בידוד & אפיון Hoechst ^נמוך CD45 ^שלילי עכבר mesenchymal ריאות בתאי גזע

סרטון זה מדגים פרוטוקול לבידוד תאי גזע מזנכימליים של הריאה מהמארח, בעלי ביטוי נמוך של CD 45 ושליליים ל-CD 45. תאי גזע מזנכימליים של רקמות, או MSCs, הם רגולטורים חשובים של תיקון או התחדשות רקמות, פיברוזיס, דלקת ואנגיוגנזה. ראשית, הריאות מופרשות מעכבר שהוקרב.

רקמת הריאה מעובדת בעיכול כדי להשיג סספנסיות של תאים בודדים. התאים נצבעים בצבע hoax וב-CD 45 ומופרדים באמצעות ציטומטריה של זרימה כדי להשיג תאי MSC מהריאה של המארח שהם CD 45 שליליים. תאי ה-MSC מהריאה מורחבים לאחר מכן בתרבית, ונערך מבחן ליצירת מושבות להערכת יכולות ההבדלה של ה-MSC.

לאחר מכן ניתן לבצע מחקרים נוספים כדי לבחון את תפקידן של תאי MSC במהלך הומיאוסטזיס של רקמות ובמחלה. את השיטה המוצגת כאן ניתן להשתמש בה כדי לבודד תאי גזע מזנכימליים של ריאה מעכבר או מבן אדם, וניתן להחילה על מחקר של מחלות ריאה כגון פיברוזיס ריאתי, יתר לחץ דם ריאתי ו-COPD. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עשויים להיתקל בקשיים בשל מגוון השיטות הזמינות להכנת רקמות, כמו גם הגדרת ציטומטר הזרימה, הבקרות המתאימות והניתוח.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן קשה לתאר במילים בלבד את הטכניקה הנכונה לקיצוץ ועיכול של רקמת הריאה לצורך השגת חיוניות תאים אופטימלית. כמו כן, הגדרות מכשיר ה-flow cytometry והניתוחים המבוצעים בו מועברים בצורה הטובה ביותר באמצעות הדגמה. התחילו את הפרוטוקול על ידי הוצאת הריאות שישמשו להשגת תאי גזע מזנכימליים מעכבר בוגר שהוקריב.

השתמשו במספריים חדים וקטנים כדי לחתוך את כלוב הצלעות לצדדים, משני צידי העכבר. פתחו את חלל בית החזה, ולאחר מכן הסירו את הסרעפת. הכניסו מזרק של 10 milliliter עם מחט במידה 20.5 gauge לתוך החדר הימני של הלב ולחצו בעדינות על הבוכנה כדי לבצע פרפוזיה של 3-5 milliliter של PBS, לצורך שטיפת הדם מהריאות.

בשלב הבא, בעזרת מספריים, גזרו את הקנה ואת הסינכיס הגדול והשליכו אותם. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, אספו את אונוני הריאה הלבנים הקטנים והניחו אותם בצלחת פטרי המלאה ב-hank's buffered saline או HBSS.

לאחר מכן הוצא את הלב והפרד את אונואי הריאה. חזור על תהליך זה עבור כל העכברים במחקר. העבר את אונואי הריאה אל מכסה הצלחת.

הרטב את הרקמה בכמות מספקת של HBSS כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן, בעזרת סכין מנתחים חד-פעמית, קצץ את נאחי הריאה כדי להשיג מחולש עצם שישמש כביקורת התמיכה עבור ציטומטריה זרימה. השתמש במספריים חדים כדי לחתוך באזור הקרסול ובחלק העליון של הירך.

הניחו את הגפה בתוך צלחת פטרי חדשה. לאחר מכן, חתכו את הברך, כך שיישאר קטע ליניארי של ה-femur וקטע שני המכיל את ה-tibia וה-fibula. באמצעות פינצטה, הסירו את השריר כדי לחשוף את ה-tibia, ה-fibula וה-femur.

כעת קחו מזרק של 5 ml עם מחט במידה 26.5 והחדירו את המחט לפתח של מח העצם. החזיקו את עצם הטיביה (shins) כך שאחד מקצותיה יהיה במחט והקצה השני יופנה אל תוך מבחנה קונית של 50 ml המכילה 15 ml של HBSS, ולחצו על הבוכנה כדי להזרים את ה-HBSS ולשטוף את מח העצם אל תוך המבחנה. חזרו על תהליך זה עם הפיבולה (perone) והפמור (femur).

