildungs ​​stört, wenn d...

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) dringt in das Gehirn während der akuten Phase der Virus-Infektion, und produktiv infiziert sowohl Mikroglia und Gehirn Makrophagen, was zu deren Aktivierung - und die Freisetzung von beiden Host-abgeleitete Entzündungsmediatoren und lösliche HIV-1 virotoxins wie Tat und gp120 (in 1,2 überprüft). Als Folge davon wird ein chronischer Zustand neuroinflammatorischen im ZNS, die vermutlich auf die Pathogenese der HIV-1-assoziierte neurokognitive Störungen (HAND) 3-5 beitragen etabliert. Chronische Überexpression von HIV-1 Tat oder Interleukin (IL) -17A im ZNS von Mäusen wurde gezeigt, dass in der mikrovaskulären rarefaction 6,7 führen. Dies eröffnet die Möglichkeit, dass eine chronische Neuroentzündung kann zur Pathogenese von Hand durch Wirkung auf die zerebrale Gefäßsystem beizutragen. Um diese Frage weiter zu prüfen, haben wir Methoden, um zerebrale vaskuläre struc Quantifizierung entwickeltturen. Dieser Beitrag beschreibt ein Verfahren zur Quantifizierung der Anzahl der Kapillar-Knoten, Kapillar Segmente bedeuten Segmentlänge, Gesamtsegmentlänge, bedeuten Kapillardurchmesser und Gesamt Kapillarvolumen mit In-vivo-Bildgebung von Kapillarnetzwerke durch eine dünne Schädel kortikalen Fenster (von zuvor beschriebenen modifizierten Protokolle) 8,9 sowie ex vivo-Abbildung von Gehirnschnitten unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie. Dieser kombinierte Ansatz sieht eine ganzheitliche Quantifizierung des zerebralen Gefäßparameter, da die in vivo-Dünn Schädel Kortikalisfenster ermöglicht die Erhaltung des zerebralen Umgebung während ex vivo-Abbildung von Kapillarnetzwerken in Hirnschnitten erlaubt die Rekonstruktion der vollständigen, dreidimensionalen Kapillarnetzwerke - die dann unter Verwendung im Handel erhältlicher Software quantifiziert werden kann.

<table><tbody><tr><td>Leica Mikroskop</td><td>Leica Inc.</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>High Intensity Illuminator</td><td>Dolan-Jenner</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Stryker &nbsp;</td><td>TP3E</td><td></td></tr><tr><td>T/PUMPE</td><td>Gaymar Industries, Inc.</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>TEC-4 Isofluran-Verdampfer</td><td>Datex Ohmeda</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>Künstliches Tränengel</td><td>Butler AHS</td><td>7312</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Jod-Lösung</td><td>Aplicare</td><td>52380-1855-9</td><td></td></tr><tr><td>Extra feine Bonner Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumot #5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Eisenchloridlösung</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-16</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel</td><td>Henkel</td><td>45404</td><td></td></tr><tr><td>Dental Cement</td><td>Stoelting</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>Microtoruqe II Handstück Kit</td><td>Pearson Dental</td><td>R14-0002</td><td></td></tr><tr><td>005 Fräser für Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Norland Blade (Dental Microblade)</td><td>Salvin Dental</td><td>6900</td><td></td></tr><tr><td>Urethan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td>Karzinogen der Gruppe 2B</td></tr><tr><td>Geflochtenes Nahtmaterial</td><td>Ethicon</td><td>735G</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Arterienkatheter</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>MAC-01</td><td>Das Ende des Katheters wurde manuell gedehnt, um seinen Durchmesser zu verringern.</td></tr><tr><td>Blutdruckmessgerät</td><td>World Präzisionsinstrumente</td><td>SYS-BP1</td><td></td></tr><tr><td>Blutdruckmesskopf und Kabel</td><td>World Präzisionsinstrumente</td><td>BLPR2</td><td></td></tr><tr><td>RAPIDLab Blutgasanalysator&nbsp;</td><td>Siemens&nbsp;</td><td>248</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; l Kapillarrohr</td><td>VWR</td><td>15401-413</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-Dextran (70.000 MW, 10 mg/kg in Kochsalzlösung gelöst)</td><td>Invitrogen</td><td>D-1830</td><td></td></tr><tr><td>Adult Mouse Brain Slicer Matrix</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphotonenmikroskop</td><td>Olypmus</td><td>FV-1000 MPE</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee Ti:Sa Laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td></td><td>Verfügbar bei http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Amira Software</td><td>Visage Imaging&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

die quantifizierung der zerebrale vaskuläre architektur unter verwendung von zwei-photonen-mikroskopie in einem mausmodell der hiv-induzierten neuroinflammation

