בידוד של CD146 ⁺ תאי סטרומה mesenchymal ריאות התושב מריאות העכברוש

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפיין במבחנה תאי סטרומה מזנכימליים חיוביים ל-CD146 או MSCs המבודדים מריאת החולדה באמצעות שילוב של עיכול אנזימטי, הפרדת שיפוע צפיפות, היצמדות פלסטית ומיון חרוזים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלות הריאות לגבי האופן שבו MSCs ריאות נדבקים במחלה וכיצד הם תורמים לאפנון חיסוני ולתיקון רקמות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מהירה, ניתנת לשחזור וניתנת ליישום בקלות על מינים שונים של חיות ניסוי או רקמות.

מי שידגים את השלבים הראשונים של ההליך יהיה ארול ואדיבל, עמית מחקר מהמעבדה שלי. כדי להסיר את הריאה מבית החזה, החזיקו את קנה הנשימה בעזרת מלקחיים קטנים והשתמשו במספריים כירורגיים כדי להפריד את קנה הנשימה בצד הרוסטרלי. לאחר מכן, תוך כדי משיכה עדינה של חבילת הריאות מבית החזה, חתכו כל רקמת חיבור בצד הגבי לאורך כלוב הצלעות.

חתכו לאורך הסרעפת כדי לנתק את הריאות מאבי העורקים והוושט, והשתמשו בגזה כדי להסיר בעדינות את כל הדם שנותר מרקמת הריאה. בעזרת מספריים הסירו את קנה הנשימה והסמפונות והניחו בזהירות את אונות הריאה בצינור של 50 מיליליטר המכיל 35 מיליליטר של נוגד קרישה CPDA קר ו-PBS כדי להסיר את הדם והפסולת. לאחר חמש דקות, העבירו את הריאות לצינור חדש של 50 מיליליטר המכיל 35 מיליליטר PBS סטרילי בטמפרטורת החדר.

והפוך בעדינות כדי להסיר את הציטראט. לאחר חמש דקות יש לשטוף את הריאות בשפופרת חדשה של 50 מיליליטר המכילה 35 מיליליטר של PBS סטרילי בטמפרטורת החדר של דולבקו בתוספת נתרן פירובט וגלוקוז ולהפוך בעדינות. לאחר מכן העבירו את הריאות לצינור נוסף של 50 מיליליטר והשתמשו באזמל כדי לטחון דק את הרקמה כנגד דופן הצינור.

חשוב מאוד לחתוך את הרקמה לחתיכות קטנות מאוד כדי להבטיח תפוקת תאים מקסימלית. ולעבוד במהירות כדי להבטיח כדאיות תאים חזקה. לאחר שכל הרקמה נטחנה, הוסיפו אנזים טרי שהוכן לצינור וסגרו היטב את המכסה.

לאחר מכן דגרו את חתיכות הרקמה בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס בתסיסה עדינה לתקופת העיכול המתאימה. בתום הדגירה יש להפסיק את העיכול עם 200 מיקרוליטר של EDTA מסונן סטרילי. הוסף 20 מיליליטר PBS בתוספת FBS לתמיסת הרקמות והעביר את כל התרחיף דרך מסננת תאים של 100 מיקרון לתוך צינור חדש של 50 מיליליטר.

לאחר מכן שטפו את צינור העיכול ואת מסננת התאים עם 10 מיליליטר FBS/PBS ומשכו את הכביסה עם דגימה מסוננת. לאחר סיבוב התאים פעמיים, השעו מחדש את הגלולה השנייה בארבעה מילימטרים של טמפרטורת החדר FBS/PBS. ולאט לאט שכבו את התאים על פני שלושה מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות בזווית גדולה מ-45 מעלות.

על ידי טפיחה בזווית גדולה מ-45 מעלות בין תרחיף התא למדיום שיפוע הצפיפות מונעת מכוחות עצומים לערבב את התאים עם מדיום השיפוע המאפשר ליצור את השכבות, אם יתרחש ערבוב לא יהיה שיפוע צפיפות. הפרד את התאים באמצעות צנטריפוגה ואסוף את האינטרפאזה. לאחר מכן שטפו את ה-MSCs של הריאות ב-10 מיליליטר של PBS סטרילי והשעו את הגלולה במדיום תרבית MSC ריאה שלם שחומם מראש לציפוי.

כדי לבודד את אוכלוסיית התאים החיוביים CD146 יש לצפות תחילה חרוזים מגנטיים ב-10 מיקרוגרם של נוגדן משני ביוטיניל לכל 100 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים, בבקבוקון קריו תחתון עגול סטרילי של שני מיליליטר בתנאים סטריליים. דגרו את החרוזים והנוגדן על מערבל דגימות מסתובב למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר וב-30 סל"ד. לאחר מכן השעו מחדש את החרוזים המצומדים בנוגדנים ב-1.5 מיליליטר של PBS בתוספת BSA והעבירו את החרוזים לצינור ציטומטריה עגול של שלושה מיליליטר בזרימה תחתונה.

