Name: Imaging Zentrosomen in Fly Hoden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Erfahren Sie bildgebende Verfahren für Zentrosomenproteine während der Drosophila-Spermatogenese. Diese Methode nutzt Fluoreszenzmikroskopie, um die Dynamik zentrosomaler Proteine zu untersuchen und neue Gene zu identifizieren.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium (R01GM098394) von NIH und National Institute of General Medical Sciences sowie Gewährung von 1.121.176 National Science Foundation unterstützt.

1. Spur A. Herstellung der Live-Testes <ol><li> Vorbereitung PBS durch Auflösen von 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, 0,24 g KH 2 PO 4 in 800 ml destilliertem Wasser und Einstellen des pH auf 7,4. Bringen Sie das Volumen auf 1 L und durch Autoklavieren sterilisieren. </li><li> Isolieren Hoden, wie zuvor beschrieben 27. </li><li> Bereiten DAPI-Färbung Puffer durch Verdünnung von 1 mg / ml Stamm 1 ug / ml in PBS. Verwenden Sie Aluminiumfolie um das Rohr aus Licht und bei -20 ° C schützen </li><li> Nach Isolierung der Hoden, tauchen die Probe in 6 ul der DAPI-Färbung Puffer auf einer positiv geladenen Glasobjektträger für 10 min. Hoden gut an im Handel erhältlich positiv geladene Objektträger, erlaubt eine einfache Manipulation der Probe. Positiv geladene Objektträger kovalent modifiziert, um eine statische positive Ladung an der Glasoberfläche zu verleihen. Ähnlich Polylysin-Beschichtung, fördert dies die Wechselwirkung des Testes with der Oberfläche der Folie. </li><li> Waschen Sie überschüssiges DAPI durch zweimaliges Ersetzen der Färbepuffer mit 6 ul PBS. Verwenden Sie ein Stück Filterpapier nach jedem Waschschritt Docht entfernt den Puffer. Seien Sie vorsichtig, um während jeder Wäsche nicht versehentlich entfernen Sie die Hoden zusammen mit dem Puffer. </li><li> In 6 ul PBS auf die Probe. Die Menge des verwendeten Puffers sollte für die Größe des Deckglases eingestellt werden. Die in diesem Protokoll vorgesehenen Volumina sind für einen 18 x 18 mm Deckglas. Optional: Es ist ratsam, die Hoden in der Nähe der relativen Lage der interessierenden Zelltyp zu durchstechen. Dies wird sicherstellen, dass ein minimaler Druck auf die Zellen während der Quetsch-Schritt, wodurch ihre strukturelle Integrität beibehalten. Piercing der Hoden durchgeführt mit einem scharfen, sauberen Skalpell werden. </li><li> Vorsichtig ein Deckglas auf der Probe. </li><li> Seal die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack, um sicherzustellen, dass der Puffer nicht aus den Live-Probe zu verdampfen, während imAlterung. </li><li> Mit einem Stift, um die Position der Hoden zur Erleichterung der Lokalisierung der Probe auf dem Objektträger zu bezeichnen und zur Bildgebung. </li><li> Waschen Sie überschüssiges DAPI-Färbung Puffer zweimal ersetzt den Puffer mit 6 ul PBS. Verwenden Sie ein Stück Filterpapier nach jedem Waschschritt Docht entfernt den Puffer. Achten Sie darauf, bei jedem Waschgang nicht versehentlich entfernen Sie die Probe zusammen mit dem Puffer. </li></ol> 2. Titel B. Herstellung von Fest Hoden <ol><li> Vorbereitung Fix Puffer durch Verdünnung 37% Formaldehyd in PBS-Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von 3,7% Formaldehyd in PBS 1x </li><li> Bereiten DAPI-Färbung Puffer durch Verdünnung von 1 mg / ml DAPI Lager 1 ug / ml in PBS. </li><li> Tauchen der Hoden in einem 6 ul Tropfen PBS auf einem positiv geladenen Objektträger aus Glas. </li><li> Manuelles orientieren die Hoden in einer linearen Weise oder als sonst bevorzugt. </li><li> Verwenden Sie ein Stück Filterpapier, um den Docht entfernt PBS und ersetzen Sie es mit 6 ul FixPuffer für 5 min. </li><li> Verwenden Sie ein Stück Filterpapier Docht entfernt die Fix-Puffer und tauchen die Probe in 6 ul der DAPI-Färbung Puffer für 10 min. </li><li> Vorsichtig einen 18 x 18 mm Deckglas auf der Probe. </li><li> Seal die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack, um sicherzustellen, dass der Puffer nicht aus der Probe zu verdampfen, während die Abbildung. </li><li> Mit einem Stift, um die Position der Hoden zur Erleichterung der Lokalisierung der Probe auf dem Objektträger zu bezeichnen und zur Bildgebung. </li></ol> 3. Titel C. Herstellung von immun Hoden Coverslip Silizieren: Tauchen mehrere 18 x 18 mm Deckgläsern in einem kleinen Fach mit Silizieren Lösung und Inkubation für 1 min bei Raumtemperatur unter einer Abzugshaube. Stellen Sie sicher, dass die Deckgläser sind komplett freigelegt und sind nicht auf der jeweils anderen gestapelt. <ol><li> Legen Sie die Probe in einer 5 ul Tropfen PBS auf der silikonisierten Deckglas. Richten Sie dieHoden wie gewünscht und durchbohren die Hoden mit einem scharfen Skalpell. Sanft statt einer positiv geladenen Glasobjektträger über das Deckglas, so dass der PBS gleichmäßig zwischen dem Deckglas und dem Objektträger verteilt werden. Mit einem kleinen Stück Filterpapier zu Docht entfernt die überschüssige Puffer zwischen dem Deckglas und Objektträger. Als Puffer wird durch das Filterpapier entfernt wird, wird der Druckanstieg