Gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Insektenembryonen in probenkammerbasierten Lichtbogenfluoreszenzmikroskopen

Probenkammerbasierte Lichtblatt-Floreszenzmikroskope sind eher für einen hohen Gehalt als für einen hohen Durchsatz ausgelegt. Live-Imaging-Assays müssen daher sequentiell durchgeführt werden und werden daher weniger von der Umgebungsvarianz beeinflusst. Unsere Spinnwebenhalter ermöglichen das Stapeln und gleichzeitige Imaging mehrerer Embryonen, wodurch Umgebungsschwankungen eliminiert und der Durchsatz erhöht werden.

Das Einsetzen von Embryonen in den Spinnwebenhalter erfordert eine gewisse Fingerspitzengefühl. Ein Erklärvideo eignet sich ideal, um die Abfolge der vielen kurzen Verhaltensgesten zu veranschaulichen. Zur Kalibrierung des Probenkammer-basierten Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskops.

Zuerst wird ein Agarose-Aliquot in einem Trockenblockheizmischer bei 80 Grad Celsius verflüssigt. Lassen Sie die geschmolzene Agarose auf 35 Grad Celsius abkühlen und geben Sie 50 Mikroliter der Agarose in ein 1,5 Milliliter Reaktionsgefäß. Mischen Sie eine Minute lang 0,5 Mikroliter fluoreszierende Mikrosphärenlösung mit der Agarose bei 1.400 Umdrehungen pro Minute und füllen Sie das Langloch des Spinnwebenhalters mit 10 Mikrolitern der Agarose-Fluoreszenz-Mikrosphärenlösungsmischung.

Aspirieren Sie so viel Agarose wie möglich, bis nur noch ein dünner Agarosefilm übrig bleibt, und lassen Sie die Agarose 30 bis 60 Sekunden lang erstarren. Füllen Sie die Probenkammer mit autoklaviertem Leitungswasser und führen Sie den Spinnwebenhalter langsam in die Probenkammer ein. Verschieben Sie das Langloch vor die Detektionslinse und drehen Sie die Halterung in eine 45-Grad-Position relativ zur Beleuchtungs- und Detektionsachse.

Der Spinnwebenhalter sollte im Sendelichtkanal nicht sichtbar sein. Schalten Sie auf den entsprechenden Fluoreszenzkanal um und stellen Sie die Laserleistung und Belichtungszeit so ein, dass die fluoreszierenden Mikrosphären ein korrektes Signal liefern. Geben Sie ein Sichtvolumen an, das den nun quer ausgerichteten Agarosefilm vollständig abdeckt und berechnen Sie die maximal mögliche axiale Auflösung für die jeweilige Beleuchtungs- und Detektionslinsenkombination, um den Z-Abstand zu definieren.

Nehmen Sie dann einen dreidimensionalen Z-Stapel der fluoreszierenden Mikrosphären auf und vergleichen Sie die maximalen Projektionen von X, Y und Z mit der Kalibrierungstabelle. Wenn die Mikrosphären verschwommen, verschwommen und/oder verzerrt erscheinen. Passen Sie die Positionen der Beleuchtungs- und/oder Detektionslinsen an.

Für die Dechorionation des Embryos geben Sie acht Milliliter autoklaviertes Leitungswasser in die Vertiefungen A1, A2, A3 und B3 mit einer bis sechs Vertiefungen pro Linie. Geben Sie dann sieben Milliliter autoklaviertes Leitungswasser und einen Milliliter Natriumhypochloritlösung in die Vertiefungen B1 und B2. Positionieren Sie die erste Platte unter einem Stereomikroskop und führen Sie den ersten Embryo mit dem Zellsieb in die Vertiefung A1 ein.

Waschen Sie die Embryonen 30 bis 60 Sekunden lang unter sanftem Rühren, bevor Sie das Sieb in die Vertiefung B1 stellen. Schütteln Sie die Platte 30 Sekunden lang kräftig, bevor Sie das Sieb in die Vertiefung A2 geben. Waschen Sie die Embryonen eine Minute lang unter sanftem Rühren und schieben Sie das Sieb in die Vertiefung B2, um es kräftig zu schütteln, bis die meisten Embryonen vollständig dechorioniert sind.

Übertragen Sie dann das Sieb für eine Minute in die Vertiefung A3 und waschen Sie es sanft, bevor Sie das Sieb mit dechorionierten Embryonen in der Vertiefung B3 aufbewahren, bis die Embryonen anderer Linien wie gezeigt behandelt wurden. Um die Embryonen auf den Spinnwebenhalter zu montieren, verflüssigen Sie ein weiteres Aliquot von Agarose, wie gezeigt. Wenn die Agarose abgekühlt ist, legen Sie den Spinnwebenhalter unter das Stereomikroskop und geben Sie 10 Mikroliter der Agarose auf das Langloch

Verteilen Sie die Agarose mit der Pipettenspitze über das Langloch, bevor Sie so viel Agarose wie möglich absaugen, bis nur noch ein dünner Agarosefilm übrig bleibt. Wenn die Agarose fest geworden ist, verwenden Sie einen Pinsel, um die Embryonen vorsichtig aufzunehmen und auf den Agarosefilm zu übertragen. Ordnen Sie sie entlang der Längsachse des Langlochs an, wobei ihre vorder-hinteren Achsen an der Längsachse des Langlochs ausgerichtet sind.

