בידוד & אפיון Hoechst ^נמוך CD45 ^שלילי עכבר mesenchymal ריאות בתאי גזע

סרטון זה מדגים פרוטוקול לבידוד של תאי גזע מזנכימליים שליליים עם CD 45 שלילי. תאי גזע מזנכימליים מהדהדים רקמות או MSCs הם מווסתים חשובים של תיקון או התחדשות רקמות, פיברוזיס, דלקת ואנגיוגנזה. ראשית, הריאות מנותחות מעכבר שהוקרב.

רקמת הריאה מתעכלת לקבלת תרחיף תא בודד. התאים מוכתמים בתבנית מתיחה ו-CD 45 וממוינים לפי ציטומטריית זרימה כדי להשיג MSCs ריאות שליליים CD 45 נמוכים של המארח. לאחר מכן מרחיבים את MSCs של הריאות בתרבית ומבוצעת בדיקה ליצירת מושבה כדי להעריך את יכולות ההתמיינות של MSC.

לאחר מכן ניתן לבצע מחקרים נוספים כדי לבחון את תפקידם של MSCs במהלך הומאוסטזיס ומחלות רקמות. השיטה שאנו מראים כאן יכולה לשמש לבידוד תאי גזע מזנכימליים של עכבר או של ריאות אנושיות, וניתן ליישם אותה במחקר זה של מחלות ריאה כגון פיברוזיס ריאתי, יתר לחץ דם ריאתי ו-COPD. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל מגוון השיטות הזמינות להכנת רקמות, כמו גם הגדרת ציטומטר זרימה בקרות וניתוח מתאימים.

הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה לתאר את הטכניקה הנכונה לטחינה ועיכול רקמת הריאה לכדאיות אופטימלית של תאים באמצעות מילים בלבד. כמו כן, מכשיר ציטומטריית הזרימה שהוקם והניתוחים מועברים בצורה הטובה ביותר באמצעות הדגמה. התחל פרוטוקול זה על ידי הסרת הריאות שישמשו להשגת תאי גזע מזנכימליים מעכבר בוגר שהוקרב.

השתמש במספריים חדים קטנים כדי לחתוך את כלוב הצלעות לרוחב מכל צד של העכבר. פתח את חלל החזה ואז הסר את הסרעפת. הכנס מזרק של 10 מיליליטר עם מחט בגודל 20 וחצי לחדר הלב הימני ולחץ בעדינות על הבוכנה כדי להחדיר אותה בשלושה עד חמישה מיליליטר PBS, ולשטוף את הדם מהריאות.

לאחר מכן, בעזרת מספריים, חותכים את קנה הנשימה והסמפונות הגדולים וזורקים אותם. ואז באמצעות מלקחיים. הרם את אונות הריאה הלבנות הקטנות והניח אותן בצלחת פטרי מלאה במי מלח של האנק או HBSS.

לאחר מכן הסר את הלב והפרד את אונות הריאה. חזרו על התהליך הזה עבור כל העכברים במחקר. מעבירים את אונות הריאה למכסה המנה.

הרטיבו את הטישו בכמות מספקת של HBSS כדי למנוע מהם להתייבש. לאחר מכן בעזרת אזמל חד פעמי, טוחנים את אונות הריאה כדי להשיג מח עצם כדי להשתמש בבקרת השמירה על ציטומטריית זרימה. השתמש במספריים חדים כדי לחתוך בקרסול ובחלק העליון של עצם הירך.

מניחים את הגפה בצלחת פטרי חדשה. לאחר מכן חתכו את הברך, והשאירו חתיכה ליניארית של עצם הירך וחתיכה שנייה המכילה את השוקה והפיבולה. בעזרת מלקחיים, משוך את השריר כדי לחשוף את השוקה, הפיבולה ועצם הירך.

כעת קח מזרק של חמישה מיליליטר עם מחט בגודל 26 וחצי והכנס את המחט לפתח מח העצם. בקצה אחד של השוקה, החזק את העצם כשהקצה השני מכוון לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר מלא ב-15 מיליליטר HBSS ולחץ על הבוכנה כדי להוציא HBSS ולשטוף את מח העצם לתוך הצינור. חזור על תהליך זה עם פיבולה ועצם הירך.

