Name: Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Lernen Sie eine effiziente Methode zur Immunfärbung und FISH in Arabidopsis thaliana-Samenanlagen. Dieses Protokoll ermöglicht hochauflösende Einzelzellanalyse von Chromatinmodifikationen und Kernarchitektur.

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Wir danken Ueli Grossniklaus (Universität Zürich) für die technische und finanzielle Unterstützung. Wir danken Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolanos und Peter Kopf für die allgemeine Unterstützung des Labors. Diese Forschung wurde von der Universität Zürich finanziert, mit Stipendien des Schweizerischen Nationalfonds an CB (31003A_130722) und Ueli Grossniklaus (31003A_141245 und 31003AB-126006) sowie von der Agence Nationale de la Recherche an DG (Programm ANR-BLANC-2012).

Das Verfahren wird im Arbeitsablauf in Fig. 1 beschrieben, und die Einrichtung für die Präparation und Einbetten von Geweben sind in Figur 2 dargestellt. 1. Gewebefixierung <ol><li> Sammeln 20-30 Fruchtblätter in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit frisch gemacht BVO Fixierungspuffer auf Eis. </li><li> Fix das Gewebe 30 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. </li><li> Drehen Sie die Rohre, die die Fruchtblätter in Fixiermittel in einer Tischmikrozentrifuge 1 min bei 400 x g. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Fixierungspuffer und 1 ml PBT, legen Sie die Röhrchen auf Eis. </li></ol> 2. Dissection and Embedding <ol><li> Bereiten fünf Eppendorf-Röhrchen mit je 200 ul einer frisch zubereiteten, 5% Acrylamid-Mix. </li><li> Vorbereitung fünf Superfrost Objektträger mit 70% Ethanol vorgereinigt und mit einem Bleistift markiert. </li><li> Tauwetter ein Aliquot von 20% und 20% APS NaPS je, auf Eis. </li><li> Nehmen Sie 4-5 Fruchtblättern mit einem Cut-Endrohr, Ortsie auf einen sauberen Objektträger, entfernen Sie das überschüssige Flüssigkeit. </li><li> Machen Längsschnitte mit einer feinen Nadel und nehmen die Fruchtblatt Wände, um Reihen von Samenanlagen wie gezeigt Abbildung 2 zu lösen, vermeiden Trocknung durch Abdecken mit PBS (nicht mehr als 10 ul). </li><li> Schnelles Hinzufügen und mischen 12 ul NaPS, 12 ul APS mit einem Aliquot von 200 ul Acrylamid-Mix. </li><li> In 30 ul der Aktiv Acrylamid auf die Samenanlagen seziert. </li><li> Deckel mit einem 20 x 20 mm Deckglas, lassen Sie polymerisieren bei Raumtemperatur 45-60 min. </li><li> Entfernen Sie das Deckglas mit einer Rasierklinge. In diesem Stadium können die Proben über Nacht bei 4 ° C in einer Glasküvette mit PBS aufbewahrt. </li></ol> 3. Gewebeverarbeitung HINWEIS: Alle Schritte außer 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 und 3.4.3 sind in Coplin Gläser mit 80 ml Lösung unter der chemischen Abzug bei Raumtemperatur durchgeführt. Folien sind mit einem Flachbild-Spitze Pinzette übertragen. <ol><li> Tissue Klärung undFixierung: <ol><li> Inkubation 5 min in Methanol. </li><li> Inkubation 5 min in Ethanol. </li><li> Inkubieren 30 min in Ethanol: Xylol (1:1). </li><li> Inkubation 5 min in Ethanol. </li><li> Inkubation 5 min in Methanol. </li><li> Inkubieren 15 min in Methanol und PBT (1:1) mit 2,5% Formaldehyd ergänzt. </li><li> Spülen Sie 2 x 10 min in PBT. In diesem Stadium können Folien über Nacht bei 4 ° C aufbewahrt werden </li></ol></li><li> Zellwand Verdauung: <ol><li> Tauwetter ein Aliquot der Zellwand Verdauung Mix auf Eis. </li><li> Nehmen Sie eine Folie aus der Glasküvette, lassen Sie das überschüssige Flüssigkeit, indem Sie sie senkrecht auf einem Papiertuch. </li><li> 100 l Zellwand Verdauung Mix über die Acrylamid-Pad und mit einem 23 x 46 mm Deckglas. Wiederholen Sie dies für die anderen