צבע את מחית השגג ב-host 3 3 3 4 2 die בריכוז סופי של 5 µg/mL ב-DMEM גלוקוז גבוה מועשר. לאחר מכן, תהומן תרחיף של תאים בודדים מרקמת הריאה מהרקמה שהבודדה. הנח כל ריאה במבחנה המכילה 0.2% Worthington שחומם מראש.

הכינו קולגנאז מסוג 2 ב-HBSS סטרילי, ולאחר מכן טבלו את המבחנה באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C והדגרימו למשך 30 דקות. לאחר ההדגמה, השתמשו בפיפט של 10 ml כדי לבצע טריטורציה לדגימה עד שהעיכול יזרום בקלות דרך הפיפט. בצעו זאת כ-10 פעמים, והדגרימו למשך 15 דקות נוספות בטמפרטורה של 37 °C כדי להשלים את עיכול הרקמה.

עם השלמת העיכול, דללו את תרחיף התאים ב-HBSS והשתמשו בפיפט של 5 ml כדי לנסות שוב לפזר שאריות של פיסות רקמה. לאחר מכן, כדי להסיר פיסות רקמה שלא עוכלו, שפכו את התרחיף דרך מסנן תאים של 70 µm לתוך מבחנה קונית של 50 ml. הוסיפו את התרחיף בהדרגה כדי לאפשר לדגימה לזרום דרך מסנן התאים.

אם שברי רקמה שלא התעכלו חוסמים לחלוטין את זרימת תרחיף התאים, יש לסנן את התרחיף דרך מסנן תאים חדש אל תוך מבחנה חדשה. יש להשקיע את תרחיף התאים למשך 10 דקות ב-450 RCF.

לאחר הצנטריפוגה, שפכו את הנוזל העליון והשעיקו בעדינות את משקע התאים בבופר להמסת תאי דם אדומים בטמפרטורת החדר, והדרימו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו נפח שווה של HBSS כדי לנטרל את בופר ההמסה.

שפכו את ת сусפנזיית התאים דרך מסנן תאים של 40 micromolar כדי להסיר פסולת וצברי תאים, ואספו את הנוזל שעבר למבחנה קונוית חדשה של 50 milliliter. לאחר מכן, בעזרת hemo cytometer, קבעו את מספר התאים הן עבור דגימות הריאה והן עבור דגימות מח העצם. רשמו את הריכוז ואת הנפח הכולל של ס сусפנזיית התאים.

לאחר מכן, השקיעו את תרחיף תאי הריאה הבודדים באמצעות סנטריפוגציה ב-450 RCF למשך 10 דקות. כדי לשמר את התאים, השעיקו מחדש הן את תאי הריאה והן את תאי מחלק הריאה בו-זמנית, בריכוז של 10⁶ תאים למילליטר, ב-DMEM עשיר בגלוקוז עם תוספות שחומם מראש.

כדי לצבוע את ה-DNA, יש להוסיף צבע HOAXED 3 3 3 4 2 לריכוז סופי של 5 µg/L. לאחר מכן, ערבבו את התאים באמצעות היפוך עדין והדגירו במקלחת במים בטמפרטורה של 37 °C למשך 90 דקות בדיוק. לאחר מכן, צנטריפוגו למשך 10 דקות ב-450 ×g בטמפרטורה של 4 °C לאחר הסיבוב.

המשיכו לצביעה של רקמת הריאה ומח העצם באמצעות anti CD 45 ופרופידיום יודיד (propidium iodide), כהכנה לניתוח באמצעות ציטומטריה זורמת. לאחר צביעת התאים, אחסנו את המבחנות על קרח ובמקום מוגן מאור עד לביצוע ניתוח הציטומטריה הזורמת. הכינו את המכשיר לציטומטריה זורמת על ידי וידוא כי לייזרי המכשיר מכוונים וכי הוא מוגדר למיון תאים.

המכשיר המשמש למדידה חייב להיות מצויד בלייזרים כחולים ב-488 nanometer, אדומים ב-635 nanometer ו-UV ב-350 עד 355 nanometer, עם שני גלאים במסלול לייזר ה-UV, המצוידים במסננים כחולים 45 over 65 ואדומים 6 75 over 50. בנוסף, הגלא האדום של ה-UV חייב להיות בעל רגישות גבוהה לאות האדום, והמכשיר חייב להיות מצויד ביחידת קירור לשמירה על הדגימה בטמפרטורה של 10 degrees Celsius. בהגדרות התוכנה של המכשיר, הגדירו תצוגת היסטוגרמות להצגת scatter forward ליניארי מול side scatter, וגרף להבחנה בין doublet (doublet discrimination plot) המתאים למכשיר.