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Eine Infektion mit dem humanen Immundefizienzvirus 1 (HIV-1) führt häufig zu HIV-1-assoziierten neurokognitiven Störungen (HAND) und ist gekennzeichnet durch einen chronischen neuroinflammatorischen Zustand innerhalb des Zentralnervensystems (ZNS), von dem angenommen wird, dass er hauptsächlich durch die viral vermittelte Aktivierung von Mikroglia und hirnresidenten Makrophagen angetrieben wird. Eine HIV-1-Infektion geht auch mit Veränderungen des zerebrovaskulären Blutflusses (CBF) einher, was die Möglichkeit erhöht, dass eine HIV-assoziierte chronische Neuroinflammation zu Veränderungen der CBF und/oder der zerebralen Gefäßarchitektur führen kann. Um diese Frage zu beantworten, haben wir ein Mausmodell für HIV-induzierte Neuroinflammation verwendet und getestet, ob eine langfristige Exposition gegenüber dieser entzündlichen Umgebung die Gefäße des Gehirns schädigen und zu einer Verdünnung der Kapillarnetzwerke führen kann. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Quantifizierung von Veränderungen der kortikalen Kapillardichte in einem Mausmodell für neuroinflammatorische Erkrankungen (HIV-1 Tat transgene Mäuse). Dieser verallgemeinerbare Ansatz verwendet sowohl die in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung von kortikalen Kapillaren durch ein dünnschädeliges kortikales Fenster als auch die ex vivo Zwei-Photonen-Bildgebung von kortikalen Kapillaren in Schnitten des Gehirns von Mäusen. Diese Verfahren erzeugen Bilder bzw. Z-Stack-Dateien von Kapillarnetzwerken, die dann einer quantitativen Analyse unterzogen werden können, um Veränderungen in der zerebralen Gefäßarchitektur zu beurteilen.

Die Dünn Schädel kortikalen Fenster können für die in vivo Zwei-Photonen-Imaging von kortikalen Kapillaren (Abbildung 1). Ein geeigneter Bereich für Bild zeigt zahlreiche, unterschiedliche Kapillaren (Abbildung 1A). Im gleichen Blickfeld gibt es keine arteriellen Zellwand Autofluoreszenz, und es kann weitere Fluoreszenzsignale, wie Kollagen Fluoreszenz, durch Erzeugung der zweiten Harmonischen 11 (1B) induziert werden...

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, mit der die Gefäßarchitektur im Gehirn mittels in vivo und ex vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie quantifiziert werden kann.