der Hoden quetschen. Viele Proben sollten gleichzeitig hergestellt werden, wie einige können verloren gehen oder beschädigt werden, im Laufe des Protokolls. Ein Glas Stecher kann verwendet werden, um die Folien zu beschriften, wenn verschiedene Arten von Proben gleichzeitig zubereitet werden. <ol><li> Für 1 min jeweils in Wasser, gefolgt von 3x 1 min jeweils in 70% Ethanol und einem letzten Waschen für 1 min in Wasser Waschen Sie die Deckgläser 3x. Lassen Sie die silikonisierten Deckgläschen an der Luft trocknen unter einer Abzugshaube. </li></ol></li><li> Lassen Sie die Folien in flüssigem Stickstoff und lassen Sie die Probe für 5-10 min einzufrieren. </li><li> Entfernen Sie die Folien aus der liquid Stickstoff mit einer großen Pinzette. Verwenden Sie ein Skalpell, um das Deckglas schnell zu entfernen. Sollte die Probe auf dem Objektträger verbleiben. Achten Sie darauf, um die Probe während dieses Prozesses, indem das Deckglas auf dem Objektträger zu schmieren. </li><li> Die Folien in vorgekühltes Methanol Inkubation in einem Glas Coplin Küvette bei -20 ° C für 15 min. </li><li> Die Objektträger in einem Glasgefäß, Coplin Färbung vorgekühlt Aceton bei -20 ° C für 30 Sekunden. </li><li> Waschen Sie die Objektträger für 1 min in PBS bei Raumtemperatur mit einem Glas Coplin Küvette. </li><li> Vorbereitung PBST-B durch Hinzu PBS mit 0,1% Triton-X100 und 1% Rinderserumalbumin (BSA). 5% normalem Serum der gleichen Spezies wie die Wirts sekundären Antikörper (aus Schritt 3.14) anstelle des BSA verwendet, um die nichtspezifische Antikörperbindung hergestellt Sekundärhintergrundrauschen zu reduzieren. </li><li> Die Folien Inkubation für 10 min in PBST-B in einem Glas Coplin Küvette für unspezifische Seiten zu sperren. </li><li> Füllen Sie die Vertiefungender Feuchtekammer mit Wasser. Feuchtigkeit im Inneren der Kammer wird die Verdampfung von Antikörperlösungen von der Probe während der Inkubationsschritte minimieren. </li><li> Vorbereitung PBST-BR durch Hinzu PBST-B mit 100 ug / ml RNase A RNase A zersetzt RNA in der Probe und dient auch als ein zusätzliches Sperrmittel durch stark absorbierende an der Glasoberfläche. <ol><li> Legen Sie ein etwa 1x1 cm großes Stück Parafilm auf der Probe, um die Antikörperlösung gleichmäßig verteilt und die Antikörperlösung schützen verdampft. Schließen der Feuchtigkeitskammer und Inkubieren der Probe in dem primären Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Folien aus PBST-B. Verwenden Sie ein Stück Filterpapier, um den Bereich der Folie um die Probe zu trocknen, mit Vorsicht die Probe selbst nicht zu trocken. Schließlich legen Sie die Folie in der Feuchtigkeitskammer mit der Probe nach oben </li><li> Vorsichtig mit 100 ul des primären Antikörpers in PBST-BR auf der Oberseite des spec verdünntimen (1:200 ist in der Regel ein guter Ausgangskonzentration für nicht charakterisierte Antikörper). <ol><li> Decken Sie die Probe mit einem ca. 1 x 1 cm großes Stück Parafilm und schließen die Feuchtigkeit Kammer. Inkubieren der Probe in sekundären Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Öffnen Sie die Feuchtigkeitskammer und verwenden Pinzette vorsichtig die Parafilm von der Folie. Die Objektträger für 5 min Inkubation in PBST in einem Glas Coplin Küvette bei Raumtemperatur zu waschen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt drei Waschungen. </li><li> Entfernen Sie die Folien aus PBST-B und legen Sie sie in der feuchten Kammer mit der Probe nach oben ein. Vorsichtig mit 100 ul sekundären Antikörper in PBST-BR auf der Probe verdünnt. </li><li> Öffnen Sie die Feuchtigkeitskammer und verwenden Pinzette vorsichtig die Parafilm von der Folie. Wieder, waschen Sie die Probe 3x für jeweils 5 min in PBST in einem Glas Coplin Küvette gefolgt von 3x 5 min jeweils in PBS. </li><li> Verwenden Sie einen Kimwipe und Filterpapier<html> sorgfältig trocknen die Oberfläche der Folie vorsichtig berühren oder Trocknen der Probe zu vermeiden. </li><li> In 6 ul Montage Medien auf die Probe, decken Sie mit einem sauberen Deckglas (nicht mit Silikon beschichtet) und die Dichtung Ränder mit Nagellack. </li><li> Mit einem Stift, um die Position der Hoden zur Erleichterung der Lokalisierung der Probe auf dem Objektträger zu bezeichnen und zur Bildgebung. </li></ol> 4. Imaging Hinweise Imaging kann mit einem stehenden oder umgekehrten normalen Lichtmikroskop oder konfokalen Mikroskop erreicht werden. Es ist wichtig, dass das Mikroskop mit Phasenkontrast ausgestattet werden, insbesondere für die Abbildung von lebenden Proben Hoden (Spur A). Diese Funktion ist vor kurzem zur Verfügung stehen auf konfokalen Mikroskopen. Wenn die Hoden brechen spontan (Track A) wird die Spitze (Stammzellbereich) in der Regel intakt gehalten und ist leicht erkennbar, die eine gute Markierung, um zunächst finden und verwenden zur Orientierung. _content &quot;&gt; Centriolen sind ziemlich klein Strukturen und Bilder sollten daher mit 63X oder 100X Ziele, einen Zoomfaktor von 4-6X genommen werden, und eine Auflösung von mindestens 512 x 512 Bildpunkten, wenn möglich.

