Name: Immunofluoreszenz-Analyse von endogener und exogener Zentromer-Proteine kinetochore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Lernen Sie die indirekte Immunofluoreszenz zur Lokalisierung und Quantifizierung endogener und exogener Zentromer-Kinetochor-Proteine in menschlichen Zellen. Diese Methode ermöglicht präzise Proteinanalysen.

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Diese Arbeit wurde von NIH Zuschusses GM68418 unterstützt.

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

In den letzten Jahren haben viele Studien unterschiedliche quantitative Mikroskopie - Assays für fixierte Zellen entwickelt. 42 Die Fortschritte in der Biologie Zentromer-Kinetochor erfordert oft ein Verständnis für die Zentromer-spezifischen oder kinetochore spezifische Funktion von Proteinen , von denen subzellulärer räumlich-zeitliche Regulation die wechselnden Funktionen widerspiegelt diese Proteine ​​während des Zellzyklus. Daher entwickelten wir hier Methoden der IIF-Färbung und einer quantitativen IIF-...

&quot;Zentromere&quot; wurden klassisch definiert als Regionen unterdrückter meiotischen Rekombination in der Genetik und später als primäre Einschnürung der mitotischen Chromosomen erkannt, die während der Mitose eine wesentliche Rolle bei der genauen Chromosomensegregation spielt. &quot;Kinetochore&quot; wurden als die Mehrschichtstrukturen beschrieben, die an der Oberfläche des Zentromeren an Mikrotubuli binden, wie durch Elektronenmikroskopie ergab; &quot;Kinetochore&quot; wurden später als die hochmolekularen Komplex definiert, die am Zentromer von mitotischen Chromosomen lokalisiert. Trotz einer dramatischen Divergenz der Zentromer-DNA-Sequenzen unter den Wirbeltieren, kinetochore Struktur und Zusammensetzung sind hoch konserviert. Eine dynamische Wechselwirkung zwischen Mikrotubuli und dem Spindel kinetochore für treue Segregation der Chromosomen während der Mitose erforderlich ist, und Defekte in Zentromer-kinetochore Funktion führen zu Aneuploidie und damit Krebs. Das Zentromer in den meisten Eukaryotenhat keine DNA-Sequenz definiert, wird aber von großen Arrays (0,3-5 Mb) repetitiver DNA alphoid bestehend aus 171-bp α-Satelliten-DNA zusammengesetzt ist. Außer in Bäckerhefe wird Zentromer Identität nicht von der DNA - Sequenz erreicht , sondern durch die Anwesenheit eines speziellen Nukleosomen, die die Histon - H3 - Variante CENH3 (Zentromer - Protein A [CENP-A] in Menschen) enthält. 5 CENP-A Nukleosomen lokalisieren zu der Innenplatte von Säugetier Kinetochore 7 und binden sich an das 171-bp - α-Satelliten - DNA. Aktive Romeren erfordern CENP-A-haltigen Nukleosomen die Rekrutierung eines konstitutiven Zentromer-assoziierten Netzwerk (CCAN) und die kinetochore Proteine ​​zu richten, die zusammen die Befestigung der Chromosomen auf die mitotische Spindel und nachfolgenden Zyklus Progression durch den Spindel-Checkpoint zu regulieren. In Anbetracht der obigen Beweis, CENP-A wurde vorgeschlagen , die epigenetische Markierung der Zentromer zu 8; jedoch ist der Prozess, mit dem CENP-A i inkorporiertnto Zentromer-DNA und die Faktoren für diese Integration verantwortlich sind noch nicht gut charakterisiert. Eine kurze Zentromer-Targeting - Domäne (CATD) in der Histon liegt Region CENP-A falten, und Ersatz des entsprechenden Bereichs von H3 mit dem CATD reicht aus, um direkten H3 an den Zentromer. 9 Mehrere Studien legten nahe , funktionelle Rolle für die post-translationale Modifikation (PTM) von CENP-A - 12-16; jedoch haben die molekularen Mechanismen dieser PTMs von CENP-A in der Einstellung zum Zentromeren noch nicht aufgeklärt. Wir bereits berichtet , dass CUL4A-RBX1-COPS8 E3 - Ligase - Aktivität für CENP-A K124 Ubiquitinierung und Lokalisierung von CENP-A bis Romeren erforderlich ist. 17 Die Entdeckung und Charakterisierung von kinetochore Proteine ​​, um neue Erkenntnisse in Bezug auf die Chromosomensegregation geführt. 18 Mehr als 100 kinetochore Komponenten in Zellen von Wirbeltieren durch verschiedene Ansätze identifiziert worden. 19,20 Ein unterStehen wie Kinetochore montieren und Funktion kommt auch von der Charakterisierung der zellulären Funktionen jedes Zentromer-Kinetochor - Proteinen und Protein-Protein - Netzwerk innerhalb von Zellen. 