Imaging Zentrosomen in Fly Hoden

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, genetisch markierte Centro Somal-Marker zu verwenden, um nach neuen genetischen Mutationen zu suchen und die Funktion neu identifizierter Centro somal-Gene aufzudecken. Dies kann durch drei verschiedene Bildgebungsstrategien erreicht werden. Verfolgen Sie eine Bildgebung von lebenden Hoden, Spur B, chemische Fixierung der Hoden oder Spur C Immunfärbung.

Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Hoden von Fliegen zu isolieren, die genetisch markierte Centrissomalproteine exprimieren, woran eine sofortige Bildgebung folgen kann. Der zweite Schritt besteht darin, die Hoden chemisch zu fixieren, woran auch eine Bildgebung folgen kann. Drittens können die Hoden immungefärbt und dann abgebildet werden.

Letztendlich werden die Positionen der Zentriproteine durch Fluoreszenzmikroskopie identifiziert. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der zentralen Zone zu beantworten, wie z.B. die molekularen Grundlagen der Zentralbildung, die zentrale Elongation und die zentrale Trennung. Beginnen Sie mit der Isolierung von Drosophila-Hoden, wie in der JoVE-Publikation 2 6 4 1 beschrieben.

Nach der Isolierung der Hoden tauchen Sie die Probe in sechs Mikroliter frisch zubereiteten Dappy Firle-Puffer bei Raumtemperatur auf einem positiv geladenen Glasmikroskop-Objektträger. Warten Sie 10 Minuten und waschen Sie dann den überschüssigen DPI-Wert vorsichtig ab, indem Sie den Färbepuffer zweimal austauschen. Mit sechs Mikrolitern PBS.

Achte darauf, dass du die Hoden nicht wegspülst. Entfernen Sie die Lösungen vom Objektträger, indem Sie sie mit einem Stück Filterpapier ableiten. Sechs Mikroliter Volumen eignen sich gut für 18 Quadratmillimeter große Deckgläser.

Es hilft nun, mit einem scharfen Skalpell die Hoden in der Nähe des interessierenden Zelltyps zu durchstechen, und dies minimiert den Druck auf diese Zellen während des Quetschschritts. Legen Sie dann vorsichtig einen Deckzettel auf die Probe und versiegeln Sie diese mit Nagellack. Markieren Sie dann mit einem Stift die Position der Hoden auf dem Objektträger und fahren Sie mit der Bildgebung fort.

Nachdem Sie die Hoden isoliert haben, tauchen Sie sie in einen sechs Mikroliter Tropfen PBS auf einem positiv geladenen Glasobjektträger. Richten Sie die Hoden manuell linear oder nach Belieben aus. Verwenden Sie dann ein Stück Filterpapier, um das PBS abzuleiten und ersetzen Sie es durch sechs Mikroliter frisch zubereiteten festen Puffer.

Nach fünf Minuten im festen Puffer wischen Sie es mit einem Stück Filterpapier ab. Tauchen Sie die Probe nun für 10 Minuten in sechs Mikroliter frisch zubereiteten DPI-Färbepuffer. Waschen Sie die DPI weg, indem Sie sie durch zwei Sechs-Mikroliter-Volumen PBS ersetzen.

Legen Sie dann vorsichtig einen 18 Quadratmillimeter großen Deckzettel auf die Probe und versiegeln Sie diesen mit Nagellack. Markieren Sie dann die Position der Hoden auf dem Objektträger und fahren Sie mit der Bildgebung fort. Bereiten Sie für dieses Verfahren zunächst einige silikonisierte Abdeckgläser vor.

Tauchen Sie die Deckgläser zunächst eine Minute lang bei Raumtemperatur unter einem Abzug in eine kleine Schale mit silikonisierter Lösung, stellen Sie sicher, dass die Deckgläser vollständig freiliegen und nicht übereinander gestapelt sind. Waschen Sie anschließend die Einbezugseinlagen dreimal pro Wäsche eine Minute lang in Wasser. Folgen Sie mit drei einminütigen Wäschen in 70 % Ethanol und einer letzten einminütigen Wäsche in Wasser.

Lassen Sie dann die silikonisierten Abdeckeinlagen unter einem Abzug an der Luft trocknen. Nachdem Sie mehrere Hoden präpariert und einen Objektträger mit dem Probentyp graviert haben, fügen Sie dann fünf Mikroliter PBS auf den silikonisierten Deckglas hinzu und übertragen Sie die Hoden auf das Tröpfchen PBS. Für den Erfolg werden mehrere Deckgläser mit jeweils einem Hoden benötigt.

Als nächstes stechen Sie unter einem Präpariermikroskop vorsichtig in jeden der Hoden, wie zuvor gezeigt. Platzieren Sie nun vorsichtig ein positiv geladenes Glasmikroskop. Schieben Sie über das Deckglas, so dass sich das PBS gleichmäßig zwischen dem Deckglas und dem Objektträger verteilen kann.