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Studium der Biologie in Zentrosom fly Hoden mit genetisch markierten zentrosomale Marker ist eine nützliche Methode für die Bewertung der Zentrosom Funktion und Aktivität sowohl in Wildtyp-und Mutanten-Kontext. Insbesondere ist Track A geeignet für ein schnelles Screening von zentrosomale Missbildungen wie Fehlbildungen, misegregation, Instabilität, oder abnorme Länge in dem Bemühen, neue Mutanten zu identifizieren. Weiterhin Spermatiden Zilien in lebenden Präparaten bleiben beweglich etwa 15 min nach der Sektion und die Verwendung von lebenden Hoden in Spur A erlaubt auch die Beweglichkeit der Spermien, um leicht gerichtet. Da die Aktivität der Spermien beweglich Flimmerhärchen direkt an Zentrosomenfunktion Zusammenhang können Assays durchgeführt, um die Effekte von Mutationen auf verschiedenen zentrosomale Ziliarfunktion bestimmen. Spur B können für spezifische Beobachtungen vor allem, wenn die statistischen Daten, wie zum Zählen der Anzahl von Centriole pro Zelle und oder die Anzahl der Zellen pro Zyste erforderlich ist. Track C ist am Wissel für detaillierte Beobachtungen, die Färbung mit Antikörpern erforderlich. Beispiele schließen Kennzeichnung eines bestimmten Zelltyp, wie Stammzellen, Färbung eines Proteins, das nicht über einen verfügbaren tag wie acetylierte Tubulin, oder um die Abwesenheit oder Fehllokalisierung von einem Protein in einer Mutante zu überprüfen. Bei der Abbildung Zentrosomen und Zentrosom bezogenen Strukturen, mit Hilfe von gentechnisch-markierten Marker anstatt Antikörper ist nicht nur experimentell einfacher, sondern bietet auch mehr robuste und reproduzierbare Ergebnisse. Daher ist der Einsatz von gentechnisch-markierten Proteine ​​zentrosomale ein zuverlässiger Ansatz für mechanistische und quantitative Analysen, die eine große Datenmenge benötigen. Beispielsweise wurde die Verwendung von genetisch markiert zentrosomale Marker für die Quantifizierung von Zentriol Länge besonders wertvoll. Eine solche Analyse hat ergeben, dass verschiedene Mutationen können auf der Basis der Variabilität in Zentriol Länge in zwei Kategorien eingeteilt werden. Eine Kategorie umfasst Mutationen, die change Centriol Länge, aber keinen Einfluss auf die Standardabweichung 1 und die andere Kategorie gehören Mutationen, die sowohl Centriol Länge und die Standardabweichung in der Länge 11 beeinflussen. Solche quantitativen Daten können nützliche Einblicke in die Funktion von bestimmten Genen zentrosomale bieten. Centrosomal Mutanten, defekt Zentriol Länge mit einer Zunahme der Standardabweichung aufweisen, können aufgrund einer Destabilisierung centriolar Struktur sein. Jedoch defekt Zentriol Länge mit einer normalen Standardfehler zeigen, dass die Mutation nicht strukturell destabilisieren Zentriol und eher aufgrund einer Änderung in regulatorischen Mechanismus Steuern Zentriol Länge sein. Aufgrund von Inkonsistenzen in der Immunfärbung sind quantitative Analysen schwer bei der Verwendung von Antikörper-Marker allein. Das Zentrosom ist eine große, komplexe proteinartigen Struktur und viele ihrer Proteine ​​nur in seinem Inneren vorhanden. Mit genetisch-markierten zentrosomaleMarker nicht die Antikörper erlaubt es konsequent kenn internen Komponenten der Zentrosomen, deren Epitope anderweitig unzugänglich Antikörper-Marker sein. Zum Beispiel Lokalisationsstudien von BLD10 Verwendung von Antikörpern findet sich das Protein an den distalen und proximalen Enden des Zentriol 13 angereichert werden, während BLD10-GFP zeigt eine gleichmäßige Verteilung 1. Allerdings ist es auch wichtig, die Höhe der Expression eines bestimmten genetisch markierte Protein zu betrachten, da diese Proteinverteilung beeinflussen. Lokalisierung von Sas-4-GFP-und SAS-6-GFP exprimiert unter ihrer endogenen an den proximalen Enden der Centriol 1,16,35 Auf der anderen Seite beschränkt, Sas-4-GFP-und SAS-6-GFP exprimiert unter der starke Ubiquitin-Promotor sind entlang der gesamten Länge des Zentriol 12,14 lokalisiert. Eine weitere wichtige Überlegung ist die Wirkung der genetischen Tag auf Proteinfunktion. Die Analyse, ob genetisch markierten Proteine ​​sind funktionell sein können testen durch die Einführung des transgenen Proteins in eine Mutante Hintergrund und prüft, ob die transgene Protein rettet die mutierten Phänotyp. Fixierung von Drosophila Hoden kann unter Verwendung einer Vielzahl von chemischen Fixiermittel werden. Hier beschreiben wir Fixierung sowohl mit Formaldehyd (Track B) und Methanol-Aceton-(Track C). Jedoch kann entweder Fixiermittel austauschbar verwendet werden und da verschiedene Fixiermittel chemisch stören nativen Antikörper-Epitope, muss die Auswahl des geeigneten Fixiermittel für Immun experimentell bestimmt werden. Die folgenden Fixiermittel und Inkubationsbedingungen werden üblicherweise verwendet: 3,7% Formaldehyd, 5 min bei Raumtemperatur; Methanol, 15 min bei -20 ° C, Aceton, 10 min bei -20 ° C Methanol, 15 min bei -20 ° C. gefolgt von Aceton, 30 sec bei 20 ° C, Ethanol, 20 min bei -20 ° C. Obwohl Fixation mit Aceton, Methanol und Ethanol nicht eine erweiterte Permeabilisierung Schritt für Immunfärbung Fixierung erfordern with Formaldehyd sollte von einem 1-stündigen Inkubation in PBST-B bei Raumtemperatur, um die Zellmembranen durchlässig zu machen und damit den Zugang zu intrazellulären Antikörper-Epitope folgen. Darüber hinaus sind bestimmte Fixative besser geeignet für bestimmte Antigene. Beispielsweise Formaldehyd funktioniert gut für die Fixierung von kleinen Proteinen, während Methanol und Aceton sind für die Fixierung von großen Molekülkomplexe 36 gut geeignet. Immunfärbung von Drosophila Hoden zuvor für die Beobachtung Chromatin-Strukturen und die Mikrotubuli-Zytoskeletts 29,37 beschrieben. Hier (Spur C) wurde das Verfahren für die Analyse von Strukturen zentrosomale genetisch markierte Proteine ​​enthält, optimiert. Wir liefern eine detaillierte Beschreibung dieses Verfahrens, um Menschen, die Erfahrung mit Arbeiten in Drosophila Hoden führen. Dieses Verfahren umfaßt auch Modifikationen, die Erhaltung und die Morphologie der Hoden, wie unter Verwendung von s zu verbesserniliconized Deckgläser und positiv geladene Objektträger aus Glas.