19 Direkte Visualisierung und fortschrittliche Bildgebungsverfahren in der Fluoreszenzmikroskopie liefern bemerkenswerte Auflösung von Zentromer-Kinetochor Komponenten und ermöglichen direkte Beobachtung der spezifischen molekularen Komponenten der Zentromer und Kinetochore. Darüber hinaus Methoden der indirekten Immunfluoreszenz (IIF) Färbung spezifische Antikörper verwenden, sind von entscheidender Bedeutung für diese Beobachtungen. Doch trotz zahlreicher Berichte über IIF - Protokolle, einige im Detail Probleme spezifischer Zentromer-Kinetochor Proteine ​​diskutiert. 1-4 So entwickeln und Berichtsmethoden IIF - Färbung und einer quantitativen IIF - Assay spezifisch jedes Zentromer-Kinetochor Protein analysieren ist extrem wichtig. In IIF Färbung sollte man mit dem Färbungsprotokoll gehen Verlust des Proteins von Interesse zu vermeiden oderder Rest der Zelle. Jedoch zerstört Fixierung Antigenstellen gelegentlich und verschiedenen Antikörper-Antigen - Kombinationen arbeiten schlecht mit einem Fixiermittel, aber sehr gut mit einer anderen, 21 und die Wahl des Fixierungs hängt weitgehend von der Protein (e) von Interesse. Aus diesem Grund sind verschiedene Fixiermittel Methoden entscheidend in IIF-Färbung von Zentromer-Kinetochor-Proteinen. Hier optimierte Verfahren der indirekten Immunofluoreszenz (IIF) -Färbung und einem Assay Lokalisation von endogenem Zentromer-kinetochore Proteine ​​zu adressieren, einschließlich CENP-A und FLAG-markiertem exogenem CENP-A-Proteine, und die Quantifizierung dieser Proteine ​​in menschlichen Zellen entwickelt wurden. Diese Verfahren können zur Analyse der Zentromer-kinetochore Proteine ​​in anderen Spezies verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11668</td><td>Transfektionsreagenz I</td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>13778</td><td>Transfektionsreagenz II</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>31985</td><td>Reduziertes Serummedium, warm in 37 μg; C Wasserbad vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>DMEM mit hohem Glukosegehalt (Dulbecco' s modifizierter Eagle" s medium)</td><td>Life Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>DMEM mit hohem Glukosegehalt, warm in 37 &°; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, zertifiziert, hitzeinaktiviert, Ursprung in den USA</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS (fötales Rinderserum)</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin SOLUTION</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>Poly-L-Lysin, 0,1 % w/v, in Wasser</td></tr><tr><td>UltraPure Distilled</td><td>Water Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>Steriles Wasser in Gewebekulturqualität&nbsp;</td></tr><tr><td>Micro Cover Glas (22 mm x 22 mm) &nbsp;</td><td>Surgipath</td><td>105</td><td>Deckglas (22 mm x 22 mm)</td></tr><tr><td>6-Well-Zellkultur-Cluster</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>6-Well-Polystyrolplatte</td></tr><tr><td>Penicillin, Streptomycin; Flüssigkeit</td><td>Fisher/Gibco</td><td>15-140</td><td>Penicillin-Streptomycin</td></tr><tr><td>PAP PEN</td><td>Binding Site</td><td>AD100.1</td><td>Hydrophober Barrierestift (für eine wasserabweisende Barriere bei der Immunfluoreszenzfärbung)</td></tr><tr><td>Paclitaxel (Taxol)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T7402</td><td>Taxol für die mitotische Zellanalyse</td></tr><tr><td>TN-16, Mikrotubuli-Inhibitor (TN16)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T120</td><td>TN16 für die mitotische Zellanalyse</td></tr><tr><td>BSA (Rinderserumalbumin)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>A7906</td><td>Blockierungsreagenz</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T8787</td><td>Reinigungsmittel für die Permeabilisierung</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6148</td><td>Fixiermittel</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>Für die nukleare Färbung</td></tr><tr><td>von p-Phenylendiamin</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td>Für Einbettmedium</td></tr><tr><td>VWR Micro Slides, mattiert</td><td>VWR