Die Quantifizierung der zerebrale vaskuläre Architektur unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Veränderungen in den kortikalen Kapillarnetzen nach längerer Exposition gegenüber dem HIV-Virotoxin Tat zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, wesentliche Veränderungen in der kortikalen Kapillarmorphologie zu untersuchen, die zur Pathogenese HIV-assoziierter neurokognitiver Störungen beitragen könnten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine physiologisch genaue Quantifizierung mehrerer morphologischer Parameter von Kapillaren ermöglicht.Obwohl diese Methode Einblicke in die Pathogenese von HIV-assoziierten neurokognitiven Störungen ermöglichen kann, ist sie ebenfalls auf andere Erkrankungen anwendbar, bei denen vaskuläre Veränderungen auftreten, wie beispielsweise die Alzheimer-Krankheit. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie künstliches Tränen-Gel auf die Augen einer anesthetisierten Maus auftragen.Als Nächstes rasieren Sie den Kopf mit einem elektrischen Rasierer. Anschließend tragen Sie eine Povidon-Jod-Lösung auf, um die Kopfhaut zu desinfizieren, und lassen sie trocknen. Unter einem Lichtmikroskop entfernen Sie die Kopfhaut des Tieres, um die Parietalbeine, die kaudalen Frontalbeine und den Bregma-Punkt vollständig freizulegen.Tragen Sie eine kleine Menge einer zehnprozentigen Eisen(III)-chlorid-Lösung auf den Schädel auf, um die Membran zum einfachen Entfernen zu trocknen. Entfernen Sie anschließend die getrocknete Membran, indem Sie vorsichtig mit der Pinzette über den Schädel kratzen. Tragen Sie danach eine dünne Schicht Klebstoff um das Fenster der Kopfplatte auf.Drücken Sie die Kopfplatte vorsichtig gegen den Schädel der Maus, um den interessierenden Bereich in der Mitte des Fensters zu positionieren. Anschließend geben Sie einen Tropfen Zahnzement auf die Kopfplatte, um den Klebstoff zu polymerisieren. Danach tragen Sie eine dünne Schicht Klebstoff entlang der Kante des Fensters der Kopfplatte auf, um ein Reservoir zur Aufnahme der Kochsalzlösung zu bilden.Nachdem der Kleber getrocknet ist, schrauben Sie die Kopfplatte in das Kopfplattenharness der Maus ein. Entfernen Sie jeglichen Kleber vom Fenster der Kopfplatte mit einem Bohrer, der an eine Mikrotorpedo-Bohrmaschine angeschlossen ist und auf 6.000 U/min eingestellt ist. Unterbrechen Sie alle 10 bis 15 Sekunden, um eine Überhitzung des Schädels der Maus zu vermeiden.Danach mit einem neuen Bohrer beginnen, den Schädel mit einem auf 4.000 U/min eingestellten Mikrotrepanbohrer zu dünneren. Den Bohrer sanft über den Schädel bewegen, ohne direkten nach unten gerichteten Druck auszuüben. Sobald der Schädel vollständig ausgedünnt ist, das Tier vom Halter lösen und auf den Rücken legen.Fixieren Sie beide Hintergliedmaßen vorsichtig mit Klebeband, um die mediale Oberschenkelregion deutlich freizulegen. Anschließend entfernen Sie die Behaarung über beiden medialen Oberschenkeln und desinfizieren die Operationsstelle, indem Sie die Oberschenkel mit Povidon-Iod bedecken. Entfernen Sie danach vorsichtig die Haut am medialen rechten Oberschenkel oberhalb der Vena femoralis und der Arteria femoralis.Geben Sie etwa drei bis fünf Tropfen 0,9 % Salzlösung auf die Operationsstelle. Trennen Sie dann die femorale Vene von der Arterie, indem Sie den femoralen neurovaskulären Bündel stumpf dissezieren. Legen Sie nun zwei drei Zentimeter lange Stücke chirurgischen Nahtmaterials unter die femorale Arterie, etwa einen Zentimeter voneinander entfernt.Drehen Sie die obere Naht im Uhrzeigersinn, um einen vaskulären Blutstau zu erzeugen, der während der Katheterisierung übermäßigen Blutverlust verhindert. Anschließend machen Sie mit einer Feder-Schere einen kleinen Schnitt in die A. femoralis, an der später der Katheter eingeführt wird, um die physiologischen Parameter der Maus zu überwachen. Entfernen Sie in diesem Verfahren die Haut am medialen linken Oberschenkel der Maus.Als Nächstes die Vena femoralis lokalisieren. Mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 30-Gauge-Nadel 130 Mikroliter der fluoreszierenden Farbstofflösung aufziehen. Langsam 100 Mikroliter des Farbstoffs in die Vena femoralis injizieren.Nachdem die Nadel entfernt wurde, üben Sie sanften, gleichmäßigen Druck auf die Injektionsstelle aus, um eine Blutung zu stoppen, und lassen Sie den Farbstoff fünf Minuten lang zirkulieren. Danach verschließen Sie die Operationsstelle mit Nähten. Drehen Sie die Maus vorsichtig auf den Bauch und platzieren Sie sie in den Kopfplattenhalter für Mäuse.Für die in-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung bewegen Sie die chirurgische Vorrichtung zum Zwei-Photonen-Mikroskop und stellen Sie sicher, dass