Drosophila Hoden eine geeignete Organsystem, eine Vielzahl von Zell-und Entwicklungsprozesse zu studieren und wurden ausgiebig über die Jahre 1-9 bewertet. Handschrift konzentriert sich auf die Verwendung von Drosophila Hoden Zentrosom, eine konservierte zelluläre Organelle zu studieren. Wie in anderen Systemen, das Zentrosom des Drosophila-Hoden-Funktion in der Mitose, Meiose und ciliogenesis 10. Zentrosomen aus einem Paar als Centriole durch einen komplexen Proteinnetzwerk bezeichnet als pericentriolar Material (PCM) umgeben bekannt Mikrotubuli-basierte Strukturen. Die Centriol Paar einer älteren Mutter Centriol und einer jüngeren Tochter Centriol besteht. Wenn die Zelle zur Mitose fortschreitet, beide Centriolen zu trennen, zu vervielfältigen, zu erwerben und eine große Menge von PCM zu bilden schließlich zwei verschiedene Zentrosomen. Das Zentrosom, die die ursprüngliche Mutter Centriol wird als Mutter und dem Zentrosom bezeichnet zentrOsome mit der Original Tochter Centriol wird als Tochter Zentrosom bezeichnet. Drosophila Hoden sind ideal für die Untersuchung der molekularen Grundlagen von Zentrosomen Biologie durch Fluoreszenzmikroskopie für eine Vielzahl von Gründen. <ol><li> Die meisten der Drosophila-Proteine, die für die Biologie Zentrosom in den Hoden erforderlich sind, unter den Eukaryoten konserviert, was darauf hindeutet, dass Einblick relevant Zentrosom Biologie in Menschen und anderen Spezies können durch das Studium der Zentrosomen in Drosophila gewonnen werden Hoden 1,11-14. </li><li> Darstellende Mutante Analyse in Drosophila bietet einen erheblichen Vorteil, da, im Gegensatz zu vielen anderen Modellen, zentrosomale Mutationen in Drosophila sind nicht embryonalen tödlich, so dass für klassische genetische Analyse von Zentrosom-Funktion. Diese einzigartige Funktion von Drosophila ist aufgrund der Anwesenheit der mütterlichen Beitrag, der während der kritischen Phasen der embryonalen entwi weiterhin bestehtpment. 1,11-14. So kann man a) Studie Mutationen, die Zentrosom Bildung vollständig zu beseitigen und b) zu studieren, das Schicksal eines normalen Zentrosom, das im frühen Embryo durch mütterliche Beitrag in einer mutierten Zusammenhang wurde gebildet, nachdem die mütterlichen Beitrag erschöpft ist (Prinzip der Methode in 11) beschrieben. </li><li> Funktionelle Transgene mit genetisch kodierten Fluoreszenzmarkern, die die Zentrosomen zu beschriften sind. Viele dieser Linien verwenden eigenen Promotor des Proteins, die Transkription des Transgens, um starke Überexpression verhindern zu fahren. Dies ist besonders wichtig, da die Überexpression von Proteinen häufig zu Artefakten, die mit der Analyse der Zentrosomenfunktion 1,11 stören. </li><li> Das Zentrosom Centriol und sind einzigartig in ganz lange Drosophila Spermatogenese, so dass für eine schnelle und einfache Analyse des Zentrosom durch Bildgebung. </li><li> Aufeinanderfolgenden Schritten in Spermatogenese und Zentrosom biology sind chronologisch entlang der Hoden organisiert, beginnend an der Spitze mit den Hoden Zentrosomen der Spermien-Stammzellen und endet an der Unterseite der Hoden mit verminderter Zentrosom Größe und Aktivität in reifen Samenzellen (Abbildungen 1 und 2). Dies ermöglicht eine einfache Identifizierung und Analyse von Zentrosom-Funktion während der verschiedenen Stadien der Entwicklung der Spermien. </li><li> Hoden werden leicht von männlichen Larven, Puppen und Erwachsene 27 seziert. </li><li> Während der Spermatogenese, das Zentrosom und seine Centriolen gehen durch mehrere kompositorische, strukturelle und funktionelle Staaten in der Mitose, Meiose und Bildung Cilium funktionieren. Während dieser Prozesse, die Zentrosom montiert, Dubletten, wandert, Anker auf bestimmte Teile der Zelle reift, dividieren, und schafft eine Wimper. Außerdem die Centriol der reifen Spermatiden führt zu einer centriolar Vorläufer namens der PCL ein. Auch in den reifen Spermatiden, das Zentrosom läuft einen Prozess cALLED Zentrosom Reduzierung wobei er verliert viele Komponenten des PCM und die Centriol (Abbildungen 1 und 2). So haben Studien in den Hoden erlauben es, mehrere Aspekte des Lebens wie Zentrosom Zentrosom Einlagerungen in den Stammzellen, Centriol Vervielfältigung, Centriol Stabilität, Centriol Dehnung, Centriol Trennung und Segregation, PCM Rekrutierung, ciliogenesis, PCL Bildung, Zentrosom Reduktion und Adresse astralen Mikrotubuli-Nukleation unter anderem. </li><li> Schließlich sind Studien Zentrosom Biologie von den anderen bekannten Eigenschaften von Drosophila, die es zu einem bevorzugten Modellorganismus für biologische Studien gemacht haben unterstützt. Dazu gehören eine kurze Generationszeit, einfache Genetik, sowie zufällige und gerichtete Mutagenese. </li></ol> Zusammen bilden die oben genannten Eigenschaften von Drosophila Hoden bietet ein Modell, wo das Zentrosom kann durch einfache, schnelle und detaillierte Bildgebung untersucht werden. Die beschriebenen Technikenin diesem Papier wurden angewendet, um viele Aspekte der Biologie einschließlich Zentrosom Centriol Bildung 11, 15 Centriol Vervielfältigung, PCM Einstellung 16, Zentrosom Regulierung 17 und 18 ciliogenesis zu untersuchen. Diese Techniken wurden auch angewendet, um das Zentrosom in anderen Bereichen der Biologie wie meiotischen Regelung 19 Spindelanordnung 20 und Zentrosom Aktivität in asymmetrischen Stammzellteilung 21 unter vielen anderen zu studieren. Imaging der Hoden in den Zentrosom beginnt mit Erhalt Fliegen, die genetisch-markierten Proteine ​​zu exprimieren zentrosomale und Isolierung der Hoden von männlichen Larven, Puppen oder Erwachsenen-Fliegen. Diese Fliegen sind von verschiedenen Forschungsgruppen 1,11,15,22-25. Die Larven Hoden enthalten alle Stadien der Spermatogenese vor der Meiose und sind nützlich bei der Analyse von Mutationen, die in der Puppe oder Erwachsener tödlich sind. Allerdings Spätpuppen oder junge adult Hoden sind die robustesten und enthalten alle Pre-und Post-Reifestadien der Spermatogenese, wodurch sie bevorzugt für die Analyse. Da die Anzahl der Spermien als der Fliegen Alter abnimmt, ist auch die Verwendung von adulten Hoden für die Untersuchung der Zentrosomen in Zusammenhang mit Alterung. 26 geeignet. Ein Verfahren zur Isolation von Hoden erwachsenen Fliegen ist bereits beschrieben worden 27. Imaging von Zentrosomen und deren Funktion in Drosophila Hoden kann über drei verwandten Titel, die hier (Abbildung 3) dargestellt werden, erreicht werden. Auswahl, welche Spur am besten geeignet ist, hängt von der Art der Frage der Prüfer Adressierung. Track A beinhaltet Bildgebung von Live-Hoden. Es ist die schnelle der drei Spuren kann jedoch nur angewendet, wenn Proben müssen nicht erhalten werden und wenn die Immunfärbung ist nicht erforderlich. In der Spur A werden die Hoden auf Objektträger (intakte, durchbohrt oder schneiden)und vorsichtig unter einem Deckglas gequetscht, um eine einzelne Schicht von leicht identifizierbaren Zellen zu bilden. Die Zellen werden dann unter Verwendung von sowohl Phasenkontrastmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Die Verwendung von Phasenkontrast ist besonders wichtig für die Analyse von Drosophila Hoden, weil sie Zell Informationen, die nicht mit anderen Formen von Durchlicht sichtbar ist und ermöglicht somit eine schnelle Identifizierung der verschiedenen Stadien der Samenentwicklung 28,29 zeigt. Allerdings Track A hat zwei Nachteile. Zuerst wird die morphologische Integrität der Zellen häufig beeinträchtigt, wenn die Hoden brochen werden. Zweitens, nicht fixierten Zellen innerhalb der Probe bewegen manchmal, was die Abbildung von mehreren konfokalen Schichten innerhalb einer bestimmten Region schwierig. Um die Analyse von spezifischen Zelltypen zu fördern, kann durchstochen oder Hoden, um den Weg des Hodens Brüchen, so dass unter dem Deck Quetschen minimal beeinflußt die Morphologie der Zelltyp von Interesse direkt geschnitten werden. Track B umfasst die chemische Fixierung der Hoden. Diese Spur ist ein Zwischenzeitaufwand für die Probenvorbereitung und hat den Vorteil, dass Festkörper können für eine spätere Analyse gespeichert werden. Darüber hinaus dient Fixierung Zellstrukturen steifer zu machen, minimiert die Bewegung der Probe während der Bildgebung. Allerdings wird Phasenkontrastmikroskopie viel weniger aussage nach chemischer Fixierung, so dass einige Stadien der Entwicklung der Spermien schwer zu identifizieren. Spur C ist der zeitintensiv, hat aber den zusätzlichen Vorteil, dass die Zellstrukturen fixiert und immunhistochemisch, so dass für die Visualisierung von Proteinen, die nicht mit den entsprechenden genetischen Tags vorhanden sind. Es gibt viele Antikörper sowohl im Handel und von verschiedenen Forschungsgruppen für Immunfärbung Zentrosomen und Zentrosom bezogenen Strukturen in Drosophila Hoden.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Positiv geladene Objektträger</td><td>AZER</td><td>Scientific EMS200A+</td><td></td></tr><tr><td>Feather Mikroskalpell</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72045-30</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyd oder Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-220</td><td></td></tr><tr><td>18x18 mm Deckgläser Nummer 1,5</td><td>VWR</td><td>48366 205</td><td></td></tr><tr><td>Nagellack</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-100ML</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>5 prime</td><td>2900142</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Glasgravierer</td><td>Dremel</td><td>290-01</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5 konfokales Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedien</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17985-10</td><td></td></tr><tr><td>Immuno-Flecken-Feuchtigkeitskammer,</td><td>Schwarzelektronenmikroskopie Sciences</td><td>62010-37</td><td></td></tr><tr><td>Coplin-Färbeglas aus Glas,</td><td>Schraubverschluss Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>70315</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging zentrosomen in fly hoden