לצבוע את מח העצם עם מארח 3 3 3 4 2 למות בריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם למיליליטר בתוספת DMEM עם גלוקוז גבוה. לאחר מכן, תיווצר השעיית תא בודד של רקמת הריאה מהרקמה המבודדת. יש להניח כל ריאה בשפופרת המכילה 0.2% וורת'ינגטון.

סוג שני קולגנאז מוכן ב-HBSS סטרילי, ואז טובלים את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ודוגרים למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, השתמש בפיפטה של 10 מיליליטר כדי לטרטר את הדגימה עד שהעיכול זורם בקלות דרך הפיפטה. כ-10 חזרות דוגרות למשך 15 דקות נוספות, 37 מעלות צלזיוס להשלמת עיכול הרקמות.

לאחר השלמת העיכול, יש לדלל את תרחיף התאים עם HBSS ולהשתמש בפיפטה של חמישה מיליליטר כדי לפזר שוב את כל שברי הרקמה שנותרו. לאחר מכן, כדי להסיר שברי רקמות לא מעוכלות, שפכו את התרחיף דרך מסננת תאים מיקרו-מולרית של 70 לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. הוסף תרחיף מעט בכל פעם כדי לאפשר לדגימה לזרום דרך מסננת התאים.

אם שברי רקמה לא מעוכלים חוסמים לחלוטין את זרימת תרחיף התאים. יוצקים דרך מסננת תאים חדשה לתוך צינור חדש. גלולה את תרחיף התא למשך 10 דקות ב-450 RCF.

לאחר הסיבוב יש להוציא את הסופרנטנט ולהשעות בעדינות את כדור התא בטמפרטורת החדר. מאגר ליזה של תאי דם אדומים, דגירה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסף נפח שווה של HBSS כדי להשבית את מאגר הליזיס.

יוצקים את תרחיף התאים למסננת תאים של 40 מיקרו-מולרית כדי להסיר פסולת ואגרגטים של תאים, ואוספים את הזרימה בצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר. לאחר מכן, באמצעות ציטומטר המו, קבע את מספרי התאים הן עבור דגימות הריאה והן עבור דגימות מח העצם. רשום את הריכוז והנפח הכולל של מתלה התאים.

לאחר מכן גלולה את תרחיף תאי הריאה הבודדים על ידי צנטריפוגה ב-450 RCF למשך 10 דקות. כדי לקיים את התאים יש להשעות מחדש את תאי הריאה ומח העצם בבת אחת. 10 עד שישה תאים למיליליטר בתוספת DMEM עם גלוקוז גבוה לפני חימום.

כדי לצבוע את ה-DNA יש להוסיף צבע HOAXED 3 3 3 4 2 לריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם לליטר. לאחר מכן, ערבבו את התאים בהיפוך עדין ודגרו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות בדיוק. לאחר מכן צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-450 גרם בארבע מעלות צלזיוס לאחר הסיבוב.

המשך בצביעה של רקמת הריאה ומח העצם עם אנטי CD 45 ופרופידיום יודיד כהכנה לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה. לאחר צביעת התאים, אחסן את הצינורות על קרח מוגן מפני אור עד לביצוע ניתוח ציטומטריית זרימה. התכוננו לזרימה ציטומטרית על ידי הקפדה על כך שהלייזרים של המכשירים מיושרים ושהם מוגדרים למיון תאים.

המכשיר המשמש חייב להיות מצויד בלייזרים כחולים 488 ננומטר אדום 635 ננומטר ו-UV 350 עד 355 ננומטר עם שני גלאים על נתיב לייזר UV עם כחול 45 מעל 65 ואדום 6 75 מעל 50 מסננים. בנוסף, גלאי ה-UV האדום חייב להיות בעל רגישות גבוהה לאות האדום והמכשיר חייב להיות מצויד ביחידת צ'ילר כדי לשמור על הדגימה ב-10 מעלות צלזיוס. בתוכנת המכשיר הגדירו עלילות היסטוגרמה להצגת פיזור ליניארי קדימה לעומת פיזור צדדי, תרשים אפליה כפולה המתאים למכשיר.