International</td><td>48312-013</td><td>Mikro-Objektträger&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CENP-A-Antikörper</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>Monoklonaler Maus-Antikörper; Verdünnungsverhältnis 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anti-CENP-B-Antikörper</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>Monoklonaler Maus-Antikörper; Verdünnungsverhältnis 1:200 (IIF, Methanol/Aceton-Fixierung)-1:400 (IIF, Paraformaldehyd-Fixierung)</td></tr><tr><td>Anti-CENP-B-Antikörper</td><td>abcam</td><td>ab25734</td><td>Polyklonaler Kaninchen-Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:200 (IIF, Methanol/Aceton-Fixierung)-1:400 (IIF, Paraformaldehyd-Fixierung)</td></tr><tr><td>Anti-Zentromer-Antikörper (ACA)</td><td>Fitzgerald Industries International, Inc.</td><td>90C-CS1058</td><td>Antiserum für humane Zentromere; Verdünnungsverhältnis von 1:2000 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-CENP-H-Antikörper</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>BL1112 (A400-007A)</td><td>Polyklonaler Kaninchen-Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-CENP-H-Antikörper</td><td>BD</td><td>612142</td><td>monoklonaler Maus-Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-CENP-I-Antikörper</td><td>N/A, Dr. Katusmi Kitagawa</td><td>N/A, Dr. Katusmi Kitagawa</td><td>Polyklonaler Kaninchen-Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)</td></tr><tr><td>Anti-KNL1-Antikörper</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-89223</td><td>Kaninchen polyklonaler Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-Hec1 Antikörper</td><td>Novus Biologicals / GeneTex</td><td>NB 100-338 / GTX70268</td><td>Maus monoklonaler Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-Hec1 Antikörper</td><td>GeneTex</td><td>GTX110735</td><td>Kaninchen polyklonaler Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-Ska1-Antikörper</td><td>abcam</td><td>ab46826</td><td>Polyklonaler Kaninchen-Antikörper; Verdünnungsverhältnis 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-Flag-Antikörper</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F3165</td><td>Monoklonaler Maus-Antikörper; Verdünnungsverhältnis 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anti-Flag-Antikörper</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F7425</td><td>Polyklonaler Kaninchen-Antikörper; Verdünnungsverhältnis 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anti-CUL4A Antikörper</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>Kaninchen polyklonaler Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)</td></tr><tr><td>Anti-RBX1-Antikörper</td><td>Cell Signaling</td><td>4397</td><td>Polyklonaler Kaninchen-Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:2000 (WB)</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH-Antikörper</td><td>Chemicon</td><td>MAB374</td><td>monoklonaler Maus-Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus-IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11001</td><td>Fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG Life</td><td>Technologies/Invitrogen</td><td>A11005</td><td>Fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG Life</td><td>Technologies/Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11012</td><td>Fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper)</td></tr><tr><td>Fettfreies Milchpulver (zugelassener Ersatz für Nelkenpulver)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9255871 (Nachbestellung Nr. 190915; Los# 90629)</td><td>Magermilch</td></tr><tr><td>Leica DM IRE2 motorisiertes Fluoreszenzmikroskop&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>motorisiertes Fluoreszenzmikroskop&nbsp;</td></tr><tr><td>HCX PL APO 63x Öl-Tauchobjektiv</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td><td>63X Öl-Tauchobjektiv</td></tr><tr><td>HCX PL APO 100x Öl-Tauchobjektiv</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td><td>100X Öl-Tauchobjektiv</td></tr><tr><td>Leica EL6000 Kompaktlichtquelle</td><td>Leica</td><td></td><td>Externe Kompaktlichtquelle für Fluoreszenzanregung</td></tr><tr><td>ORCA-R2 Digitale CCD-Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600-10B</td><td>digitale