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Zentrosomen konserviert Mikrotubuli-basierte Organellen, deren Struktur und Funktion Änderung drastisch während des Zellzyklus und der Zelldifferenzierung. Zentrosomen sind unerlässlich, um die Zellteilung während der Mitose Achse bestimmen und Zilien während der Inter Keime. Die Identität der Proteine, die diese dynamische Veränderungen vermitteln bleibt nur teilweise bekannt ist, und die Funktion von vielen der Proteine, die in diesen Prozessen in Verbindung gebracht wurden, ist immer noch rudimentär. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass Drosophila Spermatogenese ist ein leistungsstarkes System, um neue Proteine ​​entscheidend für Zentrosomenfunktion und Bildung sowie zu identifizieren, um Einblick in die besondere Funktion der bekanntesten Spieler im Zentrosom bezogenen Prozesse zu gewinnen. Drosophila ist ein etablierter genetischen Modellorganismus in dem Mutanten in zentrosomale-Gene lassen sich leicht erhalten und analysiert werden. Die jüngsten Fortschritte in der Empfindlichkeit und Auflösung der Lichtmikroskopie und derEntwicklung von robusten genetisch markiert zentrosomale Marker die Möglichkeit, Drosophila Hoden als eine einfache und zugängliche Modellsystem, um zu studieren Zentrosomen verwenden verwandelt. Dieses Papier beschreibt die Verwendung von genetisch markierten zentrosomale Marker zu genetischen Bildschirme für neue zentrosomale Mutanten durchzuführen und Einblicke in die spezifische Funktion der neu identifizierten Gene zu gewinnen.