תרשים היסטוגרמה של PI באמצעות אות לוגריתמי, גרף פיזור (coast) אדום מול כחול באמצעות אותים ליניאריים, ותרשים היסטוגרמה של CD 45 A PC באמצעות אות לוגריתמי. ברגע שהמכשיר מוכן, הכניסו את דגימת מחול השגרה הצבועה לפתח הטעינה של המכשיר. דגימה זו משמשת כביקורת לצביעה ולהגדרת המכשיר.

התחילו באיסוף אירועים וכווןנו את אותות הפיזור קדימה (forward scatter) ואותות הפיזור הפנימי (side scatter) הליניאריים. כדי להמחיש בבירור את אוכלוסיית התאים, התאים צריכים להופיע בקירוב במרכז התחתון של תרשים הפיזור קדימה כציר ה-x. מאחר שצבע הגרעין PI חודר ממברנות, הוא לא ייכנס לתאים חיים.

סמנו אזור בחירה (gate) על התאים המתים החיוביים ל-PI בהיסטוגרמת ה-PI. הגדירו בתוכנת המכשיר לצבוע תאים מתים באזור בחירה זה באדום.

מועיל להשתמש בתאים מתים שצבועים בצבע כדי לנווט ולזהות את אוכלוסיית ה-G0 G1 של התאים המארחים. צבע ה-PI עומד גם הוא לעירור על ידי לייזר UV, ומרבית התאים המתים אמורים להיות מחוץ לטווח המדידה. בצד ימין של תרשים הפלואורסצנציה של אדום מול כחול, אוכלוסיית ה-G0 G1 של מחלצת העצם צריכה להופיע כצבר דחוס של אירועים.

כווננו את מתחי הגלאים כך שצביר ה-G zero G one ימוקם בחלק העליון מימין למרכז הגרף. חלק משלב ה-S וכל שלב ה-G two של מחזור השכפול עשויים להיות מחוץ לטווח הסקאלה. בחלק הימני העליון של גרף ה-hoaxed האדום מול הכחול, אוכלוסיית ה-side population תיראה כזנב הנמתח מהצד השמאלי של צביר ה-G zero G one כלפי מטה לפינה השמאלית התחתונה של הגרף.

כעת שרטטו שער (gate) סביב צביר התאים בגרף FSC מול SSC. שרטטו את אוכלוסיית הסינגלטים שזוהתה בגרף הדאבלטים ואת התאים החיים בהיסטוגרמת ה-PI. לאחר מכן, הגדירו את גרף ה-hoax להצגת אוכלוסיות מסומנות אלו בלבד.

לאחר ביצוע gating לגרף המארח, שרטטו אזור סביב אוכלוסיית הצד (side population). הגדירו אזור זה כ-gate עבור ההיסטוגרמה של CD 45 A PC, יחד עם ה-gates של תאי יחיד (singlet) לפי פיזור אור ותאים חיים.

לא יהיה צורך להתאים מחדש את הגדרות המכשיר עבור דגימה זו. התחילו לאסוף אירועים בגרף ה-hoax של אדום מול כחול. אשכול ה-G zero G one עבור דגימת הריאה מופיע בדרך כלל מוארך יותר בכיוון ציר ה-x ומזכיר את סימן ה-tilda במקלדת.

את שער השלילה (gating) של אוכלוסיית הצד (side population) יש להגדיר במיקום דומה לזה שהוגדר עבור דגימת מחלק השריג (bone marrow). ייתכן שיהיה צורך בביצוע התאמות קלות כלפי מעלה או מטה כדי להבטיח רזולוציה הדוקה של אוכלוסיית הצד. שמרו על הפרש לחצים נמוך במהלך המיון על ידי וידוא ששסתום זרימת הדגימה אינו פתוח יותר מדי.

