Immunofluoreszenz-Analyse von endogener und exogener Zentromer-Proteine kinetochore
3. März 2016
Hier berichten wir über Protokolle zum Nachweis endogener und exogener Zentromer-Kinetochor-Proteine in menschlichen Zellen und quantifizieren diese Proteinspiegel an Zentromeren-Kinetochoren durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung durch Verwendung von Fixierung (Paraformaldehyd-, Aceton- oder Methanol-Fixierung).
Das übergeordnete Ziel dieses indirekten Immunfluoreszenz-Assays ist es, die Lokalisierung und Quantifizierung von endogenen und exogenen Zentromer-Kinetochor-Proteinen, einschließlich des Zentromer-Protein-A und der flaggenmarkierten exogenen CENP-A-Proteine, in menschlichen Zellen zu optimieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur Identifizierung und Quantifizierung von Zentromer-Kinetochor-Proteinen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie verwendet werden kann, um verschiedene Niveaus der Zentromer-Kinetochor-Expression abhängig von der ausgewählten Anaphase zu quantifizieren.
Waschen Sie die kultivierten Zellen 18 Stunden nach der Aussaat einmal mit PBS und geben Sie 500 Mikroliter reduziertes Serummedium in jede Vertiefung der sechswelligen Polystyrol-Kulturplatte. Als nächstes transfizieren Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit frisch zubereiteter A- und B-Mischlösung und inkubieren die Kulturen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Wechseln Sie nach viereinhalb Stunden das mit FBS und Antibiotika ergänzte mittlere bis hohe Glukose-DMEM und stellen Sie die Platte wieder in den Zellkultur-Inkubator.
48 bis 72 Stunden später aspirieren Sie das Zellkulturmedium und spülen die Zellen einmal mit PBS, wobei Sie die Kochsalzlösung an den Seiten der Kulturvertiefungen hinzufügen, um eine Störung der Zellen zu vermeiden. Fixieren Sie dann die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 30 Minuten bei 4 Grad Celsius. Am Ende der Fixierungszeit spülen Sie die Zellen zweimal mit Kb2-Puffer und permeabilisieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in Kb1-Puffer.
Spülen Sie dann die Zellen einmal mit Kb2-Puffer und blockieren Sie jede unspezifische Bindung mit der Zugabe von frischem Kb2-Puffer. Entfernen Sie nach fünf Minuten bei Raumtemperatur mit einer Pinzette die ausgesäten Deckgläser aus jeder der Vertiefungen und ziehen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift hydrophobe Barrieren um jede Deckglasprobe. Übertragen Sie die Deckgläser in eine neue Sechs-Well-Polystyrolplatte und tauchen Sie die Proben eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in den entsprechenden Primärantikörper.
Spülen Sie die Zellen dann dreimal mit Kb2-Puffer und markieren Sie sie für eine weitere Stunde bei 37 Grad Celsius mit dem entsprechenden Sekundärantikörper. Spülen Sie die Proben am Ende der Inkubation mit fünf 6-minütigen Waschgängen in Kb2-Puffer. Anschließend werden die Zellkerne fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit DapE-haltigem Kb3-Puffer beschriftet, gefolgt von ein bis zwei Waschgängen in Kb2-Puffer und dem erneuten Befüllen der Vertiefungen mit Kb2-Puffer.
Geben Sie nun für jedes Deckglas der Zellen einen Tropfen Eindeckmedium in die Mitte eines Objektträgers und entfernen Sie die Flüssigkeit aus den Zellproben. Legen Sie abschließend jede Probe vorsichtig auf die Mitte eines der vorbereiteten Objektträger und entfernen Sie überschüssiges Eindeckmedium mit einem Papiertuch. Wie in diesem repräsentativen Experiment beobachtet, waren die Expressionsniveaus des endogenen CENP-A-Proteins in den Gesamtzelllysaten von CUL4A-siRNA-transfizierten Zellen ähnlich wie die CENP-A-Expression in Luciferase-siRNA-transfizierten Zellen.