Folien. Inkubation für 2 h bei 37 ° C in einer feuchten Kammer (in Materials beschrieben). </li><li> In PBT Waschen Sie die Folien 2 x 5 min. </li></ol></li><li> RNase A-Behandlung: <ol><li> Nehmen Sie eine Folie aus der Glasküvette, abtropfen the überschüssige Flüssigkeit wie zuvor. </li><li> Inkubieren jede Folie mit 100 ul RNAseA bei 100 ug / ml in PBS mit 1% Tween-20 für 1 h bei 37 ° C in einer feuchten Kammer. </li><li> Für 2 x 5 min in PBT Waschen Sie die Dias. </li></ol></li><li> Post-Fixierung und Permeabilisierung: <ol><li> Post-fix für 20 min in frisch gemachte PBT-F. </li><li> Spülen Sie die Objektträger für 10 min in PBT. </li><li> Durchdringbar für 2 h in PBS mit 2% Tween-20 bei 4 ° C </li><li> Spülen Sie die Folien für 2 x 5 min in PBT. </li></ol></li></ol> 4. Immunfärbung HINWEIS: Bei diesem Schritt hat die optimale Konzentration des primären Antikörpers durch Verwendung von verschiedenen Verdünnungen (1:200, 1:500, 1:1000) der Antikörper getestet werden. <ol><li> Inkubieren jede Folie mit 100 ul des primären Antikörpers in PBS mit 0,2% Tween-20 verdünnt 12-24 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Waschen der Objektträger in PBT für 2-4 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Wenden Sie dasSekundär-Antikörper 1:200 in PBS + 0,2% Tween-20 für 24 Stunden bei 4 ° C </li><li> Waschen Folien in PBT für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Mit 10 ug / ml Propidiumiodid in PBS für 15 min Gegenfärbung, dann spülen 15 min in PBS unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. </li><li> Berg in der Anti-Fading-Flüssigkeit mountant mit 10 ug / ml Propidiumiodid ergänzt. Lassen Sie die Montagemedium aushärten 1 Stunde vor dem Erwerb durch CLSM Bilder. </li></ol> 5. Quantitative Bildgebung <ol><li> Bildaufnahme: <ol><li> Erwerben Sie hochauflösende Bilder mit CLSM, idealerweise mit einer Resonanz-Scanmodus, die bessere Erhaltung der Fluoreszenzsignale über längere Bild 23 und einen 63X Glycerin Sionslinse ermöglicht. </li><li> Testen Sie die Aufnahmeparameter wie Laserintensität, Verstärkung, Lochkamera, Voxel-Größe und Zoom-Faktor zu Beginn des Experiments, um eine Standarderwerbsverfahren zu definieren, um in ganz strikt befolgenAlle Folien für konsistente quantitative Messungen. </li><li> Überprüfen Sie, ob das Fehlen von Übersprechen zwischen Fluorochrome. Falls vorhanden, einen sequentiellen Scan eingestellt. Erwerben Sie separat und nicht gleichzeitig Übertragungs Bilder. </li><li> Führen seriell, dreidimensionale Bildaufnahme mit höchster Auflösung in x-und y-Abmessungen und mit 2x Oversampling in der z-Dimension (Nyquist-Regel). </li></ol></li><li> Bildverarbeitung: <ol><li> Rekonstruieren Serien Bilder in drei Dimensionen mit kommerziellen oder Open-Source-Software. </li><li> Definieren Konturflächen um jeden Kern (oder Zelle) von Interesse in 3D. </li><li> Quantifizierung der Fluoreszenz in jedem Kanal die Summe der Pixelintensitäten in jedem Objekt. </li><li> Exportieren Sie die Daten in Excel für statistische Auswertungen. Normalisieren Antikörper gegen Signale zB DNA-Färbung Signale. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

In blühenden Pflanzen wird die weiblichen Fortpflanzungs Abstammung von mehreren Zellschichten einschließlich der Nucellus der Samenanlage und teguments umgeben, damit Rendering zytologische Färbung in whole-mount technisch anspruchsvoll. Hier stellen wir eine effiziente Protokoll ermöglicht die Erstellung und Bearbeitung einer großen Anzahl von Eizellen geeignet für zytologische Färbung wie Immunfärbung, DNA-Färbung und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ganz-mount. Wir erfolgreich verwendet sie für die Analys...