תרשים היסטוגרמה של PI באמצעות אות לוג, חוף אדום לעומת כחול באמצעות אותות ליניאריים ותרשים היסטוגרמה של CD 45 A PC באמצעות אות לוג. לאחר שהמכשיר מוכן, הנח את דגימת מח העצם המוכתמת ביציאת הטעינה של המכשיר. דגימה זו משמשת כבקרת צביעה והגדרת מכשירים.

התחל לאסוף אירועים והתאם את האותות הליניאריים הפנימיים קדימה. כדי לדמיין בבירור את אוכלוסיית התאים, התאים צריכים לשכון בערך במרכז התחתון של פיזור העלילה קדימה כציר ה-x. מכיוון שהכתם הגרעיני PI הוא חודר IMP ממברנה, הוא לא ייכלל בתאים חיים.

צייר אזור הליכה על התאים המתים החיוביים ל-PI בהיסטוגרמה של PI. הנחו את תוכנת המכשיר לצבוע את התאים המתים. בשער זה אדום.

זה מועיל להשתמש בתאים המתים המאווררים בצבע כנווט כדי לזהות את אוכלוסיית המארח G zero G one. כתם ה-PI נרגש גם על ידי לייזר UV ורוב התאים המתים צריכים להיות מחוץ לקנה מידה. בצד ימין של תרשים הקרינה האדום לעומת הכחול, יש לראות את אוכלוסיית G zero G 1 של מח העצם כמקבץ הדוק של אירועים בתרשים המתיחה האדום לעומת הכחול.

כוונן את נפח הגלאיtages כדי למקם את אשכול G zero G אחד בפינה השמאלית העליונה של המרכז על המגרש. חלק משלב ה-S וכל ה-G 2 של מחזור התא עשויים להיות מחוץ לקנה מידה. בפינה הימנית העליונה של התרשים האדום לעומת הכחול, המארחים הנמוכים של אוכלוסיית הצד ייראו נגררים מהצד השמאלי של אשכול G אפס G אחד למטה לפינה השמאלית התחתונה של העלילה.

כעת צייר שער סביב אשכול התאים ב- FSC לעומת SSC. שרטט את אוכלוסיית הסינגלט שזוהתה בתרשים הכפול ואת התאים החיים בהיסטוגרמה של PI. לאחר מכן הקצה את עלילת המתיחה כך שתציג רק את האוכלוסיות המגודרות הללו.

לאחר שער חלקת המארח, צייר אזור סביב האוכלוסייה הצדדית. הקצה אזור זה כשער להיסטוגרמה של CD 45 A PC יחד עם סינגל פיזור האור ושערי התא החי. כעת, לאחר הגדרת המערכת, הסר את הדגימה מיציאת הטעינה והנח את דגימת הריאה ביציאת הטעינה.

אין צורך להתאים שוב את הגדרות המכשיר עבור דגימה זו. התחל לאסוף אירועים בעלילת המתיחה האדומה לעומת הכחולה. האשכול G אפס G עבור דגימת הריאה נראה בדרך כלל מוארך יותר בכיוון ציר x ודומה לסמל הטילדה במקלדת.

מתיחת ההליכה של אוכלוסיית הצד נמוכה צריכה להיות במצב דומה לזה שנקבע עבור דגימת מח העצם. ייתכן שיהיה צורך בהתאמות קלות אלה למעלה או למטה כדי להבטיח רזולוציה הדוקה של אוכלוסיית הצד. שמור על הפרש לחץ נמוך במהלך המיון על ידי הקפדה על כך ששסתום זרימת הדגימה לא נפתח רחוק מדי.

