Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Arabidopsis Vues für die Ganzpräparat-Hybridisierung und Immuno-Färbung vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst frische Blütenknospen in der Fixierungslösung fixiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Vues vorsichtig zu dissekieren und in miniaturisierten Acrylamid-Pads direkt auf Mikroskopie-Objektträgern einzubetten.

Die anschließende Gewebeprozessierung ermöglicht die Klärung und Durchlässigkeit des Gewebes. Im letzten Schritt werden die behandelten Proben mit einer Antikörperlösung zur Immunfärbung oder mit einer markierten Sonde zur fluoreszenten in-situ-Hybridisierung inkubiert. Schließlich ermöglicht die hochauflösende konfokale Bildgebung in Kombination mit der dreidimensionalen Rekonstruktion eine quantitative Analyse im gesamten Präparat auf Einzelzellniveau.

Diese Methode wurde ursprünglich eingesetzt, um Einblicke in die CT-Organisation in der Ansicht zu erhalten, kann aber auch zur Analyse anderer Zellkompartimente in weiteren Geweben des Plunge sowie in anderen Modellorganismen angewendet werden. In Mikrozentrifugenröhrchen, die mit frisch hergestelltem, auf Eis gekühltem BBO-Puffer gefüllt sind, jeweils 20 bis 30 Karpalien pro Röhrchen geben und die Röhrchen vorsichtig eine halbe Stunde bei Raumtemperatur schwenken. Anschließend die Röhrchen eine Minute bei 400 × g zentrifugieren. Danach das Überstandvolumen vorsichtig abpipettieren, entsorgen und je ein Milliliter PBT zu den Karpalien hinzufügen. Die Röhrchen für jedes Röhrchen mit Karpalien auf Eis stellen, um sie einzubetten.

Auf Eis vorbereitet haben. Fünf Reagenzgläser mit jeweils 200 Mikrolitern. Eine frisch hergestellte 5%ige Acrylamid-Mischung.

Fünf saubere Super-Frost-Objektträger, die mit einem Bleistift beschriftet sind, eine gedachte Eloqua mit 20 % aPS und eine gedachte Eloqua mit 20 % NAPS aus einer Röhre mit Karpalien. Nehmen Sie vier oder fünf mit einem abgeschnittenen Spitzenende und platzieren Sie sie jeweils auf einen Objektträger. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit vorsichtig mit einer Pipette unter Verwendung feiner Nadeln.

Longitudinale Schnitte in die Karpalia machen und die Karpalwände entfernen, um die Reihen der Vues freizulegen. Dieser Schritt erfordert Übung. Verhindern Sie, dass die Vues austrocknen, indem Sie bis zu 10 Mikroliter PBS hinzufügen und anschließend in ein Mikrofugegefäß mit der Acrylamid-Mischung überführen.

Gebe schnell 12 Mikroliter NAPS und 12 Mikroliter eines PS zu. Mische die Lösung gründlich durch Pipettieren und füge anschließend schnell 30 Mikroliter dieses aktivierten Acrylamids hinzu. Verteile die Mischung auf einem Objektträger mit dissezierten Präparaten. Lege vorsichtig ein kleines Deckglas auf die Probe und lasse die Lösung etwa eine Stunde lang bei Raumtemperatur polymerisieren.

Bereiten Sie jeden Objektträger später auf diese Weise vor. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Deckgläser abzulösen. Die Proben können über Nacht bei vier Grad Celsius in einem Coplin-Behälter mit PBS aufbewahrt oder direkt weiterverarbeitet werden.

Die Verarbeitung sollte im Allgemeinen in Coplan-Gläsern mit 80 Milliliter Lösung und unter dem Abzug durchgeführt werden. Beginnen Sie mit der Klärung des Gewebes durch Inkubation in einer Lösungsreihe aus Methanol, Ethanol, einer eins-zu-eins-Ethanol-Xylol-Lösung und erneut in Ethanol und anschließend in Methanol.

Jedes Bad dauert fünf oder 30 Minuten. Siehe den textlichen Protokollabschnitt. Verwenden Sie anschließend eine Methanol-PBT-Lösung (1:1) mit 2,5 % Formaldehyd für 15 Minuten.

Anschließend das Gewebe zweimal für jeweils 10 Minuten in PBT spülen. Danach können die Objektträger über Nacht bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden, falls erforderlich. Danach bis zu sechs Objektträger aus dem Gefäß entnehmen und die überschüssige Flüssigkeit abtropfen lassen.

Platzieren Sie sie auf ein Tissue-Papier und geben Sie schnell 100 µL eines gekühlten Zellwand-Digentionsenzyms hinzu. Verteilen Sie die Mischung auf den Objektträgern. Anschließend decken Sie die Objektträger mit großen Deckgläsern ab.

Die Objektträger zwei Stunden bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Kammer inkubieren. Es ist wichtig, die Verdauungstemperatur für jedes neue enzymatische Reagenz zu optimieren, da dieser Schritt für eine homogene Färbung später entscheidend ist. Die Objektträger anschließend zweimal mit PBT waschen, wobei jede Waschung fünf Minuten dauert.