Zentrosomen laufen mehrere morphologische und funktionelle Transformationen im Laufe der Spermatogenese. Diese Eigenschaft macht die Spermatogenese Hoden ein nützliches System, um verschiedene Aspekte der Biologie Zentrosom studieren. Ein solches Verfahren ist leicht beobachtet Zentrosom Dehnung. In Spermatogonien, die centriolar Marker Ana1-GFP markiert die 0,6 um lange Centriol (Abbildung 4a). Dies verlängert Centriol während der Spermatogenese und eine Länge von 2,5 um fast reife Spermatiden erreicht. Seit Centriolen in Drosophila Spermien sind einzigartig lang ist, können Bildgebung verwendet, um quantitative Aussagen über Zentrosom Dehnung (Abbildung 4b) zu machen. Analyse Zentriol Länge kann auch in einem mutierten Hintergrund ausgeführt werden und verschiedene Mutanten identifiziert, die Zentriol Wachstum (Fig. 5) zu ändern. Beispiele sind immer früh (Aly) und Kanonenkugel (können), dass Mutationen arrest Spermatogenese vor Beginn der Meiose 30 aber nicht Centriol Dehnung blockieren. In diesen Mutanten Centriolen der reifen Samenzelle wachsen, um über ~ 2,4 um im Vergleich zu Centriolen von Kontrollzellen, die ein Maximum von 1,8 um zu erreichen. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig1.jpg" alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig1highres.jpg"> Fig. 1 ist. Spermatogenese und Zentrosom Biologie. A) Entwicklung von Stammzellen und Spermatogonien. Alle Samenzellen stammen aus Stammzellen an der apikalen Spitze der Hoden gefunden. Jede Stammzelle teilt sich asymmetrisch, um eine Stammzelle, die die Mutter Zentrosom und eine Vorläufer Spermatogonie, die die Tochter erbt erbt Zentrosom 31 bilden. Als Spermatogonien Form, werden sie von zwei Zyste Zellen, die die Spermatozyten und Spermatiden während der Spermatogenese umgeben weiterhin umgeben. Spermatogonien Kluft 4 mal 16 Spermatogonien, die jeweils zwei Centriolen. B enthalten) Entwicklung der Spermatozyten und Meiose zu produzieren. Während Spermatozyten Entwicklung, Centriolen duplizieren noch einmal auf vier Centriolen in zwei Paare pro Zelle und 64 Centriolen pro Zyste organisiert generieren. Frühe während Spermatozyten Entwicklung, bewegt sich jede Centriol an der Plasmamembran, Docks, um es, und verlängert, um eine Struktur, die eine primäre Zilien 18,32-34 ähnelt bilden. In reifen Spermatozyten, Centriol Länge erreicht ~ 1,8 um. Die Zentrosomen spielen eine wesentliche Rolle in der Meiose. Während der Meiose I, die Centriol Paare, die immer noch an der Plasmamembran Schritt in Richtung der Mitte der Zelle befestigt sind und erstellen Einstülpungen der Zellmembran an ihren distalen Spitze. Das PCM um die Centriolen wächst, Keim für Astral Mikrotubuli und kolokalisiert mit der Spindelstange. Beim Übergang in Meiose II, trennt sich das Paar Zentriol so dass nur eine einzige Zentriol ist Präsentationt bei jeder Spindelstange. C) Spermiogenese. Am Ende der Meiose II hat der Frühe Runde Spermatide eine einzige Centriol zu der eingestülpte Plasmamembran angebracht. Ein großer runder mitochondrialen Derivat wird in der Nähe des Zellkerns und später beginnt, entlang der wachsenden Axonem Später in runden Spermatiden zu verlängern. Während der Spermatogenese, die Axonem Formen und verlängert in der Zytoplasma. Darüber hinaus erscheint eine neue centriolar Struktur wie die PCL (proximale Centriole Like) bekannt, in der Nähe des bereits existierenden Centriol ein. Am Ende der Spermatogenese, Zellen, die eine gemeinsame Zyste voneinander trennen, um vollständig ausgereift beweglichen Spermien zu werden. Die Diagramme der Spermatozyten Entwicklung (B) und Spermiogenese (C) zeigen nur eine Zelle der 16 Spermatozyten und Spermatiden 64, jeweils pro Zyste und nicht die Zyste Zellen darzustellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50938/50938fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier zur Ansicht groß</a>r Figur. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig2.jpg" alt="Figur 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig2highres.jpg"> 2. Die Drosophila-Testes. Die Lasche der Phasenkontrast-und GFP-Fluoreszenz-Aufnahme eines ganzen-mount Hoden die pan-centriolar Marker Ana-1-GFP-exprimierenden. Distinct Bereich entsprechend Platten 1-3 von Abbildung 1 sind durch eine gestrichelte rote Linie getrennt) Stammzellen und Spermatogonien, B) Spermatozyten und Meiose, C) Spermiogenese. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig3.jpg" alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig3highres.jpg"> 3. Gegen Tracks Imaging Zentrosomen in Drosophila Hoden. Abbildung 4. Zentrosom Dehnung während der Spermatogenese. A) Jede Stufe zeigt ein Phasenkontrastbild (links), Fluoreszenz-Bild (Mitte) und vergrößertes Bild der Zentrosom (rechts). Das Phasenkontrastbild zeigt die besondere Zellstadium auf der Grundlage der Position und der Morphologie der Zelle, Zellkern Nukleolus und Mitochondrien. Das Fluoreszenzbild zeigt DNA mit DAPI (blau) gefärbt. Das Zentrosom Bild zeigt von Zentrosomen Asterless-GFP (Asl, Top-Bilder) und Ana1-GFP (Ana1, Bild unten) gekennzeichnet. Ein weißer Kreis unterstreicht die Zellmembran in beiden Phasenkontrast-und Fluoreszenzbilder. Die gestrichelten Kreise weiße und die graue Kreis im Fluoreszenzbild zu markieren die Position des Kerns und Nukleolus sind. Gelber Pfeil auf den Y-Chromosomeinige Schleifen. Red gestrichelten Kreise markieren die Mitochondrien. Stufen 1-6 bezieht sich auf 29 und die Stufen 13 bis 17 bezieht sich auf Beschreibung der Zellstadien in 32. Stufe 1: Primäre Spermatozyten. Als kleine Zelle eine Spitze des Hoden identifiziert. Stufe 2a: Polar Spermatozyten. Von der Gegenwart eines Mitochondrien Kappe auf einer Seite des Kerns bezeichnet. Stufe 3: Apolare Spermatozyten. Durch ihre relativ größeren Größe als die identifizierten primären Spermatozyten und das Fehlen einer Kappe Mitochondrien. Stufe 4: Primäre Spermatozyten. Alle 3 Y-Chromosom Schlaufen: durch das Auftreten von alle identifiziert. Stufe 5: Ältere Primäre Spermatozyten. Größte Spermatozyten in Spermatogenese produziert, von einem weiteren Anstieg der Kerngröße identifiziert. Stage 6: Premeiotic Primäre Spermatozyten. Y-Chromosom Schleifen zerfallen und der Kern verschwindet. Stufe 13: Zwiebel Bühne Spermatide. Runde Zelle gleich großen Zellkern und Mitochondrien enthalten. Stufe 17: Späte Spermatide. Als länglicher Spermatiden, die Teil einer bundl bleibt identifizierte von 64 Spermatiden mit Kernen gefunden in der Nähe der Basis der Hoden. sind Kerne etwas breiter als reife Spermatiden in der Samenblase gefunden. Maßstabsbalken 10 &amp;mgr; m und 1 &amp;mgr; m. B) Grafik zeigt Mittelwert und Standardabweichung für jede Stufe wie Asterless-GFP-(blau) und Ana1-GFP (grün) gemessen. In Phase 6, Asterless-GFP-(blau) und Ana1-GFP (grün) Mittelwerte und Standardabweichungen überlappen und nur Asterless-GFP (blau) ist offensichtlich. Schon ab Stufe 13, hat Asterless-GFP nicht die ganze Centriol dekorieren und Messungen wurden nicht bestimmt (ND). <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig5.jpg" alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig5highres.jpg"> 5. Ungewöhnlich lange Centriolen in Stage 6 Spermatozyten von aly und kann Mutanten. AC) Lichtmikroskopische Aufnahme von ganzen Hoden und Leuchtstoffplatte der Vertreter Zentrosom lavon Ana1-GFP Beled. Beachten Sie die abnorme Form der Hoden in aly und kann Mutanten, die aus einem Mangel an Spermatiden als Folge der Meiosehemmung. D führt) Grafik zeigt Mittelwert, Standardabweichung und Datenverteilung Centriol Länge in Wildtyp-, aly und kann . Probennummer für jeden Datenpunkt ist in Klammern. Maßstabsbalken, 1 um.