CCD-Kamera</td></tr><tr><td>Openlab Version 5.5.2 Software für die wissenschaftliche Bildgebung&nbsp;</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>Für die Beobachtung, Erfassung, Quantifizierung und Analyse von Bildern</td></tr><tr><td>Velocity Version 6.1.1 3D-Bildanalysesoftware&nbsp;</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>Für die Bildbetrachtung, -erfassung, -quantifizierung und -analyse</td></tr><tr><td>Vollständiger EDTA-freier Proteaseinhibitor-Cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001/11836170001</td><td>Proteasehemmer-Cocktailtabletten</td></tr><tr><td>PlusOne 2-D Quant Kit</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80-6483-56</td><td>Kommerzielles Proteinassay-Reagenz I zur Messung der Proteinkonzentration (kompatibel mit 2 % SDS)</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>Kommerzielles Protein-Assay-Reagenz II zur Messung der Proteinkonzentration (kompatibel mit 0,1 % SDS)</td></tr><tr><td>Immobilon-FL</td><td>EMD Millipore</td><td>IPFL00010</td><td>PVDF-Membran zum Transfer von</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32210</td><td>IR-Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper); Verdünnungsverhältnis von 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32221</td><td>IR Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper); Verdünnungsverhältnis von 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG DyLight 549</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35507</td><td>DyLight-konjugierter SekundärantikörperIR-Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper); Verdünnungsverhältnis von 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-DyLight 649</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35565</td><td>DyLight-konjugierter SekundärantikörperIR-Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper); Verdünnungsverhältnis von 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2005</td><td>HRP-konjugierter SekundärantikörperDyLight-konjugierter SekundärantikörperIR-Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper Antikörper); Verdünnungsverhältnis von 1:10000 (IIF)</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2004</td><td>HRP-konjugierter SekundärantikörperDyLight-konjugierter SekundärantikörperIR-Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper); Verdünnungsverhältnis von 1:10000 (IIF)</td></tr><tr><td>Openlab Version 5.5.2. Wissenschaftliche Bildgebungssoftware&nbsp;</td><td>Improvision/PerkinElmer</td><td></td><td>Software A</td></tr><tr><td>Volocity Version 6.3 3D-Bildanalyse-Software (Volocity-Erfassung)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software B1</td></tr><tr><td>Volocity Version 6.3 3D-Bildanalyse-Software (Volocity-Quantifizierung)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software B2</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td>Ultraschallgerät</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics Ultraschallgerät Microtip Step, Solid, Gewinde 9,5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&nbsp; 33995-325</td><td>Disruptorhorn für die Beschallung</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics Ultraschallgerät Microtip Tapered 6,5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&nbsp; 33996-185</td><td>Mikrospitze für die Beschallung</td></tr><tr><td>Odyssey CLx Infrarot-Bildgebungssystem&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>Infrarot-Bildgebungssystem für den Nachweis von Immunoblots</td></tr><tr><td>Image Studio Analysis Software Version 4.0&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>Software C</td></tr><tr><td>Molekularer Imager Versadoc MP4000 System&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Chemilumineszenz-Imager für den Immunoblot-Nachweis</td></tr><tr><td>Menge Eins 1-D-Analysesoftware&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Software D</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Substrat mit maximaler Empfindlichkeit</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>Hochempfindliches Substrat mit verbesserter Chemilumineszenz (ECL)</td></tr></tbody></table>