לאחר מכן, MSC, הניחו לוחית איסוף של 96 בארות בתא המיון והקימו את שערי המיון בהיסטוגרמה של CD 45 A PC כדי להפריד בין אוכלוסייה חיובית לשלילית. לבסוף, אסוף את התאים כאוכלוסייה מעורבת לתוך צינור או תאים בודדים כדי לבודד שיבוטים לצלחת של 96 בארות לאחר איסוף MSC של הריאה על ידי מיון תאים, התאים מצופים בצלחות של 30 מילימטר באמצעות MEM בתוספת 20% FBS. ראשית, תאים ממוינים נראים קטנים, עגולים ובהירים לאחר כשבועיים-שלושה.

מושבות עם הפנוטיפ המזנכימלי ניכרות וההתפשטות ברורה יותר עבור כל הכנת תא. להעריך את היכולת של MSC ריאתי להתמיין לשושלות מזנכימליות מסורתיות של אוסטאובלסטים, אדיפוציטים וכונדרוציטים ואת ביטוי פני התא של סמנים מזנכימליים מקובלים. בצע ניתוח איסור ציטוגנטי כדי לאשר את היעדר הפרעות כרומוזומליות גסות.

לאחר בידוד על ידי זרימה ציטומטרית ויצירת שיבוטים של תאים בודדים, מבוצעת בדיקת יצירת מושבה לאפיון תאי MSC ויכולות ההתמיינות. התחל עם תאים מדוללים לשלוש פעמים 10 מתוך ארבעת התאים למיליליטר. מדיום לא שלם בכלים של 100 מילימטר, בצע דילול דגנים שתיים, שש כפול 10 מתוך הארבעה, שלוש פעמים 10 מתוך הארבעה, 1.5 כפול 10 לארבע ו -0.75 כפול 10 לארבעת התאים למנה ב -10 מיליליטר מדיה במשולש

לאחר מכן הניחו את הצלחות בחממה לאחר 10 ימי תרבות, שפכו את המדיום ושטפו את התאים ב- PBS. לאחר מכן תקן אותם על ידי הוספת 100% מתנול למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות, שפכו את המתנול.

לאחר מכן כדי לזהות היווצרות מושבה, הוסף 0.4% משקל בנפח gza מדולל אחד עד 20 עם דגירה של המים המיוננים למשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן שופכים את הכתם ושוטפים במים המיוננים. אפשר לדגימות להתייבש באוויר ולכמת את מספר המושבות המכילות יותר מ-25 תאים לכל מושבה באמצעות מיקרוסקופ או הדמיה הפוכה.

המושבות גדולות ומורכבות מכמה מאות תאים כפי שמוצג כאן ומציגות פנוטיפ מזנכימלי. MSC בודדו כפי שמוצג בסרטון זה וציפו ב-96 לוחות בארות המדמים צמיחה. לאחר מכן נוספו תאים מציגי אנטיגן שסומנו כ-CFSE ל-MSCs של הריאות.

לאחר מכן נמדדה התפשטות MSCs מבודדים כירידה בעוצמת הקרינה הממוצעת של CFSE בהשוואה לרקע, שסומן על ידי CFSE תאי T בלבד כפי שמוצג באיור זה, בהיעדר SC ריאתי ונוכחות של תאים מציגים אנטיגן, תאי T יעילים חיוביים של PC פלוס O אלבומין CD 40 מדגימים ירידה בעוצמת CFSE, מה שמצביע על התפשטות מוקפת בעיגול אדום. עוצמת הקרינה של CFSE של קרום תאי ה-T יורדת מבחינה אקונומטרית עם כל חלוקת תא כלומר חצי עם כל חלוקה בנוכחות ריאות M-S-C-A-P-C פלוס מינוס OVA CD 40 תאי T מושפעים חיוביים אינם מראים שינוי משמעותי בעוצמת CFSE, מה שמעיד על חוסר התפשטות לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של תאי גזע ריאתיים לחקור את תפקידם של תאי גזע מזנכימליים במחלות ריאה כגון יתר לחץ דם עורקי ריאתי ופיברוזיס ריאתי.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כחמש שעות בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מבחני התמיינות על מנת לענות על שאלות נוספות, כולל האם תאי הגזע המזנכימליים המשוערים של הריאה מציגים התמיינות רב-שושלתית, פוטנציאל לשומן עצמות וסחוס.