Um die Embryonen zu stabilisieren, pipettieren Sie vorsichtig ein bis zwei Mikroliter Agarose in den Spalt zwischen den Embryonen und dem Agarosefilm. Wenn die Agarose erstarrt ist, führen Sie den Spinnwebenhalter mit den eingehängten Embryonen langsam in die mit Bildpuffer gefüllte Probenkammer ein. Um die Embryonen abzubilden, vergewissern Sie sich, dass sich der Spinnwebenhalter in einer 45-Grad-Position relativ zur Beleuchtungs- und Detektionsachse befindet, und bewegen Sie den Embryo im Transmissionslichtkanal in die Mitte des Sichtfelds.

Der Spinnwebenhalter sollte nicht sichtbar sein. Bewegen Sie dann den Embryo mit der Mikrotranslationsstufe in Z, bis sich die mittlere Ebene des Embryos mit der Fokusebene überschneidet und die Umrisse scharf erscheinen. Bewegen Sie den Embryo um 250 Mikrometer in beide Richtungen, ohne auf den Fluoreszenzkanal umzuschalten, um das Sichtvolumen festzulegen.

Wenn eine Bildgebung in mehrere Richtungen erforderlich ist, drehen Sie den Embryo entsprechend, bringen Sie den Embryo in den Fokus und geben Sie das soeben gezeigte Sichtvolumen an. Wiederholen Sie dann diesen Vorgang für alle anderen montierten Embryonen. Wenn das Sichtvolumen für alle Embryonen festgelegt wurde, definieren Sie den Fluoreszenzkanal und die Zeitrafferparameter und starten Sie den Bildgebungsprozess.

Bei Assays, die mehrere Tage dauern, sollten Sie in Betracht ziehen, die Probenkammeröffnung zumindest teilweise abzudecken, um die Verdunstung zu reduzieren. Wenn der bildgebende Test beendet ist, entfernen Sie vorsichtig den Spinnwebenhalter aus der Probenkammer und lösen Sie die Embryonen mit einem kleinen Pinsel vom Agarosefilm und legen Sie die Embryonen auf einen entsprechend beschrifteten Objektträger. Legen Sie den Objektträger zur Inkubation unter den entsprechenden Standardaufzuchtbedingungen in eine Rückholschale.

Wenn der Zeitpunkt des Schlüpfens näher rückt, überprüfen Sie die Entnahmeschalen häufig und bringen Sie alle geschlüpften Larven in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Füllen Sie die Vertiefungen zur Hälfte mit dem entsprechenden Nährmedium und brüten Sie die Larven unter den entsprechenden Standardaufzuchtbedingungen aus. Wenn die beobachteten Individuen das Erwachsenenalter erreichen, stellen Sie geeignete Paarungspartner zur Verfügung und suchen Sie nach einigen Tagen nach Nachkommen.

In diesem Video ist die Fluoreszenzsignaldynamik von drei Embryonen zu beobachten, die von verschiedenen transgenen Drosophila-Linien über einen Zeitraum von etwa einem Tag abstammen. Ein ähnliches Fluoreszenzmuster wurde erwartet, da alle Linien nukleär lokalisiertes EGFP unter der Kontrolle von vermutlich ubiquitären und konstituierend aktiven Promotoren exprimierten. Vergleichende Live-Bildgebungsergebnisse zeigten jedoch starke räumlich-zeitliche Unterschiede in den Expressionsmustern, die aufgrund der Umgebungsvarianz keine sekundären Effekte waren.

In dieser Analyse wurden drei Tribolium-Embryonen untersucht, die das gleiche Huckepack-basierte Transgen tragen. Vergleichende Live-Bildgebungsergebnisse des Serosa-Fensterschließprozesses während der Gastrulation deuten darauf hin, dass die zweite Unterlinie ein bemerkenswert stärkeres Gesamtsignal liefert als die beiden anderen Unterlinien. Wie diese Daten zeigen, kann auch der genomische Kontext einen starken Einfluss auf das Expressionsniveau von Transgenen in Tribolium haben.

Unser Ansatz eignet sich gut für die Analyse von Knockdown- und Knockout-Phänotypen, da er die gleichzeitige Abbildung von Wildtyp-Kontrollembryonen ermöglicht. Unser Protokoll kann auch verwendet werden, um die Morphogenese von zwei oder mehr Insektenarten zu vergleichen. Und gewinnen Sie so tiefere Einblicke in die Evolution der Entwicklung.