In blühenden Pflanzen, die Einrichtung von Fortpflanzungslinien beginnt mit der Differenzierung von SMC, MMC weiblichen und männlichen Pollenmutterzelle. Die MMC entwickelt sich aus einer Unter nucellar epidermalen Zelle an der distalen Spitze der Samenanlage primordium und die Pollenmutterzellen entwickelt von sporenbildenden Gewebes in der Anthere locule, die tief in den Blütenorganen 1 angeordnet sind. SMCs Meiose haploide Sporen, die dann führen zu den Gametophyten bei der Mitose zu produzieren. Der weibliche Gametophyt oder Embryosack, besteht aus einer Eizelle, einer Zentralzelle, zwei und drei Synergiden antipodals. Der männliche Gametophyt oder Pollen, wird von einem vegetative Zelle und zwei Spermazellen zusammengesetzt. Während die männlichen Gametophyten bleibt ein relativ zugänglich Objekt-of-Studie wird die weiblichen Gametophyten innerhalb der Samenanlage eingebettet ist, sich selbst in der Blüte Fruchtblatt umschlossen und damit besondere Herausforderungen, um molekulare und zytologische Analysen. Kürzlich jedoch lasergestützteMikrodissektion bot eine elegante Lösung, die Transkriptom-Analysen in der MMC und weiblichen Zellen gametophytische 2-4. Neben den Kandidaten-Gen-Expressionsanalysen, zB mit RNA in situ Hybridisierung oder Reporter-Gen-Assays, zytologische Analysen ermöglicht die Untersuchung der Dynamik der endogenen zellulären Komponenten mit spezifischen zellulären direkte oder indirekte Immunfärbung. Insbesondere zytogenetische Färbung mit FISH und DNA-Färbung zusammen mit Immunfärbung von Chromatin-Veränderungen oder Chromatin-Komponenten sind zentrale Ansätze zur Chromatin-Dynamik und Atom-Organisation in Arabidopsis 5 aufzuklären. Typischerweise bringt Meiose spezifische Chromosomendynamik, die auch in pflanzlichen männlichen sucht wurde meiocytes 6,7; weitere Groß, zellspezifische Chromatin Reorganisation wahrscheinlich reflektiert dynamische epigenetische Reprogrammierung während der Pollenentwicklung 10.8 beschrieben. Im Gegensatz dazu aufgrundder relativen Unzugänglichkeit des weiblichen Gametophyten meiocyte und bleiben diese Untersuchungen technisch schwierig anzuwenden, und erfordern oft Schnitte oder manuelle Präparation und enzymatische Verdauung (siehe unten). Darüber hinaus ist die vorherrschende Mangel an optischer Klarheit ganz-mount ein Hindernis für die hochauflösende Bildgebung von Keimzellen in intakten Eizellen. Eine klassische Methode für die zytologische Analyse der Chromosomenorganisation in whole-mount Eizellen verwendet Feulgen-Färbung 13.11. Es handelt Säurehydrolyse (unter Verwendung unterchlorige Säure) der DNA, die in Protein-Denaturierung und damit zu Zerstörungen führt der Chromatinstruktur. Alternativ kann Chromosom Organisation in der weiblichen meiocytes und gametophytische Zellen mit DAPI-Färbung und Immunfärbung auf Semidünnschnitten oder seziert Embryosäcke und MMC (siehe beispielsweise 14-18) beobachtet werden. Fest steht jedoch, manuelle Präparation und Schnitte kann arbeitsintensiv sein undbehindert die qualitative und quantitative Analyse einer Vielzahl von Chromatin-Epitope. Hier bieten wir eine effiziente Protokoll, um eine große Anzahl von Arabidopsis Samenanlagen geeignet für eine Vielzahl von nachgelagerten zytologische Färbung im gesamten Montage vorzubereiten. Kurz gesagt, sind Blütenknospen in einer Fixierungslösung inkubiert werden Zeilen von Eizellen aus dem Fruchtblatt seziert und in Acrylamid eingebettet auf Folie wie für Pollen meiocytes 19,20 getan. Die eingebetteten Samenanlagen weiter geklärt und in Methanol, Ethanol und Xylol vor der Zellwand Verdauung und Permeabilisierung befestigt. Mögliche Variationen dieser Schritte werden diskutiert. Die Proben können dann für DNA-Färbung, Immunfärbung und FISH verwendet werden. Der Vorbereitungsmodus ist effizient und ermöglicht parallele Versuchsaufbau (bis zu 16 Objektträger kann an einem Tag für unterschiedliche nachgeschaltete Analyse vorbereitet werden). Die beschriebenen Behandlungen ermöglichen homogene Signale in Vollmontage und gut erhaltenen histologischen, Mobilfunk,und Kernorganisation in Keimzellen und die umliegenden nucellar Zellen, die qualitative und quantitative Vergleiche zwischen Zelltypen profitieren. Kalibriert, CLSM-basierte hochauflösende Bildgebung, gefolgt von 3-dimensionalen Rekonstruktion ermöglicht aussagekräftige quantitative Messungen von Fluoreszenzsignalen. Wir dieses Verfahren erfolgreich eingesetzt, um Chromatin-Dynamik in der Differenzierung und Entwicklung von MMC-21 weiblichen Gametophyten 22 zu analysieren; wir hier präsentieren, repräsentative Ergebnisse von Heterochromatin-Analyse, Immunfärbung Chromatin, GFP-Immunfärbung und FISH in whole-mount Samenanlagen. Wir glauben weiterhin, dass unser Protokoll wird für andere Pflanzengewebe und Arten sein.