immunofluoreszenz-analyse von endogener und exogener zentromer-proteine ​​kinetochore

 Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Zentromere" und "Kinetochore" beziehen sich auf die Stelle, an der sich Chromosomen während der Zellteilung mit der Spindel verbinden. Die direkte Visualisierung von Zentromer-Kinetochor-Proteinen während des Zellzyklus ist nach wie vor ein grundlegendes Werkzeug zur Untersuchung des Mechanismus bzw. der Mechanismen dieser Proteine. Fortschrittliche bildgebende Verfahren in der Fluoreszenzmikroskopie bieten eine bemerkenswerte Auflösung der Zentromer-Kinetochor-Komponenten und ermöglichen die direkte Beobachtung spezifischer molekularer Komponenten der Zentromere und Kinetochore. Darüber hinaus sind Methoden der indirekten Immunfluoreszenzfärbung (IIF) mit spezifischen Antikörpern entscheidend für diese Beobachtungen. Trotz zahlreicher Berichte über IIF-Protokolle wurden jedoch nur wenige Probleme spezifischer Zentromer-Kinetochor-Proteine ausführlich diskutiert. 1-4 Hier berichten wir über optimierte Protokolle zur Färbung endogener Zentromer-Kinetochor-Proteine in menschlichen Zellen unter Verwendung von Paraformaldehyd-Fixierung und IIF-Färbung. Darüber hinaus berichten wir über Protokolle zum Nachweis von Flag-markierten exogenen CENP-A-Proteinen in menschlichen Zellen, die einer Aceton- oder Methanolfixierung unterzogen wurden. Diese Methoden sind nützlich für den Nachweis und die Quantifizierung endogener Zentromer-Kinetochor-Proteine und Flag-markierter CENP-A-Proteine, einschließlich solcher in menschlichen Zellen.