Saugen Sie dann den überschüssigen Puffer zwischen Deckglas und Objektträger ab, wodurch der Druck auf die Hoden erhöht und sie gequetscht werden. Lassen Sie nun den vorbereiteten Objektträger in flüssigen Stickstoff fallen. Es können nun weitere Objektträger vorbereitet und dem Tank hinzugefügt werden.

Bevor Sie mit der großen Pinzette fortfahren, entfernen Sie einen der Objektträger aus dem flüssigen Stickstoff und entfernen Sie das Deckglas schnell mit einem Skalpell. Die Probe sollte auf dem Objektträger verbleiben, während das Deckglas von der Probe entfernt wird. Achten Sie darauf, dass Sie es nicht auf die Oberfläche der S-Rutsche schmieren.

Dies kann erreicht werden, indem der Deckel mit einem Skalpell in einer schnellen Bewegung abgebrochen wird. Inkubieren Sie nun die Objektträger in einem mit Methanol gefüllten Coplan-Färbeglas aus Glas. 15 Minuten bei minus 20 Grad Celsius gekühlt.

Übertragen Sie die Objektträger nach der Inkubation in ein Glas mit Aceton. Nach 30 Sekunden bei minus 20 Grad Celsius im Aceton gekühlt. Waschen Sie die Objektträger eine Minute lang in PBS bei Raumtemperatur.

Inkubieren Sie anschließend die Objektträger 10 Minuten lang in frisch vorbereitetem PBST, um unspezifische Stellen zu blockieren. Füllen Sie während der PBS-TB-Inkubation die Vertiefungen einer Feuchtigkeitskammer mit Wasser. Nehmen Sie nach 10 Minuten die Objektträger aus dem PBST und trocknen Sie jeden Objektträger um die Probe herum. Achten Sie darauf, die Probe selbst nicht zu trocknen. Während jede Folie getrocknet wird.

Legen Sie es in die Feuchtigkeitskammer. Es ist wichtig, den Bereich des Objektträgers, der die Probe umgibt, vor der Zugabe der Antikörperlösung zu trocknen. Dadurch wird sichergestellt, dass der Antikörper auf der Probe lokalisiert bleibt, wodurch ein Austrocknen während des Inkubationsschritts verhindert wird.

Geben Sie dann vorsichtig 100 Mikroliter des in frisch zubereitetem P-B-S-T-B-R verdünnten Primärantikörpers auf die Proben. Verwenden Sie eine Verdünnung von 1 bis 200 für nicht charakterisierte Antikörper. Legen Sie dann ein ein Quadratzentimeter großes Stück Paraform auf die Probe, um die Antikörperlösung zu verteilen und die Antikörperlösung vor dem Verdampfen zu schützen.

Lassen Sie die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie nach einer Stunde mit einer Pinzette vorsichtig das Paraform von den Objektträgern. Waschen Sie die Objektträger dann dreimal pro Waschgang fünf Minuten lang in PBST bei Raumtemperatur.

Übertragen Sie anschließend die Objektträger mit der Probe nach oben in die Feuchtigkeitskammer und geben Sie vorsichtig 100 Mikroliter Sekundärantikörper, verdünnt in PBST, BR, auf die Proben. Tragen Sie wie zuvor Paraform auf und warten Sie eine Stunde lang die Sekundärwäsche mit drei fünfminütigen Wäschen in PBST und dann drei fünfminütigen Wäschen in PBS. Tupfen Sie die Objektträger dann vorsichtig trocken, ohne die Proben zu berühren.

Fügen Sie sechs Mikroliter Eindeckmedium hinzu und bringen Sie ein Standard-Deckglas an. Nachdem Sie den Deckglas mit Nagellack versiegelt und die Position der Hoden markiert haben, fahren Sie mit der Bildgebung fort. Zentrosomen durchlaufen im Laufe der Spermatogenese mehrere morphologische und funktionelle Veränderungen.

Ein leicht beobachteter Prozess ist die Zentrosomenverlängerung bei Spermatogonien, der LAR-Marker ANA one GFP markiert die 0,6 Mikrometer lange Ole, die sich während der Spermatogenese verlängert und bei fast reifen Spermatiden eine Länge von 2,5 Mikrometern erreicht. Da Zentriöle von Drosophila-Spermien einzigartig lang sind, kann die Bildgebung verwendet werden, um quantitative Aussagen über die Zentrosomendehnung zu treffen. Im Vergleich zur Wildtyp-Morphologie wurden verschiedene Mutationen identifiziert, die das zentrale Wachstum verändern.

Zwei Beispiele sind immer frühe und Kanonenkugel-Mutationen, die die Spermatogenese vor Beginn der Meiose stoppen, aber die Cent-Elongation bei diesen Mutanten nicht blockieren. Cent-Öle der reifen Spermatozyten wachsen auf etwa 2,4 Mikrometer im Vergleich zu Cent-Ölen von Kontrollzellen, die eine maximale Länge von 1,8 Mikrometern erreichen. Einmal gemastert, kann Track A in 20 Minuten, Track B in 30 Minuten und Track C in drei bis fünf Stunden absolviert werden, je nach Stichprobengröße. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Zentrosom im Flug abbildet.