Imaging von zentrosomale Proteine ​​während der Drosophila Spermatogenese ist eine leistungsfähige Methode, um neue Proteine ​​von entscheidender Bedeutung für die Biologie Zentrosom zu identifizieren sowie die besondere Funktion der bekannten Akteure in diesem Prozess aufzuklären.

Imaging Zentrosomen in Fly Hoden

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, genetisch markierte Centro Somal-Marker zu verwenden, um nach neuen genetischen Mutationen zu suchen und die Funktion neu identifizierter Centro somal-Gene aufzudecken. Dies kann durch drei verschiedene Bildgebungsstrategien erreicht werden. Verfolgen Sie eine Bildgebung von lebenden Hoden, Spur B, chemische Fixierung der Hoden oder Spur C Immunfärbung.Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Hoden von Fliegen zu isolieren, die genetisch markierte Centrissomalproteine exprimieren, woran eine sofortige Bildgebung folgen kann. Der zweite Schritt besteht darin, die Hoden chemisch zu fixieren, woran auch eine Bildgebung folgen kann. Drittens können die Hoden immungefärbt und dann abgebildet werden.Letztendlich werden die Positionen der Zentriproteine durch Fluoreszenzmikroskopie identifiziert. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der zentralen Zone zu beantworten, wie z.B. die molekularen Grundlagen der Zentralbildung, die zentrale Elongation und die zentrale Trennung. Beginnen Sie mit der Isolierung von Drosophila-Hoden, wie in der JoVE-Publikation 2 6 4 1 beschrieben.Nach der Isolierung der Hoden tauchen Sie die Probe in sechs Mikroliter frisch zubereiteten Dappy Firle-Puffer bei Raumtemperatur auf einem positiv geladenen Glasmikroskop-Objektträger. Warten Sie 10 Minuten und waschen Sie dann den überschüssigen DPI-Wert vorsichtig ab, indem Sie den Färbepuffer zweimal austauschen. Mit sechs Mikrolitern PBS.Achte darauf, dass du die Hoden nicht wegspülst. Entfernen Sie die Lösungen vom Objektträger, indem Sie sie mit einem Stück Filterpapier ableiten. Sechs Mikroliter Volumen eignen sich gut für 18 Quadratmillimeter große Deckgläser.Es hilft nun, mit einem scharfen Skalpell die Hoden in der Nähe des interessierenden Zelltyps zu durchstechen, und dies minimiert den Druck auf diese Zellen während des Quetschschritts. Legen Sie dann vorsichtig einen Deckzettel auf die Probe und versiegeln Sie diese mit Nagellack. Markieren Sie dann mit einem Stift die Position der Hoden auf dem Objektträger und fahren Sie mit der Bildgebung fort.Nachdem Sie die Hoden isoliert haben, tauchen Sie sie in einen sechs Mikroliter Tropfen PBS auf einem positiv geladenen Glasobjektträger. Richten Sie die Hoden manuell linear oder nach Belieben aus. Verwenden Sie dann ein Stück Filterpapier, um das PBS abzuleiten und ersetzen Sie es durch sechs Mikroliter frisch zubereiteten festen Puffer.Nach fünf Minuten im festen Puffer wischen Sie es mit einem Stück Filterpapier ab. Tauchen Sie die Probe nun für 10 Minuten in sechs Mikroliter frisch zubereiteten DPI-Färbepuffer. Waschen Sie die DPI weg, indem Sie sie durch zwei Sechs-Mikroliter-Volumen PBS ersetzen.Legen Sie dann vorsichtig einen 18 Quadratmillimeter großen Deckzettel auf die Probe und versiegeln Sie diesen mit Nagellack. Markieren Sie dann die Position der Hoden auf dem Objektträger und fahren Sie mit der Bildgebung fort. Bereiten Sie für dieses Verfahren zunächst einige silikonisierte Abdeckgläser vor.Tauchen Sie die Deckgläser zunächst eine Minute lang bei Raumtemperatur unter einem Abzug in eine kleine Schale mit silikonisierter Lösung, stellen Sie sicher, dass die Deckgläser vollständig freiliegen und nicht übereinander gestapelt sind. Waschen Sie anschließend die Einbezugseinlagen dreimal pro Wäsche eine Minute lang in Wasser. Folgen Sie mit drei einminütigen Wäschen in 70 % Ethanol und einer letzten einminütigen Wäsche in Wasser.Lassen Sie dann die silikonisierten Abdeckeinlagen unter einem Abzug an der Luft trocknen. Nachdem Sie mehrere Hoden präpariert und einen Objektträger mit dem Probentyp graviert haben, fügen Sie dann fünf Mikroliter PBS auf den silikonisierten Deckglas hinzu und übertragen Sie die Hoden auf das Tröpfchen PBS. Für den Erfolg werden mehrere Deckgläser mit jeweils einem Hoden benötigt.Als nächstes stechen Sie unter einem Präpariermikroskop vorsichtig in jeden der Hoden, wie zuvor gezeigt. Platzieren Sie nun vorsichtig ein positiv geladenes Glasmikroskop. Schieben Sie über das Deckglas, so dass sich das PBS gleichmäßig zwischen dem Deckglas und dem Objektträger verteilen kann.Saugen Sie dann den überschüssigen Puffer zwischen Deckglas und Objektträger ab, wodurch der Druck auf die Hoden erhöht und sie gequetscht werden. Lassen Sie nun den vorbereiteten Objektträger in flüssigen Stickstoff fallen. Es können nun weitere Objektträger vorbereitet und dem Tank hinzugefügt werden.Bevor Sie mit der großen Pinzette fortfahren, entfernen Sie einen der Objektträger aus dem flüssigen Stickstoff und entfernen Sie das Deckglas schnell mit einem Skalpell. Die Probe sollte auf dem Objektträger verbleiben, während das Deckglas von der Probe entfernt wird. Achten Sie darauf, dass Sie es nicht auf die Oberfläche der S-Rutsche schmieren.Dies kann erreicht werden, indem der Deckel mit einem Skalpell in einer schnellen Bewegung abgebrochen wird. Inkubieren Sie nun die Objektträger in einem mit Methanol gefüllten Coplan-Färbeglas aus Glas. 15 Minuten bei minus 20 Grad Celsius gekühlt.Übertragen Sie die Objektträger nach der Inkubation in ein Glas mit Aceton. Nach 30 Sekunden bei minus 20 Grad Celsius im Aceton gekühlt. Waschen Sie die Objektträger eine Minute lang in PBS bei Raumtemperatur.Inkubieren Sie anschließend die Objektträger 10 Minuten lang in frisch vorbereitetem PBST, um unspezifische Stellen zu blockieren. Füllen Sie während der PBS-TB-Inkubation die Vertiefungen einer Feuchtigkeitskammer mit Wasser. Nehmen Sie nach 10 Minuten die Objektträger aus dem PBST und trocknen Sie jeden Objektträger um die Probe herum. Achten Sie darauf, die Probe selbst nicht zu trocknen. Während jede Folie getrocknet wird.Legen Sie es in die Feuchtigkeitskammer. Es ist wichtig, den Bereich des Objektträgers, der die Probe umgibt, vor der Zugabe der Antikörperlösung zu trocknen. Dadurch wird sichergestellt, dass der Antikörper auf der Probe lokalisiert bleibt, wodurch ein Austrocknen während des Inkubationsschritts verhindert wird.Geben Sie dann vorsichtig 100 Mikroliter des in frisch zubereitetem P-B-S-T-B-R verdünnten Primärantikörpers auf die Proben. Verwenden Sie eine Verdünnung von 1 bis 200 für nicht charakterisierte Antikörper. Legen Sie dann ein ein Quadratzentimeter großes Stück Paraform auf die Probe, um die Antikörperlösung zu verteilen und die Antikörperlösung vor dem Verdampfen zu schützen.Lassen Sie die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie nach einer Stunde mit einer Pinzette vorsichtig das Paraform von den Objektträgern. Waschen Sie die Objektträger dann dreimal pro Waschgang fünf Minuten lang in PBST bei Raumtemperatur.Übertragen Sie anschließend die Objektträger mit der Probe nach oben in die Feuchtigkeitskammer und geben Sie vorsichtig 100 Mikroliter Sekundärantikörper, verdünnt in PBST, BR, auf die Proben. Tragen Sie wie zuvor Paraform auf und warten Sie eine Stunde lang die Sekundärwäsche mit drei fünfminütigen Wäschen in PBST und dann drei fünfminütigen Wäschen in PBS. Tupfen Sie die Objektträger dann vorsichtig trocken, ohne die Proben zu berühren.Fügen Sie sechs Mikroliter Eindeckmedium hinzu und bringen Sie ein Standard-Deckglas an. Nachdem Sie den Deckglas mit Nagellack versiegelt und die Position der Hoden markiert haben, fahren Sie mit der Bildgebung fort. Zentrosomen durchlaufen im Laufe der Spermatogenese mehrere morphologische und funktionelle Veränderungen.Ein leicht beobachteter Prozess ist die Zentrosomenverlängerung bei Spermatogonien, der LAR-Marker ANA one GFP markiert die 0,6 Mikrometer lange Ole, die sich während der Spermatogenese verlängert und bei fast reifen Spermatiden eine Länge von 2,5 Mikrometern erreicht. Da Zentriöle von Drosophila-Spermien einzigartig lang sind, kann die Bildgebung verwendet werden, um quantitative Aussagen über die Zentrosomendehnung zu treffen. Im Vergleich zur Wildtyp-Morphologie wurden verschiedene Mutationen identifiziert, die das zentrale Wachstum verändern.Zwei Beispiele sind immer frühe und Kanonenkugel-Mutationen, die die Spermatogenese vor Beginn der Meiose stoppen, aber die Cent-Elongation bei diesen Mutanten nicht blockieren. Cent-Öle der reifen Spermatozyten wachsen auf etwa 2,4 Mikrometer im Vergleich zu Cent-Ölen von Kontrollzellen, die eine maximale Länge von 1,8 Mikrometern erreichen. Einmal gemastert, kann Track A in 20 Minuten, Track B in 30 Minuten und Track C in drei bis fünf Stunden absolviert werden, je nach Stichprobengröße. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Zentrosom im Flug abbildet.