<table><tbody><tr><td>Lösungen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BVO Fixierungspuffer (basierend auf32)</td><td></td><td></td><td>2 mM EGTA, pH 7,5, 1 % (v/v) Formaldehyd, 10 % DMSO, 1x PBS, 0,1 % Tween-20</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0,1 % Tween-20</td></tr><tr><td>PBT-F</td><td></td><td></td><td>1x PBT, 2,5 % (v/v) Formaldehyd</td></tr><tr><td>30 % Acrylamid:Bisacrylamid</td><td></td><td></td><td>3 g Acrylamid, 0,33 g Bisacrylamid, 1x PBS (10 ml zubereiten, bei 4 & deg; C)</td></tr><tr><td>200 ml 5% Acrylamid-Mischung in PBS</td><td></td><td></td><td>34 ml 30% Acrylamid:Bisacrylamid, 166 ml 1x PBS (frisch aus 30% Bestand herstellen)</td></tr><tr><td>20% Ammoniumpersulfte</td><td></td><td></td><td>0,2 g Ammoniumpersulfte, 1 ml steriles Wasser (Aliquots mit 1 ml herstellen und bei -20 & deg lagern; C)</td></tr><tr><td>20% Natriumsulfit</td><td></td><td></td><td>0,2 g Natriumsulfit, 1 ml steriles Wasser (Aliquote mit 1 ml zubereiten und bei -20 & deg lagern; C)</td></tr><tr><td>Zellwand-Enzymmischung</td><td></td><td></td><td>0,5 % (w/v) Cellulase, 1 % (w/v) Driselase, 0,5 % (w/v) Pektoliase</td></tr><tr><td>Reagenzien und Materialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amaresco</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Schaurlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Schaurlau</td><td>ME03062500</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>ROTH</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase</td><td>Sigma</td><td>1794</td><td></td></tr><tr><td>Driselase</td><td>Sigma</td><td>D8037</td><td></td></tr><tr><td>Pektoliase</td><td>Sigma</td><td>P5936</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>8.22184.0500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Sigma</td><td>A-3553</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrylamid</td><td>Sigma</td><td>M2022</td><td>giftiges</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Sigma</td><td>A9164</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsulfit</td><td>Fluka</td><td>71988</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Trimethyl-Histon H3 (Lys4)</td><td>Upstate</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Monomethyl-Histon H3 (Lys27)</td><td>Upstate</td><td>07-448</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488~ziege ~anti ~Kaninchen (H+L)</td><td>Molekulare Sonde</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>ProlongGold</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>toxisches</td></tr><tr><td></td><td>DAPI Sigma</td><td>D9542</td><td>toxische</td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Roche</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Glas</td><td>Huber & CO</td><td>10.055</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>DUMONT BIOLOGY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schüttler</td><td>Heidolph</td><td>543-12310-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Feuchtkammer</td><td></td><td></td><td>In die Box wird eine Kunststoffbox mit einem feuchten Papiertuch eingelegt, in die eine Kunststoffstütze eingelegt wird, um die Objektträger abzustützen und die Objektträger vom Wasser fernzuhalten.</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Rutsche</td><td>Thermo Fisher J1800AMNZ</td><td></td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td></tr><tr><td>FISH Tag DNA KIt</td><td>Invitrogen</td><td>F32947</td><td></td></tr><tr><td>GFP Booster</td><td>Chromotek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eine effiziente methode zur quantitativen, einzel-zell-analyse von chromatin modifikation und reaktor architektur in whole-mount-samenanlagen in<em&gt; arabidopsis</em

