Immunofluoreszenz-Analyse von endogener und exogener Zentromer-Proteine ​​kinetochore

Das übergeordnete Ziel dieses indirekten Immunfluoreszenz-Assays ist es, die Lokalisierung und Quantifizierung von endogenen und exogenen Zentromer-Kinetochor-Proteinen, einschließlich des Zentromer-Protein-A und der flaggenmarkierten exogenen CENP-A-Proteine, in menschlichen Zellen zu optimieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur Identifizierung und Quantifizierung von Zentromer-Kinetochor-Proteinen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie verwendet werden kann, um verschiedene Niveaus der Zentromer-Kinetochor-Expression abhängig von der ausgewählten Anaphase zu quantifizieren.

Waschen Sie die kultivierten Zellen 18 Stunden nach der Aussaat einmal mit PBS und geben Sie 500 Mikroliter reduziertes Serummedium in jede Vertiefung der sechswelligen Polystyrol-Kulturplatte. Als nächstes transfizieren Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit frisch zubereiteter A- und B-Mischlösung und inkubieren die Kulturen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Wechseln Sie nach viereinhalb Stunden das mit FBS und Antibiotika ergänzte mittlere bis hohe Glukose-DMEM und stellen Sie die Platte wieder in den Zellkultur-Inkubator.

48 bis 72 Stunden später aspirieren Sie das Zellkulturmedium und spülen die Zellen einmal mit PBS, wobei Sie die Kochsalzlösung an den Seiten der Kulturvertiefungen hinzufügen, um eine Störung der Zellen zu vermeiden. Fixieren Sie dann die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 30 Minuten bei 4 Grad Celsius. Am Ende der Fixierungszeit spülen Sie die Zellen zweimal mit Kb2-Puffer und permeabilisieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in Kb1-Puffer.

Spülen Sie dann die Zellen einmal mit Kb2-Puffer und blockieren Sie jede unspezifische Bindung mit der Zugabe von frischem Kb2-Puffer. Entfernen Sie nach fünf Minuten bei Raumtemperatur mit einer Pinzette die ausgesäten Deckgläser aus jeder der Vertiefungen und ziehen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift hydrophobe Barrieren um jede Deckglasprobe. Übertragen Sie die Deckgläser in eine neue Sechs-Well-Polystyrolplatte und tauchen Sie die Proben eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in den entsprechenden Primärantikörper.

Spülen Sie die Zellen dann dreimal mit Kb2-Puffer und markieren Sie sie für eine weitere Stunde bei 37 Grad Celsius mit dem entsprechenden Sekundärantikörper. Spülen Sie die Proben am Ende der Inkubation mit fünf 6-minütigen Waschgängen in Kb2-Puffer. Anschließend werden die Zellkerne fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit DapE-haltigem Kb3-Puffer beschriftet, gefolgt von ein bis zwei Waschgängen in Kb2-Puffer und dem erneuten Befüllen der Vertiefungen mit Kb2-Puffer.

Geben Sie nun für jedes Deckglas der Zellen einen Tropfen Eindeckmedium in die Mitte eines Objektträgers und entfernen Sie die Flüssigkeit aus den Zellproben. Legen Sie abschließend jede Probe vorsichtig auf die Mitte eines der vorbereiteten Objektträger und entfernen Sie überschüssiges Eindeckmedium mit einem Papiertuch. Wie in diesem repräsentativen Experiment beobachtet, waren die Expressionsniveaus des endogenen CENP-A-Proteins in den Gesamtzelllysaten von CUL4A-siRNA-transfizierten Zellen ähnlich wie die CENP-A-Expression in Luciferase-siRNA-transfizierten Zellen.

Darüber hinaus waren die Proteinspiegel von endogenem CENP-A in den Gesamtzelllysaten von RBX1 siRNA-transfizierten Zellen ähnlich wie die endogenen CENP-A-Spiegel der Luciferase siRNA-transfizierten Zellen, was darauf hindeutet, dass die CUL4A RBX1 E3-Ligase für die Lokalisierung von CENP-A in den Zentromeren erforderlich ist. CENP-A-Lysin-Mutanten verlieren ihre Fähigkeit, sich in den Zentromeren zu lokalisieren, was darauf hindeutet, dass die Ubiquitylierung von CENP-A K124 für die Lokalisierung von CENP-A in den Zentromeren essentiell ist. Wichtig ist, dass die exogene Monoubiquitin-Fusion des CENP-A-Proteins die delokalisierte CENP-A K124R-Mutante rettete und das Protein an seinen zentromerischen Standort zurückbrachte.

Sobald sie gemeistert sind, können die Verfahren zur Zellfixierung und Immunfluoreszenzfärbung in fünf bis sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt werden. Denken Sie daran, alle Lösungen vorsichtig auf die Seiten der Vertiefungen aufzutragen, damit sich die Zellen beim Spülen oder Eintauchen der Proben nicht von ihren Deckgläsern lösen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit erhitztem Paraformaldehyd außerhalb eines belüfteten Raums oder dass brennbare Materialien in der Nähe von Feuer äußerst gefährlich sein können und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.