שטפו את בקבוקון הקריו עם 1.5 מיליליטר נוספים של BSA/PBS ומשכו את הכביסה פנימה עם החרוזים. הנח את הצינור על מגנט מתאים למשך שתי דקות עד שכל החרוזים מחוברים לדופן האחורית של הצינור והתמיסה תתבהר. לאחר מכן הסר את הסופרנטנט ושטוף את החרוזים פעמיים נוספות עם שלושה מיליליטר BSA/PBS.

שטפו את MSCs שלוש פעמים עם PBS ללא תוסף. לאחר השטיפה האחרונה יש לטפל בתאים בתמיסה עדינה שאינה טריפסין למשך 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. כאשר כל התאים מתנתקים, מוסיפים מדיום תרבית MSC ריאה טרי ומסובבים את התאים.

השעו מחדש את הגלולה ב-PBS בתוספת BSA וספרו את התאים. לאחר מכן העבירו את התאים לצינור של שלושה מיליליטר המכיל נוגדן ראשוני CD146, כסו את הצינור ודגרו את התאים על מערבל דגימות מסתובב ב-15 סל"ד וארבע מעלות צלזיוס. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים פעמיים בשלושה מיליליטר PBS בתוספת BSA ולהשעות את הגלולה השנייה בשלושה מילימטרים של החרוזים המצומדים של הנוגדנים המשניים.

לאחר 30 דקות על מערבל הדגימה המסתובב בארבע מעלות צלזיוס, הנח את הצינור על המגנט והשתמש בפיפטה פסטר סטרילית כדי להסיר לאט ובזהירות את התאים השליליים. לאחר מכן, כשהצינור הוסר מהמגנט, השהה מחדש את התאים בשלושה מיליליטר של BSA בתוספת PBS וחזור על תהליך הבחירה ארבע פעמים נוספות. לאחר הסרת התאים השליליים האחרונה, שטפו את ה-MSCs החיוביים לריאות CD146 במדיום תרבית שחומם מראש.

לבסוף, השעו מחדש את התאים המצומדים בחרוזים במדיום תרבית תאי סטרומה מזנכימליים טריים בריאות והניחו 5,000 תאים לסנטימטר רבוע בבקבוק תרבית בגודל מתאים. היצמדות לפלסטיק ואחריה שלושה עד חמישה ימים של תרבית מעשירה את אוכלוסיית הבין-פאזה של הפרדת שיפועי הצפיפות עבור CD90. CD73. ו-CD 146 MSCs חיוביים לריאות.

יתר על כן, תאים אלה מסוגלים ליעילות יחידה יוצרת מושבה של כ-30% גבוהה בהרבה מזו המדווחת בדרך כלל עבור מח עצם או תת-קבוצות MSC אחרות המתבדלות לאורך שלוש שושלות MSC הקלאסיות. ברירה חיובית בתת-אוכלוסייה חיובית CD146 מביאה לכאורה לאוכלוסיית תאים מועשרת מאוד ב-MSCs ריאתיים, כפי שמודגם על ידי אחוז גבוה יותר של תאים המבטאים סמן פני השטח הקשורים ל-MSC. תאים אלה גם מפגינים פוטנציאל גבוה משמעותית ליצירת מושבה ותגובת התמיינות חזקה יותר, במיוחד בתאי השושלת הכונדרוגנית בהשוואה לאוכלוסיית התאים המזנכימליים הכוללת שהתקבלה לפני בחירת CD146.

יש לציין כי MSCs ריאתיים אלה יוצרים מעט מאוד אדיפוציטים אמיתיים המציגים הרבה יותר תאים בצורת ציר מלאים בשלפוחיות שומן קטנות שאולי משקפות את שושלת הליפופיברובלסטים החיונית הן להתפתחות הריאות והן לתמיכה בתאים המכתשית מסוג 2. לאחר שליטה בטכניקה זו יכולה להניב MSCs חיוביים לריאות CD146 תוך שישה עד 10 ימים, אם כי התשואה תהיה תלויה בגיל ובמין החיה. בזמן ניסיון הליך זה חשוב לעבוד מהר כדי לשמר את כדאיות התאים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו תגובת לימפוציטים מעורבת או SAs לריפוי פצעים כדי לענות על שאלות נוספות לגבי היעילות של MSCs בעיכוב התפשטות תאי T ותמיכה בריפוי פצעים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד MSCs ריאות חיוביים CD146 באמצעות עיכול אנזימטי, הפרדת שיפוע צפיפות, היצמדות לפלסטיק ומיון חרוזים.