Darüber hinaus waren die Proteinspiegel von endogenem CENP-A in den Gesamtzelllysaten von RBX1 siRNA-transfizierten Zellen ähnlich wie die endogenen CENP-A-Spiegel der Luciferase siRNA-transfizierten Zellen, was darauf hindeutet, dass die CUL4A RBX1 E3-Ligase für die Lokalisierung von CENP-A in den Zentromeren erforderlich ist. CENP-A-Lysin-Mutanten verlieren ihre Fähigkeit, sich in den Zentromeren zu lokalisieren, was darauf hindeutet, dass die Ubiquitylierung von CENP-A K124 für die Lokalisierung von CENP-A in den Zentromeren essentiell ist. Wichtig ist, dass die exogene Monoubiquitin-Fusion des CENP-A-Proteins die delokalisierte CENP-A K124R-Mutante rettete und das Protein an seinen zentromerischen Standort zurückbrachte.
Sobald sie gemeistert sind, können die Verfahren zur Zellfixierung und Immunfluoreszenzfärbung in fünf bis sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt werden. Denken Sie daran, alle Lösungen vorsichtig auf die Seiten der Vertiefungen aufzutragen, damit sich die Zellen beim Spülen oder Eintauchen der Proben nicht von ihren Deckgläsern lösen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit erhitztem Paraformaldehyd außerhalb eines belüfteten Raums oder dass brennbare Materialien in der Nähe von Feuer äußerst gefährlich sein können und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.
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Übersicht
Diese Studie stellt Protokolle zur Detektion und Quantifizierung von Zentromer-Kinetochor-Proteinen in menschlichen Zellen mittels indirekter immunfluoreszenzchemischer Färbung vor. Die Methoden beinhalten verschiedene Fixierungstechniken, um die Lokalisation dieser Proteine zu optimieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Neurowissenschaften
- Proteinanaylse
Hintergrund
- Zentromer-Kinetochor-Proteine spielen eine entscheidende Rolle bei der Zellteilung.
- Das Verständnis ihrer Lokalisation und Expressionsspiegel ist für die Zellbiologieforschung von entscheidender Bedeutung.
- Die indirekte immunfluoreszenzchemische Färbung ist eine gängige Technik zur Untersuchung dieser Proteine.
- Unterschiedliche Fixierungsmethoden können die Detektion dieser Proteine beeinflussen.
Zweck der Studie
- Optimierung der Lokalisierung endogener und exogener Zentromer-Kinetochor-Proteine.
- Quantifizierung der Proteinspiegel an Zentromeren-Kinetochoren in menschlichen Zellen.
- Bereitstellung eines zuverlässigen Protokolls für Forschende auf diesem Gebiet.
Verwendete Methoden
- Indirekte immunfluoreszenztechnische Färbemethoden.
- Verwendung von Paraformaldehyd-, Aceton- oder Methanol-Fixierungsmethoden.
- Transfektion kultivierter Zellen mit spezifischen Protein-Konstrukten.
- Inkubation und Mediumwechsel zur Optimierung der Proteinexpression.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Lokalisierung des Zentromerproteins A und flag-markierter CENP-A-Proteine.
- Quantifizierung der Proteinmengen in verschiedenen Anaphasestadien.
- Nachweis der Wirksamkeit verschiedener Fixierungsmethoden.
- Vorstellung eines Protokolls, das an unterschiedliche experimentelle Anforderungen angepasst werden kann.
Schlussfolgerungen
- Die Studie bietet eine robuste Methode zur Untersuchung von Zentromer-Kinetochor-Proteinen.
- Die Ergebnisse können das Verständnis der Proteindynamik während der Zellteilung verbessern.