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Verfahren zur Isolierung und Herstellung von Drosophila Hoden Proben (leben und fest) für die Bildgebung durch Phasenkontrast-und Fluoreszenzmikroskopie sind hierin beschrieben.

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

Immunfärbung ist eine effektive Technik zur Visualisierung spezifischer Zelltypen und Proteine innerhalb von Geweben. Durch die Verwendung von Ultraschall verringert das hier beschriebene Protokoll die Notwendigkeit, Drosophila melanogaster-Gewebe von Embryonen und Larven im Spätstadium vor der Immunfärbung zu präparieren. Wir bieten eine effiziente Methodik für die Immunfärbung von Formaldehyd-fixierten Whole-Mount-Larven.

Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe<em&gt; In-situ</em

Hier wird ein neuartiger quantitativer Fluoreszenzassay entwickelt, um Änderungen des Spiegels eines Proteins spezifisch an Zentrosomen zu messen, indem die Fluoreszenzintensität dieses Proteins auf die eines geeigneten internen Standards normalisiert wird.

Quantitative Immunfluoreszenz-Assay, um die Variation der Protein-Ebene an Zentrosomen Messen

Hier berichten wir über Protokolle zum Nachweis endogener und exogener Zentromer-Kinetochor-Proteine in menschlichen Zellen und quantifizieren diese Proteinspiegel an Zentromeren-Kinetochoren durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung durch Verwendung von Fixierung (Paraformaldehyd-, Aceton- oder Methanol-Fixierung).

Immunofluoreszenz-Analyse von endogener und exogener Zentromer-Proteine ​​kinetochore

Wir präsentieren Protokolle für die Entnahme, Aufbereitung und Bildgebung von reifen Drosophila-Eizellen. Diese Methoden ermöglichen die Visualisierung des Chromosomenverhaltens sowie des Spindelaufbaus und der Funktion während der Meiose.

Techniques for Imaging Prometaphase und Metaphase der Meiose I in fester<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

Diese Röhrchen-Squash-Technik soll rasch zytologischen Merkmale entwickeln Maus Spermatozyten unter Beibehaltung der zellulären Integrität zu beurteilen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von allen Stufen der Spermatogenese und neben anderen biochemischen und molekularen biologischen Ansätze zur Erforschung der Maus Meiose leicht umgesetzt werden kann.

Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Zellteilung im intakten Gewebe durch lebende und feste Zellmikroskopie mit Drosophila meiotischen Spermatozyten zu analysieren. Das Protokoll zeigt, wie ganze, intakte Hoden von Drosophila-Larven und frühen Pupas isoliert und wie man sie für die Mikroskopie verarbeitet und montiert.

Vorbereitung von Drosophila Larval und Pupal Hoden für die Analyse der Zellteilung in Leben, intaktes Gewebe

Wir präsentieren hier ein verbessertes Protokoll für die Ganzkörperpräparation und Immunfärbung von Drosophila-Hoden, das für die konfokale Mikroskopie geeignet ist und auch eine reproduzierbare und zuverlässige Markierung ermöglicht. Wir veranschaulichen dieses Protokoll durch 3D-Darstellung und Quantifizierung von Kolokalisierungsexperimenten an den großen S4-S5-Spermatozyten.

Immunfärbung von Drosophila-Hoden für die konfokale 3D-Analyse großer Spermatozyten

Hier wird ein Protokoll für die hochauflösende Bildgebung von Lebendzellen in intaktem Gewebe vorgestellt. Wir haben die Bedingungen für die Abbildung einer hochempfindlichen adulten Stammzellpopulation in ihrer nativen Gewebeumgebung standardisiert. Diese Technik beinhaltet das Ausbalancieren der zeitlichen und räumlichen Auflösung, um die direkte Beobachtung biologischer Phänomene in lebendem Gewebe zu ermöglichen.

Hochauflösende Live-Cell-Bildgebung subzellulärer Strukturen

Dieser Artikel berichtet über eine in vivo Hemmung von CENP-E durch abdominale Chirurgie und Hodeninjektion von GSK923295, einem wertvollen Modell für die männliche meiotische Teilung. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz-, Durchflusszytometrie- und Transmissionselektronenmikroskopie-Assays zeigen wir, dass die CENP-E-Hemmung zu Chromosomenfehlstellungen und Genominstabilität in Mausspermatozyten führt.

Funktionelle Bewertung von Kinesin-7 CENP-E in Spermatozyten mittels In-vivo-Inhibition , Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie

Die Chromosomenbewegung während der meiotischen Prophase ist ein wenig verstandenes Phänomen, das für die Sporenbildung von grundlegender Bedeutung ist. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erfassung, Analyse und Quantifizierung von Zentromerbewegungen während der meiotischen Prophase in männlichen Meiozyten von Arabidopsis thaliana .

Live-Imaging-Charakterisierung von Zentromerbewegungen während der männlichen meiotischen Prophase in Arabidopsis thaliana

Erfahren Sie bildgebende Verfahren für Zentrosomenproteine während der Drosophila-Spermatogenese. Diese Methode nutzt Fluoreszenzmikroskopie, um die Dynamik zentrosomaler Proteine zu untersuchen und neue Gene zu identifizieren.

Imaging Zentrosomen in Fly Hoden

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