Immunfluoreszenz - Analyse von endogenen CENP-A unterstützt die Hypothese , dass CUL4A-E3 - Ligase für die Lokalisierung von CENP-A bis Romeren erforderlich ist Unsere jüngsten Studien zeigten , dass CUL4A-RBX1-COPS8 E3 - Ligase - Aktivität für die Ubiquitinierung von Lysin 124 (K124) auf CENP-A und Lokalisierung von CENP-A bis Romeren 17 zunächst erforderlich ist. Die Interphase-Zentro...

Hier berichten wir über Protokolle zum Nachweis endogener und exogener Zentromer-Kinetochor-Proteine in menschlichen Zellen und quantifizieren diese Proteinspiegel an Zentromeren-Kinetochoren durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung durch Verwendung von Fixierung (Paraformaldehyd-, Aceton- oder Methanol-Fixierung).

Immunofluoreszenz-Analyse von endogener und exogener Zentromer-Proteine ​​kinetochore

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Das übergeordnete Ziel dieses indirekten immunfluoreszenten Assays besteht darin, die Lokalisation und Quantifizierung endogener und exogener Zentromer-Kinetochor-Proteine – einschließlich des Zentromer-Proteins A und flag-markierter exogener CENP-A-Proteine – in menschlichen Zellen zu optimieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Identifizierung und Quantifizierung von Zentromer-Kinetochor-Proteinen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie zur Quantifizierung unterschiedlicher Expressionsniveaus von Zentromer-Kinetochor-Proteinen in Abhängigkeit von der gewählten Anaphase verwendet werden kann.18 Stunden nach der Aussaat die kultivierten Zellen einmal mit PBS waschen und 500 Mikroliter Medium mit reduziertem Serum in jede Vertiefung der sechswelligen Polystyrolkulturplatte geben. Anschließend die Zellen in jeder Vertiefung mit frisch zubereiteter A- und B-Mischungslösung transfectieren und die Kulturen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Nach vier Stunden und dreißig Minuten das Medium durch hochglukoseses DMEM ergänzt mit FBS und Antibiotika ersetzen und die Platte in den Zellkulturinkubator zurückstellen.48 bis 72 Stunden später das Zellkulturmedium abpipettieren und die Zellen einmal mit PBS spülen, wobei die Salzlösung zur Vermeidung einer Störung der Zellen an den Seiten der Kulturgefäße abgegeben wird. Anschließend die Zellen 30 Minuten lang bei 4 Grad Celsius mit 4 % Paraformaldehyd fixieren. Am Ende der Fixierungszeit die Zellen zweimal mit Kb2-Puffer spülen und die Proben 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in Kb1-Puffer permeabilisieren.Anschließend die Zellen einmal mit Kb2-Puffer spülen und unspezifische Bindungen durch Zugabe von frischem Kb2-Puffer blockieren. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur die besiedelten Deckgläser mit einer Pinzette aus jedem der Wells entnehmen und mit einem hydrophoben Markierstift hydrophobe Barrieren um jede Probe auf dem Deckglas ziehen. Die Deckgläser in eine neue sechswellige Polystyrolplatte überführen und die Proben eine Stunde bei 37 Grad Celsius in der entsprechenden primären Antikörperlösung inkubieren.Anschließend die Zellen dreimal mit Kb2-Puffer spülen und mit dem geeigneten sekundären Antikörper für eine weitere Stunde bei 37 Grad Celsius markieren. Am Ende der Inkubation die Proben fünfmal jeweils sechs Minuten mit Kb2-Puffer waschen. Danach die Zellkerne mit Kb3-Puffer, der DapE enthält, für fünf Minuten bei Raumtemperatur anfärben, gefolgt von ein bis zwei Waschungen mit Kb2-Puffer und Auffüllen der Vertiefungen mit Kb2-Puffer.Platzieren Sie nun einen Tropfen Eindeckmedium in die Mitte eines Objektträgers für jedes Deckglas mit Zellen und entfernen Sie jegliche Flüssigkeit von den Zellproben. Legen Sie anschließend vorsichtig jede Probe in die Mitte eines der vorbereiteten Objektträger und entfernen Sie überschüssiges Eindeckmedium mit einem Papiertuch. Wie in diesem repräsentativen Experiment beobachtet, waren die Spiegel der endogenen CENP-A-Proteinexpression in den Gesamtzelllysaten von CUL4A-siRNA-transfizierten Zellen vergleichbar mit den CENP-A-Expressionsspiegeln in Luciferase-siRNA-transfizierten Zellen.Weiterhin waren die Proteinspiegel des endogenen CENP-A in den Gesamtzelllysaten von RBX1-siRNA-transfizierten Zellen vergleichbar mit den endogenen CENP-A-Spiegeln in Luciferase-siRNA-transfizierten Zellen, was darauf hindeutet, dass die CUL4A-RBX1-E3-Ligase für die Lokalisation von CENP-A an den Zentromeren erforderlich ist. CENP-A-Lysin-Mutanten verlieren ihre Fähigkeit, sich in den Zentromeren anzuordnen, was darauf schließen lässt, dass die Ubiquitinierung von CENP-A an Lysin 124 (K124) für die Lokalisation von CENP-A an den Zentromeren essentiell ist. Bedeutsamerweise wurde durch die exogene Mono-Ubiquitin-Fusion des CENP-A-Proteins die Fehllokalisation der CENP-A-K124R-Mutante kompensiert, wodurch das Protein wieder an seinen zentromeren Ort zurückkehrt.Wenn die Techniken der Zellfixierung und immunfluoreszenzfarblichen Färbung einmal beherrscht sind, können die Verfahren bei sachgemäßer Durchführung innerhalb von fünf bis sechs Stunden abgeschlossen werden. Denken Sie daran, alle Lösungen vorsichtig an den Seiten der Vertiefungen aufzutragen, damit die Zellen beim Spülen oder Eintauchen der Proben nicht von ihren Deckgläsern gelöst werden. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit erhitztem Paraformaldehyd außerhalb eines belüfteten Raums oder mit brennbaren Materialien in der Nähe von Feuer äußerst gefährlich sein kann, und dass stets die geeigneten Vorsichtsmaßnahmen während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.

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Biology

Biologie

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Detektion von Histonmodifikationen durch Immunfluoreszenz und DNA-Sequenzen von DNA-FISH durch 3D-Mikroskopie und-Analysen (3D Immuno-DNA FISH) gefolgt.

Kombiniert Immunfluoreszenz und DNA FISH auf 3D erhaltene Interphase Nuclei, um Änderungen in 3D Nuclear Organization Study

Imaging von zentrosomale Proteine ​​während der Drosophila Spermatogenese ist eine leistungsfähige Methode, um neue Proteine ​​von entscheidender Bedeutung für die Biologie Zentrosom zu identifizieren sowie die besondere Funktion der bekannten Akteure in diesem Prozess aufzuklären.