- Die Protokolle können für zukünftige Forschungsvorhaben in der Zellbiologie genutzt werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative immunfluoreszenzanalytische Untersuchung von Zentromer-Kinetochor-Proteinen ermöglicht eine präzise Aufklärung der Mechanismen der Chromosomen-Segregation, einem kritischen Wendepunkt in der Forschung zur Zellteilung. Diese Fähigkeit unterstützt eine vorhersagbare Zuverlässigkeit bei der Zielvalidierung und der Risikominderung hinsichtlich der Mechanismen in Entdeckungsprogrammen, die auf die Regulation der Mitose ausgerichtet sind. Robuste Arbeitsabläufe zur Lokalisierung und Quantifizierung endogener und exogener Proteine erleichtern Portfolioentscheidungen in der frühen Entdeckungs- und translationsmedizinischen Forschung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Visualisierung und Quantifizierung der Lokalisation von Zentromer-Kinetochor-Proteinen in menschlichen Zellen.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem Effekte genetischer oder chemischer Störungen auf die Proteintargetierung unterschieden werden können.
- Erleichtert die funktionelle Validierung von Kandidatenzielen, die an der Genauigkeit der Chromosomensegregation beteiligt sind.
- Bietet quantitative Referenzwerte für die Untersuchung von Signalwegen und die Überprüfung von Hypothesen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert validierte Immunfluoreszenz-Protokolle, die für das Hochdurchsatz-Screening von Mitose-Regulatoren anpassbar sind.
- Stellt eine reproduzierbare Detektion sowohl endogener als auch exogener Proteinvarianten über verschiedene experimentelle Bedingungen hinweg sicher.
- Ermöglicht quantitative Auswertungen, die für vergleichende Analysen in Wirkstoff- oder genetischen Screenings geeignet sind.
- Unterstützt die Standardisierung von Assays für vergleichende Studien zwischen verschiedenen Laboren und Plattformen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Ausrichtung an krankheitsrelevanten Modellen, indem die Detektion einer fehlerhaften Proteinallokation, die mit chromosomaler Instabilität verknüpft ist, ermöglicht wird.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem die Quantifizierung von Biomarkern in modifizierten Zellsystemen unterstützt wird.
- Erleichtert risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung auf Grundlage quantitativer Daten zur Proteinlokalisation.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Immunfluoreszenzprotokoll ist in den Fortschritt von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase integriert und unterstützt sowohl frühe mechanistische Studien als auch die nachgeschaltete Assay-Entwicklung zur Identifizierung von Leitverbindungen.
- Entdeckungsforschung: Ermöglicht die hypothesengeleitete Untersuchung der Funktion und Lokalisation von Zentromer-Kinetochor-Proteinen.
- Screening: Bietet quantitative, reproduzierbare immunfluoreszenzbasierte Nachweise für Screening-Kampagnen, die auf mitotische Signalwege abzielen.
- Analysen: Unterstützt den statistischen Vergleich von Proteinlokalisation und -expression zwischen experimentellen Gruppen.
- Translationale Forschung: Verbindet Erkenntnisse aus der Grundlagenforschung mit präklinischen Modellen, indem die Fehllokalisation von Proteinen quantifiziert wird, die für chromosomale Instabilitäts-Syndrome relevant ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet einen standardisierten und anpassbaren Workflow für unterschiedliche Proteine und Zellsysteme.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung und verringert mechanistische Unklarheiten in Studien zu Mitosewegen.
- Operationaler Wert: Bietet standardisierte, skalierbare Protokolle für reproduzierbare immunfluoreszenzanalytische Untersuchungen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich der Fortführung oder Einstellung von Projekten und die Kapitalnutzungseffizienz, indem robuste quantitative Daten bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Targets und Programmen basierend auf mechanistischen Erkenntnissen.
Umsetzungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Immunfluoreszenzmikroskopie und der quantitativen Bildanalyse.
- Setzt den Zugang zu validierten Antikörpern und hochwertiger Bildgebungsausrüstung voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise bei Fixierungs- und Färbeprotokollen über mehrere Arbeitsgruppen hinweg, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Kann auf verschiedene Zellmodelle angepasst werden, erfordert jedoch möglicherweise Optimierungen für spezifische Proteintags oder Fixierchemikalien.
- Sorgfältiger Umgang mit gefährlichen Reagenzien und die Einhaltung von Sicherheitsvorschriften sind unerlässlich.
