Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in Arabidopsis

Wir bieten hier eine effiziente und zuverlässige Protokoll für die Immunfärbung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, DNA-Färbung, gefolgt von quantitativen und hochauflösende Bildgebung in der whole-mount Arabidopsis thaliana Samenanlagen. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um Chromatin-Modifikationen und Zellkernarchitektur zu analysieren.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Arabidopsis Vues für die Hybridisierung und Immunfärbung vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zuerst frische Blütenknospen in der Fixierlösung fixiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Vues sorgfältig zu präparieren und in Miniatur-Acrylamid-Pads direkt auf Mikroskopie-Objektträgern einzubetten.

Die anschließende Gewebeaufbereitung ermöglicht die Klärung und Permeation des Gewebes. Der letzte Schritt besteht darin, die behandelten Proben mit einer Antikörperlösung für die Immunfärbung oder einer markierten Sonde für die Fluoreszenz in der C-2-Hybridisierung zu inkubieren. Letztendlich ermöglicht die hochauflösende konfokale Bildgebung, gefolgt von einer dreidimensionalen Rekonstruktion, eine quantitative Analyse in der gesamten Montierung auf Einzelzellebene.

Diese Methode wurde zunächst eingesetzt, um Einblicke in die CT-Organisation in der Ansicht zu geben, sie könnte aber auch zur Analyse anderer Zellkompartimente in anderen Geweben des Tauchgangs und in anderen Modellorganismen angewendet werden. In Mikrofurchenröhrchen, gefüllt mit frisch hergestelltem BBO-Puffer, der auf Eis bei 20 bis 30 Handwurzeln pro Röhrchen gekühlt wurde, wurden die Röhrchen eine halbe Stunde lang bei Raumtemperatur sanft geschaukelt. Drehen Sie dann die Röhrchen eine Minute lang bei 400 G herunter. Saugen Sie dann vorsichtig die Überstände an, entsorgen Sie sie und geben Sie einen Milliliter PBT in die Handwurzeln. Lege die Röhren auf Eis, damit jede Röhre mit den Handwurzeln montiert werden kann.

Auf Eis zubereiten lassen. Fünf Röhrchen mit 200 Mikrolitern. Eine frisch hergestellte 5%ige Acrylamid-Mischung.

Fünf saubere Superfrost-Objektträger, die mit einem Bleistift beschriftet sind, ein Gedanken-Eloqua von 20%a PS und ein Gedanken-Eloqua von 20%NAPS aus einer Tube Karpalen. Nehmen Sie vier oder fünf mit einer abgeschnittenen Endspitze und legen Sie sie jeweils auf eine Folie. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit, indem Sie vorsichtig mit feinen Nadeln pipettieren.

Machen Sie Längsschnitte in die Handwurzeln und entfernen Sie die Karpalwände, um die Reihen der Vuen freizugeben. Dieser Schritt erfordert Übung. Verhindern Sie, dass die Vues austrocknen, indem Sie bis zu 10 Mikroliter PBS hinzufügen und dann in ein Mikrofuge-Röhrchen mit der Acrylamidmischung geben.

Fügen Sie schnell 12 Mikroliter NAPS und 12 Mikroliter eines PS hinzu. Mischen Sie die Lösung durch Pipettieren gut und fügen Sie schnell 30 Mikroliter dieses aktivierten Acrylamids hinzu. Auf einen Objektträger mit präparierten Vuen mischen. Legen Sie vorsichtig einen kleinen Deckslip auf das Präparat und lassen Sie die Lösung etwa eine Stunde lang bei Raumtemperatur polymerisieren.

Bereiten Sie jede Folie später auf diese Weise vor. Verwende eine Rasierklinge, um die Abdeckfolien abzuschlagen. Die Proben können über Nacht bei vier Grad Celsius in einem Coplan-Glas mit PBS gelagert werden oder direkt mit der Verarbeitung fortfahren.

Im Allgemeinen sollte die Verarbeitung in Coplan-Gläsern mit 80 Millilitern Lösung erfolgen. Und unter dem Abzug. Beginnen Sie mit der Klärung des Gewebes durch Inkubation in einer Lösungsreihe von Methanol-Ethanol, einer Eins-zu-Eins-Ethanol-Xylol-Lösung und erneut in Ethanol und dann Methanol.

Jedes Bad dauert fünf oder 30 Minuten. Siehe den Text Protokoll. Verwenden Sie anschließend eine Eins-zu-Eins-Methanol-PBT-Lösung mit 2,5 % Formaldehyd für 15 Minuten.

Spülen Sie dann das Tuch zweimal pro Bad für 10 Minuten in PBT aus. Danach können die Objektträger bei Bedarf über Nacht bei vier Grad Celsius gelagert werden. Nehmen Sie anschließend bis zu sechs Objektträger aus dem Glas und lassen Sie die überschüssige Flüssigkeit ab.

Legen Sie sie auf ein Seidenpapier und fügen Sie schnell 100 Mikroliter eines gekühlten Zellwandverdauungsenzyms hinzu. Auf die Pads mischen. Decken Sie dann die Dias mit großen Deckgläsern ab.