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Cyclin-abhängige Kinase 1 (Cdk1) wird in der G2-Phase des Zellzyklus aktiviert und reguliert viele zelluläre Signalwege. Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine in-vitro- Kinase Assay mit Cdk1, wodurch die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites für zellulare Ziele von diesem wichtigen Kinase.

Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Wir haben eine Strategie, um zu reinigen und Bild eine große Anzahl von Centriolen in verschiedenen Ausrichtungen für Höchstauflösung Mikroskopie und Single-Teilchen im Durchschnitt entwickelt.

Isolation und Fluoreszenz-Imaging für Single-Particle-Rekonstruktion der Chlamydomonas Centriolen

CENP-A-Ubiquitylierung ist eine wichtige Voraussetzung für die CENP-A-Ablagerung am Zentromer, die durch Dimerisierung zwischen Zellteilung vererbt und für die Zelllebensfähigkeit unverzichtbar ist. Hier beschreiben wir die Analyse der Massenspektrometrie, um die Ubiquitylierung des MIT EYFP markierten CENP-A-Proteins (EYFP-CENP-A) zu identifizieren.

Massenspektrometrieanalyse zur Identifizierung der Ubiquitylierung von EIFP-A mit EYFP-Tags (EYFP-CENP-A)

Nach DNA-Schäden aktivieren menschliche Zellen wichtige Reparaturwege, um die Integrität ihres Genoms wiederherzustellen. Hier beschreiben wir die Methode der indirekten Immunfluoreszenz als Mittel, um DNA-Reparaturproteine zu erkennen, ihre räumliche und zeitliche Rekrutierung zu analysieren und die Protein-Protein-Interaktion an den Stellen von DNA-Schäden zu begutachten.

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

Hier wird ein Protokoll für die hochauflösende Bildgebung von Lebendzellen in intaktem Gewebe vorgestellt. Wir haben die Bedingungen für die Abbildung einer hochempfindlichen adulten Stammzellpopulation in ihrer nativen Gewebeumgebung standardisiert. Diese Technik beinhaltet das Ausbalancieren der zeitlichen und räumlichen Auflösung, um die direkte Beobachtung biologischer Phänomene in lebendem Gewebe zu ermöglichen.

Hochauflösende Live-Cell-Bildgebung subzellulärer Strukturen

Fehler in der Chromosomentrennung sind ein häufiges Merkmal bei Eizellen. Daher gibt die Untersuchung des Spindelanordnungs-Checkpoints wichtige Hinweise auf die Mechanismen, die zur Produktion gesunder Eier erforderlich sind. Das vorliegende Protokoll beschreibt drei komplementäre Assays zur Beurteilung der Integrität des Spindelaufbau-Checkpoints in Maus-Oozyten.

Evaluation der Integrität des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints in Maus-Eizellen

Die Zeitraffer-Mikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Meiose in knospender Hefe. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die Zellzyklus-Synchronisation, Zeitraffer-Mikroskopie und bedingte Depletion eines Zielproteins kombiniert, um zu zeigen, wie die Funktion eines bestimmten Proteins während der meiotischen Chromosomentrennung untersucht werden kann.

Einsatz von Zeitraffer-Mikroskopie und stadienspezifischer Kerndepletion von Proteinen zur Untersuchung der Meiose bei S. cerevisiae

Die Chromosomenbewegung während der meiotischen Prophase ist ein wenig verstandenes Phänomen, das für die Sporenbildung von grundlegender Bedeutung ist. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erfassung, Analyse und Quantifizierung von Zentromerbewegungen während der meiotischen Prophase in männlichen Meiozyten von Arabidopsis thaliana .

Live-Imaging-Charakterisierung von Zentromerbewegungen während der männlichen meiotischen Prophase in Arabidopsis thaliana

Lernen Sie die indirekte Immunofluoreszenz zur Lokalisierung und Quantifizierung endogener und exogener Zentromer-Kinetochor-Proteine in menschlichen Zellen. Diese Methode ermöglicht präzise Proteinanalysen.

Immunofluoreszenz-Analyse von endogener und exogener Zentromer-Proteine ​​kinetochore

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