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In blühenden Pflanzen ist der somatisch-to-Keimzelle Schicksal Übergang von der Spezifikation der Sporenmutterzellen (SMCs) in Blütenorgane der erwachsenen Pflanze markiert. Die weibliche SMC (Megaspore Mutterzelle, MMC) unterscheidet in der Samenanlage Primordium und Meiose. Das ausgewählte haploiden Megaspore läuft dann Mitose die vielzelligen weiblichen Gametophyten, die zu den Gameten geben wird, die Eizelle und Zentralzellen bilden zusammen mit akzessorischen Zellen. Die begrenzte Zugänglichkeit der MMC, meiocyte und weiblichen Gametophyten innerhalb der Samenanlage ist technisch anspruchsvoll für die zytologische und zytogenetische Analysen auf Einzelzellebene. Insbesondere ist eine direkte oder indirekte Immundetektion von zellulären oder Kern Epitope durch schlechte Penetration der Reagenzien innerhalb der Pflanzenzelle und Einzelzellenabbildungs ​​beeinträchtigt wird durch den Mangel an optischer Klarheit in whole-mount Gewebe demised. So eine effiziente Methode, um die nucl analysieren entwickelten wirOhr Organisation und Chromatin-Modifikation bei hoher Auflösung von Einzelzell ganz-Mount eingebettet Arabidopsis Samenanlagen. Es ist auf Dissektion und Einbettung von festen Eizellen in einer dünnen Schicht aus Acrylamid-Gel auf einen Objektträger beruht. Die Samenanlagen eingebettet werden, um chemische und enzymatische Behandlungen zur Verbesserung der Gewebe Klarheit und Durchlässigkeit für die Immunfärbung Reagenzien unterzogen. Diese Behandlungen erhalten zellulären und Chromatin-Organisation, DNA-und Protein-Epitope. Die Proben können für unterschiedliche nachgeschaltete zytologische Analysen einschließlich Chromatin Immunfärbung, Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH), und DNA-Färbung für Heterochromatin Analyse verwendet werden. Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) Bildgebung mit hoher Auflösung, gefolgt von 3D-Rekonstruktion erlaubt eine quantitative Messungen an Einzelzellauflösung.

Wir bieten eine robuste Protokoll für die großtechnische Herstellung und Verarbeitung von Arabidopsis Samenanlagen geeignet für zytologische Färbung ganz-mount. Durch die Einbettung sind die Samenanlagen behalten eine 3-dimensionale Struktur (Fig. 3). Darüber hinaus ist die Gewebeverarbeitung einschließlich der optischen Klärung ermöglicht die Abbildung subzellulärer Strukturen mit hoher Auflösung. Abbildung 4 zeigt DNA-Färbung in whole-mount Eizelle Primordia wo Heterochromati...