Inkubieren Sie die Objektträger zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Kammer. Es ist wichtig, die CO-Aufschlusstemperatur für jede neue enzymatische Lösung zu optimieren, da dieser Schritt für eine spätere homogene Färbung entscheidend ist. Waschen Sie die Objektträger zweimal pro Waschgang fünf Minuten lang mit PBT.

Lassen Sie dann die Objektträger nun zu jeder Folie abtropfen. Fügen Sie 100 Mikroliter RNAs A in PBS hinzu, vervollständigen Sie es mit 1%tween und inkubieren Sie die Objektträger nach der Inkubation eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Kammer, waschen Sie die Objektträger wie zuvor zweimal mit PBT und fixieren Sie das Gewebe wieder, indem Sie die Objektträger 20 Minuten lang in einem Bad aus frisch hergestelltem PBTF inkubieren. Spülen Sie das PBTF mit einer Wäsche in PBT für 10 Minuten ab.

Fahren Sie dann mit der Gewebepermeation fort, indem Sie die Objektträger in PBS mit 2 % Tween für zwei Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Verwenden Sie zwei Waschgänge in PBT von jeweils fünf Minuten, um die durchlässige Lösung zu entfernen. Fahren Sie dann mit der Immunfärbung fort.

Beginnen Sie mit der Inkubation der Objektträger im primären Antikörper von Interesse. Tragen Sie 100 Mikroliter Aliquots des Antikörpers in PBS verdünnt und mit 0,2% dazwischen auf jeden Objektträger auf. Bringen Sie die Objektträger in eine feuchte Kammer und inkubieren Sie sie 12 bis 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius.

Waschen Sie die Objektträger zwei bis vier Stunden lang in einem PBT-Bad unter leichtem Schaukeln bei Raumtemperatur. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter Sekundärantikörper hinzu, verdünnt von eins bis 200 in PBS mit 0,2 % zwischen 20 und inkubieren Sie die Objektträger 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Ein einstündiges Bad in PBT mit leichtem Schaukeln reicht aus, um die Objektträger des ungebundenen Sekundärantikörpers zu waschen.

Dann wird die DNA mit einer Lösung von 10 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumiodid in PBS gegengefärbt. Lassen Sie die Färbung 15 Minuten einwirken und waschen Sie die Objektträger dann 15 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln mit PBT. Montieren Sie nun die Objektträger mit einem Anti-Fade-Medium, das mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumiodid ergänzt wird.

Nachdem Sie die Objektträger eine Stunde lang fest werden lassen, werden sie auf einem konfokalen Mikroskop mit einer 63-fachen Glycerin-Immersionslinse abgebildet. Daher ist es bei der Bildaufnahme von entscheidender Bedeutung, die Scaneinstellungen zwischen den Proben identisch zu halten, um eine vergleichende Quantifizierung zu ermöglichen und einen linearen Detektionsmodus zu verwenden. Rekonstruieren Sie später die seriellen Bilder in dreidimensionale Strukturen, segmentieren Sie jeden interessierenden Kern und verwenden Sie 3D-Bildverarbeitungssoftware, um die Signale zu quantifizieren.

Mit diesem robusten, großmaßstäblichen Präparationsprotokoll behalten ganze Mount Vues ihre dreidimensionale Struktur. Subzelluläre Strukturen werden mit hoher Detailgenauigkeit sichtbar, wie sie beim Chromatin zu sehen ist. Bei der Färbung von DNA erscheint das Heterochromatin als helle und gut definierte Herde, ohne dass eine Dekonvolution angewendet werden muss.

Dieses Protokoll ermöglicht die parallele Immunfärbung mit mehreren Antikörpern in einer Runde. Zum Beispiel wurden der U-Chromatin-assoziierte permissive Marker, H drei Trimm methyliertes Lysin vier und der Heterochromatin-assoziierte Marker H drei Monomethyllysin 27 beide in einem Experiment auf unterschiedlichen Replikationsobjektträgern zur Analyse der Chromatindynamik nachgewiesen. Eine weitere kompatible Technik ist die fluoreszierende C-Zwei-Hybridisierung oder Fischfische auf 45 s.Ribosomal.

DNA-Wiederholungen wurden verwendet, um die Regionen der Kernorganisation zu definieren. Die Sonde wurde direkt mit Alexa 4 88 markiert, und die DNA wurde mit Zählern gefärbt. Für die Ifizierungsanalyse ist es sehr wichtig, verschiedene Körperverdünnungen und Inkubationszeiten zu testen, um die Bedingungen zu identifizieren, die ein robustes und hogenes Signal mit dem geringstmöglichen Ergebnis liefern. Und körperliche Reue.

Da diese Methode eine hervorragende Konservierung des Gewebes und eine optimale Permeation für die Einzelzellanalyse der Chromatinorganisation ermöglicht, ebnet sie Wissenschaftlern auf dem Gebiet der pflanzlichen Zellbiologie oder der pflanzlichen Epigenetik den Weg, die nukleäre oder subzelluläre Organisation auf Einzelzellebene und im Kontext des gesamten Menschen zu untersuchen.