Danach die Objektträger abtropfen lassen und auf jeden Objektträger 100 Mikroliter RNAs A in PBS, ergänzt mit 1 % Tween, geben. Die Objektträger anschließend eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Kammer inkubieren. Nach der Inkubation die Objektträger zweimal wie zuvor mit PBT waschen und das Gewebe erneut fixieren, indem die Objektträger in einem Bad aus frisch hergestelltem PBTF für 20 Minuten inkubiert werden. Danach das PBTF mit einer 10-minütigen Wäsche in PBT abspülen.

Danach fortfahren mit der Gewebedurchtränkung, indem die Objektträger zwei Stunden bei vier Grad Celsius in PBS mit 2 % Tween inkubiert werden. Verwenden Sie zwei Waschschritte in PBT jeweils fünf Minuten lang, um die Permeabilisierungslösung zu entfernen. Danach fortfahren mit der Immunfärbung.

Beginnen Sie mit der Inkubation der Objektträger im primären Antikörper der Wahl. Geben Sie 100 µL-Aliquote des in PBS mit 0,2 % Tween verdünnten Antikörpers auf jeden Objektträger. Überführen Sie die Objektträger in eine feuchte Kammer und inkubieren Sie sie bei vier Grad Celsius für 12 bis 24 Stunden.

Die Objektträger zwei bis vier Stunden bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln in einem PBT-Bad waschen. Anschließend 100 Mikroliter sekundären Antikörper, im Verhältnis 1 zu 200 in PBS mit 0,2 % zwischen 20 und verdünnt, hinzufügen und die Objektträger 24 Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Ein einstündiges Bad in PBT mit sanftem Schütteln reicht aus, um nicht gebundenen sekundären Antikörper von den Objektträgern zu entfernen.

Danach die DNA mit einer Lösung von 10 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumjodid in PBS kontrastfärben. Die Färbung 15 Minuten lang einwirken lassen und anschließend die Objektträger mit PBT unter sanftem Schwenken 15 Minuten bei Raumtemperatur waschen. Anschließend die Objektträger mit einem Anti-Fade-Medium, das mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumjodid ergänzt ist, aufnehmen.

Nach einer Einwirkzeit von einer Stunde die Präparate auf einem konfokalen Mikroskop mit einer 63x-Glycerin-Immersionsoptik aufnehmen. Während der Bildaufnahme ist es entscheidend, die Scan-Einstellungen zwischen den Proben identisch zu halten, um einen vergleichenden quantitativen Vergleich zu ermöglichen, und einen linearen Detektionsmodus zu verwenden. Anschließend die Serienbilder zu dreidimensionalen Strukturen rekonstruieren, jeden interessierenden Zellkern segmentieren und eine 3D-Bildverarbeitungssoftware zur Signalquantifizierung nutzen.

Mit diesem robusten Protokoll zur großskaligen Aufbereitung behalten ganze Mount-Vue-Proben ihre dreidimensionale Struktur bei. Subzelluläre Strukturen werden mit hoher Detailgenauigkeit sichtbar, wie beispielsweise Chromatin. Bei der DNA-Färbung erscheint heterochromatisches Chromatin als helle, scharf umrissene Foci, ohne dass eine Entfaltung notwendig ist.

Dieses Protokoll ermöglicht paralleles Immunofärbungen mit mehreren Antikörpern in einer Runde. Zum Beispiel wurden der mit U-Chromatin assoziierte permissive Marker, H3-trimethyliertes Lysin 4, und der mit Heterochromatin assoziierte Marker H3-monomethyliertes Lysin 27, beide in einem Experiment auf separaten Replikat-Präparaten nachgewiesen, um die Chromatindynamik zu analysieren. Eine weitere kompatible Technik ist die fluoreszierende C-Zwei-Hybridisierung oder FISH an 45S-Ribosomen.

Es wurden DNA-Wiederholungen verwendet, um nukleäre Organisationsbereiche zu definieren. Die Sonde wurde direkt mit Alexa 488 markiert, und die DNA wurde für die Identifikationsanalyse kontrastgefärbt. Es ist sehr wichtig, verschiedene Antikörperverdünnungen und Inkubationszeiten zu testen, um die Bedingungen zu ermitteln, die ein robustes und homogenes Signal bei gleichzeitig möglichst geringer Antikörperverdünnung liefern.

Da diese Methode eine hervorragende Gewebeerhaltung und optimale Durchlässigkeit für die Einzelzellanalyse der Chromatinorganisation ermöglicht, eröffnet sie Wissenschaftlern auf dem Gebiet der Pflanzenzellbiologie oder der pflanzlichen Epigenetik die Möglichkeit, die nukleäre oder subzelluläre Organisation auf Einzelzellebene und im gesamten pflanzlichen Kontext zu untersuchen.