der Anästhesiegrad des Tieres konstant bleibt. Anschließend geben Sie eine kleine Menge 0,9 %iger Kochsalzlösung in das Reservoir der Kopfplatte und senken Sie das Mikroskopobjektiv so ab, dass es die Salzlösung berührt. Danach lokalisieren Sie mithilfe des Hellfeld-Objektivs den interessierenden Bereich.Anschließend die Zwei-Photonen-Bildgebung starten. Ein Kapillarbett auf dem Bildschirm lokalisieren und diesen Bereich ebenfalls mithilfe des optischen Zooms vergrößern. Bilder der Kapillaren mit der Zwei-Photonen-Bildgebungsoftware aufnehmen.Bei der in vitro-Zweiphotonen-Bildgebung einen Schnitt in die Kopfhaut des entkopften Mäuschen von den Interparietalknochen bis zu den Frontalknochen durchführen. Die Haut mit Zeigefinger und Daumen an den Seiten des Schädels fixieren, die feinen Schere unter dem medialen Interparietalknochen platzieren und den Schädel entlang der Sagittalsymphese schneiden, bis etwa drei Millimeter hinter dem Bregma-Punkt. Anschließend den Schädel vom Gehirn trennen und vorsichtig mit der Pinzette eventuelle Meningen von der Oberfläche des Gehirns entfernen.Schieben Sie die Pinzette vorsichtig unter das Gehirn, um es vom Schädel zu lösen. Anschließend legen Sie das Gehirn in eine für Mäuse geeignete Gehirnmatrix und waschen es mit Tropfen von ACSF. Entfernen Sie danach einen millimeterdicken koronalen Gehirnschnitt.Platzieren Sie den Gehirnschnitt auf eine konkave Objektträgerplatte mit ACSF, wobei der vordere Teil des Schnitts nach oben zeigt. Bedecken Sie den Gehirnschnitt dann vorsichtig mit einem Deckglas. Übertragen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch und geben Sie eine kleine Menge 0,9 %iger Salzlösung auf das Deckglas.Senken Sie das Mikroskopobjektiv so weit ab, bis es mit der Salzlösung in Kontakt kommt. Suchen Sie anschließend die Mittellinie des Gehirns mit dem Hellfeld-Objektiv. Beginnen Sie nun mit der Zwei-Photonen-Bildgebung und lokalisieren Sie die Mittellinie erneut mithilfe des 25x-Objektivs.Erreichen Sie dies, indem Sie an der kortikalen Oberfläche des koronalen Schnitts nach dem Längsspalt suchen. Platzieren Sie dann die rechte Kante des Bildschirms entlang der Mittellinie und verschieben Sie den Betrachtungsbildschirm seitlich über drei vollständige Bilder. Ermitteln Sie die Tiefe, bei der die Kapillaren auf dem Bildschirm gerade noch sichtbar sind.Danach die Fokusebene um zusätzliche 20 Mikrometer absenken, um die Oberseite des Z-Stapels zu bestimmen. Die Bildstärke auf einen Mikrometer einstellen. Den Bildschirm um 100 Mikrometer absenken und die Laserleistung dabei so anpassen, dass weniger als ein Prozent der Pixel überbelichtet sind.Erwerben Sie abschließend den Z-Stack. In dieser Abbildung wird nach der Vorbereitung des Gehirnschnitts ein Bildgebungsareal in einem Abstand von etwa 1,5 Millimetern von der Mittellinie lokalisiert. Ein Z-Stack mit 100 Mikrometern erzeugt ein dreidimensionales Bild, das für die Analyse in der Amira Analytical Software verwendet wird.Das Kapillarnetz wird anschließend manuell nachgezeichnet, indem Knoten am Anfang und Ende einer Kapillare oder an jeder Stelle gesetzt werden, an der eine Kapillare in eine andere verzweigt. Dies erzeugt ein vollständig skelettisiertes Bild, aus dem die morphologischen Parameter automatisch extrahiert werden. Die Anzahl der Kapillarknoten, Segmente, die mittlere Segmentlänge sowie die gesamte Segmentlänge können mittels zweiphotonischer ex vivo-Bildgebung von Mäusehirnschnitten ermittelt werden.Hier wird mittels In-vivo-Bildgebung ein zweidimensionales Bild der Kapillarnetze erzeugt, bei dem der Kapillardurchmesser extrahiert und das gesamte Kapillarvolumen unter Verwendung des Kapillardurchmessers und der Gesamtlänge der Segmente, die aus der Ex-vivo-Bildgebung gewonnen wurde, berechnet werden kann. Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann das Verfahren in drei Stunden und dreißig Minuten abgeschlossen werden, sofern es ordnungsgemäß durchgeführt wird. Während der Durchführung des Verfahrens ist es wichtig, schnell vorzugehen, während gleichzeitig eine stabile Anästhesietiefe aufrechterhalten wird, da Isofluran eine Vasodilatation kortikaler Kapillaren hervorrufen kann, was die Daten verfälschen würde.Während dieses Verfahrens können weitere kapillare Parameter erfasst werden, wie beispielsweise die Erythrozyten-Geschwindigkeit oder der Erythrozyten-Fluss, die ein tieferes Verständnis der pathogenetischen Veränderungen bei HIV-assoziierten neurokognitiven Störungen und anderen neurodegenerativen Erkrankungen ermöglichen. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Wir beschreiben ein Verfahren zur Visualisierung wiederholt murine Mikroglia und zirkulierenden...