כדי לבודד MSC, מקמו פלטת איסוף בעלת 96 בארות בתא המיון והגדירו את שערי המיון (sort gates) בהיסטוגרמה של CD 45 A PC כדי להפריד בין האוכלוסייה החיובית לשלילית. לבסוף, אספו את התאים כאוכלוסייה מעורבת לתוך מבחנה, או כתאים בודדים לבידוד שיבוטים לפלטה בעלת 96 בארות. לאחר איסוף ה-MSC מהריאה באמצעות מיון תאים, זרעו את התאים בצלחות של 30 מילימטר באמצעות A MEM המועשר ב-20% FBS. בתחילה, התאים הממוינים נראים קטנים, עגולים ובהירים לאחר כשבועיים עד שלושה שבועות.

מושבות בעלות פנוטיפ מזנכימלי הופכות ניכרות והשכפול בולט יותר עבור כל הכנת תאים. העריכו את יכולתן של תאי גזע מזנכימליים (MSC) מהריאה להבדיל למערכי השוכה המזנכימליים המסורתיים של אוסטאובלסטים, אדיפוציטים וכונדרוציטים, ואת הביטוי של מרקרי מזנכימליים מקובלים על פני השטח של התאים. בצעו אנליזת פסיי חרומוזומלית (cytogenetic banding) כדי לאשר את היעדרן של הפרעות כרומוזומליות גסות.

לאחר בידוד באמצעות פלוו ציטומטריה (flow cytometry) ויצירת שיבוטים של תאים בודדים, מבוצע בדיקת יצירת מושבות (colony forming assay) על מנת לאפיין את תאי ה-MSC ואת יכולות ההבדלה שלהם. התחל עם תאים שדללו לריכוז של 3 × 10⁴ תאים למילילטר. במצע גידול Cul חסר בצלחות של 100 מילימטר, בצע דילו.[סדרתי] של 2 × 10⁴, 3 × 10⁴, 1.5 × 10⁴ ו-0.75 × 10⁴ תאים לצלחת, ב-10 מיליליטר של מצע, בשלוש חזרות.

לאחר 10 ימי תרבית, הניחו את הצלחות באינקובטור, שפכו את המצע ושטפו את התאים ב-PBS. לאחר מכן, קבעו אותם על ידי הוספת 100% methanol למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות, שפכו את ה-methanol.

כדי לזהות היווצרות מושבות, הוסיפו 0.4% weight by volume gza המדולל ביחס של 1 ל-20 במים מיונזים והדגרימו למשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, שפכו את הצבע ושטפו במים מיונזים. הניחו לדגימות להתייבש באוויר וכמתי את מספר המושבות המכילות יותר מ-25 תאים למושבה באמצעות מיקרוסקופ הפוך או ויזואליזציה.

המושבות הן גדולות, מורכבות ממאות תאים בודדים כפי שמוצג כאן, ומגלות פנוטיפ מזנכימלי. MSCs בודדו כפי שמוצג בסרטון זה ונזרעו בלוחות 96 בארות לגידול מדמה. לאחר מכן, תאים מציגי אנטיגן המסומנים ב-CFSE במצב של מעצר הוספו ל-MSCs של הריאה.

לאחר מכן נמדדה השגשוג של MSCs מבודדים כהפחתה בעוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של CFSE בהשוואה לרקע, שהיה T cells המסומנים ב-CFSE בלבד כפי שמוצג באיור זה, בהיעדר SC של הריאה ובנוכחות תאים מציגי אנטיגן, A PC פלוס מינוס O albumin CD 40 חיוביים, T-cell אפקטורי המראה ירידה בעוצמת ה-CFSE, מה שמעיד על שגשוג המסומן בעיגול אדום. עוצמת הפלואורסצנציה של CFSE בממברנת ה-T-cell פוחתת באופן גיאומטרי עם כל חלוקה של התא, כלומר מחצית בכל חלוקה; בנוכחות של lung M-S-C-A-P-C פלוס מינוס OVA CD 40 חיוביים, T cells אפקטורים אינם מראים שינוי משמעותי בעוצמת ה-CFSE, מה שמעיד על חוסר שגשוג לאחר פיתוחם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של תאי גזע בריאה לבחון את תפקידם של תאי גזע מזנכימליים במחלות ריאה כגון יתר לחץ דם ריאתי ופיברוזיס ריאתי.

לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בערך בחמש שעות בהתאם לנוהל זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקות דיפרנציאציה, כדי לענות על שאלות נוספות, כולל השאלה האם תאי הגזע המזנכימליים המשוערים של הריאה מפגינים דיפרנציאציה רב-שורית מתאימה, ופוטנציאל להפוך לעצם, שומן וסחוס.