Wir bieten hier eine effiziente und zuverlässige Protokoll für die Immunfärbung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, DNA-Färbung, gefolgt von quantitativen und hochauflösende Bildgebung in der whole-mount Arabidopsis thaliana Samenanlagen. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um Chromatin-Modifikationen und Zellkernarchitektur zu analysieren.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Arabidopsis Vues für die Ganzpräparat-Hybridisierung und Immuno-Färbung vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst frische Blütenknospen in der Fixierungslösung fixiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Vues vorsichtig zu dissekieren und in miniaturisierten Acrylamid-Pads direkt auf Mikroskopie-Objektträgern einzubetten. Die anschließende Gewebeprozessierung ermöglicht die Klärung und Durchlässigkeit des Gewebes. Im letzten Schritt werden die behandelten Proben mit einer Antikörperlösung zur Immunfärbung oder mit einer markierten Sonde zur fluoreszenten in-situ-Hybridisierung inkubiert. Schließlich ermöglicht die hochauflösende konfokale Bildgebung in Kombination mit der dreidimensionalen Rekonstruktion eine quantitative Analyse im gesamten Präparat auf Einzelzellniveau.Diese Methode wurde ursprünglich eingesetzt, um Einblicke in die CT-Organisation in der Ansicht zu erhalten, kann aber auch zur Analyse anderer Zellkompartimente in weiteren Geweben des Plunge sowie in anderen Modellorganismen angewendet werden. In Mikrozentrifugenröhrchen, die mit frisch hergestelltem, auf Eis gekühltem BBO-Puffer gefüllt sind, jeweils 20 bis 30 Karpalien pro Röhrchen geben und die Röhrchen vorsichtig eine halbe Stunde bei Raumtemperatur schwenken. Anschließend die Röhrchen eine Minute bei 400 × g zentrifugieren. Danach das Überstandvolumen vorsichtig abpipettieren, entsorgen und je ein Milliliter PBT zu den Karpalien hinzufügen. Die Röhrchen für jedes Röhrchen mit Karpalien auf Eis stellen, um sie einzubetten.Auf Eis vorbereitet haben. Fünf Reagenzgläser mit jeweils 200 Mikrolitern. Eine frisch hergestellte 5%ige Acrylamid-Mischung.Fünf saubere Super-Frost-Objektträger, die mit einem Bleistift beschriftet sind, eine gedachte Eloqua mit 20 % aPS und eine gedachte Eloqua mit 20 % NAPS aus einer Röhre mit Karpalien. Nehmen Sie vier oder fünf mit einem abgeschnittenen Spitzenende und platzieren Sie sie jeweils auf einen Objektträger. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit vorsichtig mit einer Pipette unter Verwendung feiner Nadeln.Longitudinale Schnitte in die Karpalia machen und die Karpalwände entfernen, um die Reihen der Vues freizulegen. Dieser Schritt erfordert Übung. Verhindern Sie, dass die Vues austrocknen, indem Sie bis zu 10 Mikroliter PBS hinzufügen und anschließend in ein Mikrofugegefäß mit der Acrylamid-Mischung überführen.Gebe schnell 12 Mikroliter NAPS und 12 Mikroliter eines PS zu. Mische die Lösung gründlich durch Pipettieren und füge anschließend schnell 30 Mikroliter dieses aktivierten Acrylamids hinzu. Verteile die Mischung auf einem Objektträger mit dissezierten Präparaten. Lege vorsichtig ein kleines Deckglas auf die Probe und lasse die Lösung etwa eine Stunde lang bei Raumtemperatur polymerisieren. Bereiten Sie jeden Objektträger später auf diese Weise vor. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Deckgläser abzulösen. Die Proben können über Nacht bei vier Grad Celsius in einem Coplin-Behälter mit PBS aufbewahrt oder direkt weiterverarbeitet werden.Die Verarbeitung sollte im Allgemeinen in Coplan-Gläsern mit 80 Milliliter Lösung und unter dem Abzug durchgeführt werden. Beginnen Sie mit der Klärung des Gewebes durch Inkubation in einer Lösungsreihe aus Methanol, Ethanol, einer eins-zu-eins-Ethanol-Xylol-Lösung und erneut in Ethanol und anschließend in Methanol.Jedes Bad dauert fünf oder 30 Minuten. Siehe den textlichen Protokollabschnitt. Verwenden Sie anschließend eine Methanol-PBT-Lösung (1:1) mit 2,5 % Formaldehyd für 15 Minuten.Anschließend das Gewebe zweimal für jeweils 10 Minuten in PBT spülen. Danach können die Objektträger über Nacht bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden, falls erforderlich. Danach bis zu sechs Objektträger aus dem Gefäß entnehmen und die überschüssige Flüssigkeit abtropfen lassen.Platzieren Sie sie auf ein Tissue-Papier und geben Sie schnell 100 µL eines gekühlten Zellwand-Digentionsenzyms hinzu. Verteilen Sie die Mischung auf den Objektträgern. Anschließend decken Sie die Objektträger mit großen Deckgläsern ab.Die Objektträger zwei Stunden bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Kammer inkubieren. Es