Ein Thin-Schädel Fenster-Technik für chronische Zwei-Photonen- In-vivo- Imaging von Murine Mikrogliazellen in Modelle der Neuroinflammation

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 Zwei-Photonen-Mikroskopie für die In-vivo-Bildgebung von Mikrogefäßen im Gehirn von Mäusen 

Quelle: Arango-Lievano, M. et. al., Längsschnittliche In-vivo-Bildgebung des zerebrovaskularen Systems: Relevanz für ZNS-Erkrankungen. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video demonstriert in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung zur Visualisierung von fluoreszenzmarkierten Amyloid-Plaques und zerebralen Gefäßen. Blaue Fluoreszenz markiert Plaques, während grüne Fluoreszenz die zerebralen Blutgefäße hervorhebt. Eine 3D-Karte der Region of Interest und hochauflösende Mosaik-Bildgebung zeigen detaillierte...

In-vivo-Bildgebung von Hirngefäßen und Amyloid-Plaques in einem Mausmodell für die Alzheimer-Krankheit

Dieses Protokoll beschreibt die wiederholte hypoxische Präkonditionierung oder kurze Exposition gegenüber systemischer Hypoxie, die das Infarktvolumen und die Störung der Blut-Hirn-Schranke nach einem vorübergehenden Verschluss der mittleren Hirnarterie bei Mäusen reduziert. Es wird auch die duale Quantifizierung des Infarktvolumens und der Störung der Blut-Hirn-Schranke nach einem Schlaganfall beschrieben, um die Wirksamkeit des neurovaskulären Schutzes zu bewerten.

Die Quantifizierung der neurovaskulären Schutz Nach Repetitive hypoxische Präkonditionierung und Transient mittleren Hirnarterie Occlusion in Mice

Mit Längs Zwei-Photonen - Mikroskopie Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren , um den Umbau des cerebrovasculature während Amyloid - Plaque - Akkumulation in vivo zu verfolgen. Ein ausgedünnten Schädel Vorbereitung ermöglicht die Visualisierung von Fluoreszenzfarbstoffen, das Fortschreiten von zerebrovaskulären Schädigung in einem Mausmodell der Alzheimer-Krankheit zu bewerten.

in Längsrichtung<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging des Cerebrovasculature: Bedeutung für ZNS-Erkrankungen

Hier präsentieren wir eine Mikroskopie-basiertes Protokoll für hochauflösende Bildgebung und eine dreidimensionale Rekonstruktion der Maus neurovaskuläre Einheit und Blut - Hirn-Schranke mit Gehirn frei schwebenden Abschnitten. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung, Analyse und Quantifizierung der intrazellulären Organellen an der BBB.

Hochauflösende konfokale Bildgebung der Blut - Hirn-Schranke: Bildgebung, 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung der Transcytosis

Das Ziel dieses Artikels ist es, eine Methode zu präsentieren, die ermöglicht eine 3-dimensionale Rekonstruktion des Baumes zerebrovaskuläre bei Mäusen nach Mikro berechnet, Tomographie und Ermittlung der Volumina der gesamte Behälter-Segmente, die verwendet werden können, zu quantifizieren, zerebralen Vasospasmus in Murine Modelle der Subarachnoidalblutung.

Eine Volumetrische Methode zur Quantifizierung der zerebralen Vasospasmus in einem Mausmodell der Subarachnoidalblutung

Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur chronischen in vivo Beobachtung der ruhenden Mikroglia im Hippocampus CA1 der Maus mittels präzise kontrollierter Chirurgie und Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Im lebenden Organismus Chronische Zwei-Photonen-Bildgebung von Mikroglia im Hippocampus der Maus

Erfahren Sie die Quantifizierung zerebraler Kapillarnetzwerke mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie im Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation. Diese Methode ermöglicht die physiologisch genaue Analyse vaskulärer Veränderungen.

Die Quantifizierung der zerebrale vaskuläre Architektur unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation (Video) | JoVE Journal

Die Quantifizierung der zerebrale vaskuläre Architektur unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation

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