ist wichtig, die Verdauungstemperatur für jedes neue enzymatische Reagenz zu optimieren, da dieser Schritt für eine homogene Färbung später entscheidend ist. Die Objektträger anschließend zweimal mit PBT waschen, wobei jede Waschung fünf Minuten dauert.Danach die Objektträger abtropfen lassen und auf jeden Objektträger 100 Mikroliter RNAs A in PBS, ergänzt mit 1 % Tween, geben. Die Objektträger anschließend eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Kammer inkubieren. Nach der Inkubation die Objektträger zweimal wie zuvor mit PBT waschen und das Gewebe erneut fixieren, indem die Objektträger in einem Bad aus frisch hergestelltem PBTF für 20 Minuten inkubiert werden. Danach das PBTF mit einer 10-minütigen Wäsche in PBT abspülen.Danach fortfahren mit der Gewebedurchtr&auml;nkung, indem die Objekttr&auml;ger zwei Stunden bei vier Grad Celsius in PBS mit 2 % Tween inkubiert werden. Verwenden Sie zwei Waschschritte in PBT jeweils f&uuml;nf Minuten lang, um die Permeabilisierungsl&ouml;sung zu entfernen. Danach fortfahren mit der Immunf&auml;rbung.Beginnen Sie mit der Inkubation der Objektträger im primären Antikörper der Wahl. Geben Sie 100 µL-Aliquote des in PBS mit 0,2 % Tween verdünnten Antikörpers auf jeden Objektträger. Überführen Sie die Objektträger in eine feuchte Kammer und inkubieren Sie sie bei vier Grad Celsius für 12 bis 24 Stunden.Die Objektträger zwei bis vier Stunden bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln in einem PBT-Bad waschen. Anschließend 100 Mikroliter sekundären Antikörper, im Verhältnis 1 zu 200 in PBS mit 0,2 % zwischen 20 und verdünnt, hinzufügen und die Objektträger 24 Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Ein einstündiges Bad in PBT mit sanftem Schütteln reicht aus, um nicht gebundenen sekundären Antikörper von den Objektträgern zu entfernen.Danach die DNA mit einer Lösung von 10 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumjodid in PBS kontrastfärben. Die Färbung 15 Minuten lang einwirken lassen und anschließend die Objektträger mit PBT unter sanftem Schwenken 15 Minuten bei Raumtemperatur waschen. Anschließend die Objektträger mit einem Anti-Fade-Medium, das mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumjodid ergänzt ist, aufnehmen.Nach einer Einwirkzeit von einer Stunde die Präparate auf einem konfokalen Mikroskop mit einer 63x-Glycerin-Immersionsoptik aufnehmen. Während der Bildaufnahme ist es entscheidend, die Scan-Einstellungen zwischen den Proben identisch zu halten, um einen vergleichenden quantitativen Vergleich zu ermöglichen, und einen linearen Detektionsmodus zu verwenden. Anschließend die Serienbilder zu dreidimensionalen Strukturen rekonstruieren, jeden interessierenden Zellkern segmentieren und eine 3D-Bildverarbeitungssoftware zur Signalquantifizierung nutzen.Mit diesem robusten Protokoll zur großskaligen Aufbereitung behalten ganze Mount-Vue-Proben ihre dreidimensionale Struktur bei. Subzelluläre Strukturen werden mit hoher Detailgenauigkeit sichtbar, wie beispielsweise Chromatin. Bei der DNA-Färbung erscheint heterochromatisches Chromatin als helle, scharf umrissene Foci, ohne dass eine Entfaltung notwendig ist.Dieses Protokoll ermöglicht paralleles Immunofärbungen mit mehreren Antikörpern in einer Runde. Zum Beispiel wurden der mit U-Chromatin assoziierte permissive Marker, H3-trimethyliertes Lysin 4, und der mit Heterochromatin assoziierte Marker H3-monomethyliertes Lysin 27, beide in einem Experiment auf separaten Replikat-Präparaten nachgewiesen, um die Chromatindynamik zu analysieren. Eine weitere kompatible Technik ist die fluoreszierende C-Zwei-Hybridisierung oder FISH an 45S-Ribosomen.Es wurden DNA-Wiederholungen verwendet, um nukleäre Organisationsbereiche zu definieren. Die Sonde wurde direkt mit Alexa 488 markiert, und die DNA wurde für die Identifikationsanalyse kontrastgefärbt. Es ist sehr wichtig, verschiedene Antikörperverdünnungen und Inkubationszeiten zu testen, um die Bedingungen zu ermitteln, die ein robustes und homogenes Signal bei gleichzeitig möglichst geringer Antikörperverdünnung liefern.Da diese Methode eine hervorragende Gewebeerhaltung und optimale Durchlässigkeit für die Einzelzellanalyse der Chromatinorganisation ermöglicht, eröffnet sie Wissenschaftlern auf dem Gebiet der Pflanzenzellbiologie oder der pflanzlichen Epigenetik die Möglichkeit, die nukleäre oder subzelluläre Organisation auf Einzelzellebene und im gesamten pflanzlichen Kontext zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir berichten über eine effiziente und einfache Methode, um Embryonen in frühen Stadien der Entwicklung Isolat...

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

Chromatinimmunpräzipitation ist eine leistungsstarke Technik zur Identifizierung von DNA-Bindungsstellen von Arabidopsis-Proteine ​​in vivo. Dieses Verfahren besteht aus Chromatin Vernetzung und Fragmentierung, Immunopräzipitation mit selektiver Antikörper gegen das Protein von Interesse und qPCR-Analyse der gebundenen DNA. Wir beschreiben eine einfache ChIP Assay für Arabidopsis-Pflanzen optimiert.

Chromatinimmunpräzipitation Assay zur Identifizierung von Arabidopsis-Protein-DNA-Wechselwirkungen<em&gt; In-vivo-</em

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Beobachtung der Embryogenese in Arabidopsis über Ovulum Abstand gefolgt von der Inspektion der Embryo Musterbildung unter dem Mikroskop.

Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis

Dieses Manuskript beschreibt eine in-vitro- Ovulum Anbaumethode, die live Cell Imaging von Arabidopsis Zygoten und Embryonen ermöglicht. Diese Methode wird genutzt, um die intrazellulären Dynamik während der Zygote Polarisation und die Zelle Schicksal Spezifikation bei der Entwicklung von Embryonen zu visualisieren.

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

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Vollständig-hängen Clearing und Färbung des Arabidopsis Blume Organe und Siliques

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Bewertung des Düngezustands durch Rückverfolgung der Sperma-Kernmorphologie in Arabidopsis Doppeldüngung

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Aufbereitung von intaktem Gewebe für die mikroskopische Analyse der Endosperm-Zellschicht in sich entwickelnden und reifen Arabidopsis-Samen

Die Chromosomenbewegung während der meiotischen Prophase ist ein wenig verstandenes Phänomen, das für die Sporenbildung von grundlegender Bedeutung ist. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erfassung, Analyse und Quantifizierung von Zentromerbewegungen während der meiotischen Prophase in männlichen Meiozyten von Arabidopsis thaliana .

Live-Imaging-Charakterisierung von Zentromerbewegungen während der männlichen meiotischen Prophase in Arabidopsis thaliana

Dieses Protokoll bietet einen effizienten Arbeitsablauf für die mikroskopische Mikroskopieabbildung isolierter Arabidopsis-Kerne durch optimierte Isolierung, Fixierung und Markierung, um eine zuverlässige nanoskalige Visualisierung von Chromatin und RNA-Polymerase II zu erreichen. Dieser Ansatz kann leicht an andere chromatinassoziierte Proteine oder Histonmodifikationen für hochauflösende Bildgebung angepasst werden.

Ein stromlinienförmiges Protokoll für Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie in Arabidopsis-Kernen

Dieses Immunlokalisationsprotokoll bei männlichen Maismeiozyten erhält während der Meiose die dreidimensionale Integrität der Zellen. Es ermöglicht die dynamische Verfolgung der intrazellulären Lokalisierung von bis zu drei unabhängigen Antikörpern in konserviertem, paraformaldehydfixiertem Material, zusätzlich zu DAPI, das DNA färbt.

Dreidimensionale Immunlokalisation bei Maismeiocyten

Dieser Prozess verwendet die Konfokalmikroskopie in Verbindung mit einer fluoreszenzmarkierten Kern- und Chromatinmarkerlinie bei Arabidopsis thaliana, um gleichzeitig die Kern- und Chromatindynamik in Arabidopsis-Wurzeln aufzuzeichnen und Veränderungen in dieser Dynamik als Reaktion auf Entwicklungs- und Umweltsignale zu untersuchen.

Quantitative lebende Zellbildgebung der Kernform und der Chromatindynamik während der Entwicklung und Umweltstress in der Wurzel Arabidopsis thaliana

Lernen Sie eine effiziente Methode zur Immunfärbung und FISH in Arabidopsis thaliana-Samenanlagen. Dieses Protokoll ermöglicht hochauflösende Einzelzellanalyse von Chromatinmodifikationen und Kernarchitektur.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in Arabidopsis (Video) | JoVE Journal

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