Ein miniaturisiertes Glycan Microarray-Test zur Beurteilung der Avidität und Spezifität von Influenza-A-Virus Hämagglutininarten

Das übergeordnete Ziel dieses miniaturisierten Glykan-Arrays ist es, die Spezifität und Avidität von Influenza-A-Virus-Hämagglutininen zu analysieren. Dieser Assay kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur Bindung und Avidität von Influenza-A-Virusrezeptoren zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir innerhalb eines einzigen Assays sowohl die Spezifität als auch die relative Bindungsavidität berücksichtigen können, die normalerweise bei typischen Glykanarray- und plattenbasierten Assays nicht erreicht wird.

Dieses Protokoll beginnt mit der Vorbereitung der Glykanproben. Die Basislösung für die Glykane ist ein Stammdruckpuffer, der nach seiner Herstellung langsam auf einen pH-Wert von 8,5 titriert und dann mit Tensid versetzt werden sollte. Verdünnen Sie die PAA-konjugierten Glykane mit dem vorbereiteten Druckpuffer auf 100 Mikrogramm pro Milliliter.

Verdünnen Sie dann die einwertigen Glykane ebenfalls im Druckpuffer auf 100 Mikromolar. Zum Schluss stellen Sie Arbeitsbestände der aminfunktionalisierten Farbstoffe an einem Mikromolar her. Laden Sie nun zehn Mikroliter jeder Glykanprobe in eine Vertiefung einer 384-Well-Mikrotiterplatte.

Dies ist eine ausreichende Lösung, um fünf Folien zu drucken. Übertragen Sie ebenfalls zehn Mikroliter des Farbmarkers in eine Vertiefung der Druckplatte. Bereiten Sie den Druck der Arrays vor, indem Sie zuerst die Arrayer-Pins und den Druckkopf entsprechend dem Layout positionieren.

In diesem Fall kann ein Pin alle Proben drucken. Die Glykanarrays sind in Sechserblöcken gedruckt, die an allen Seiten von einem leeren Fleck umgeben sind. Ziehen Sie Handschuhe an, um die Folien zu handhaben.

Packen Sie sie aus und blasen Sie alle Ablagerungen mit ultrahochreinem Stickstoffgas von ihren Oberflächen. Positionieren Sie anschließend die Objektträger mit der beschichteten Seite nach oben auf dem Arrayer-Tisch. Programmieren Sie dann den Arrayer.

Programmieren Sie in diesem Fall 27 Spots pro Besuch auf der Quellplatte. Drei Pre-Spots, die auf dem Nicht-Array-Bereich eines Poly-L-Lysin-beschichteten Objektträgers platziert werden, werden verwendet, um überschüssige Flüssigkeit an der Spitze des Stifts zu entfernen. Die anderen 24 Spots pro Pin-Besuch werden verwendet, um sechs Spots in vier Replikat-Arrays zu platzieren.

Einzelheiten finden Sie im Textprotokoll. Legen Sie nun die Multi-Well-Platten in den Drucker ein und beginnen Sie mit dem Drucken der Arrays. Achten Sie beim Drucken darauf, dass die Luftfeuchtigkeit zwischen 55 und 65 % bleibt. Achten Sie auf das Aussehen der Vorflecken auf den mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträgern.

Sie nach dem Drucken jede Folie visuell. Überprüfen Sie die korrekte Ausrichtung der Flecken innerhalb der Teflongrenzen, was von entscheidender Bedeutung ist, und überprüfen Sie die korrekte Anzahl der gefleckten Merkmale. Um die Befestigung der Punkte zu homogenisieren, legen Sie die gedruckten Objektträger sofort nach der Herstellung mit der bedruckten Seite nach oben mit der bedruckten Seite nach oben in eine Kammer mit 100 % Luftfeuchtigkeit.

Verwenden Sie feuchte Papiertücher, um einen Behälter und ein provisorisches Gestell auszukleiden. Wickeln Sie die Kammer in Plastik ein, um die Feuchtigkeit einzuschließen. Entfernen Sie nach einer halben Stunde die Objektträger.

Nummerieren Sie dann die Objektträger mit einem lösungsmittelbeständigen Marker und bewahren Sie sie über Nacht in einer Trocknungsbox auf. Bereiten Sie am nächsten Tag unter kräftigem Rühren einen frischen Vorrat an Blockpuffer vor. Stellen Sie den pH-Wert von 9,2 mit konzentriertem Natriumhydroxid ein.

Inkubieren Sie dann die Objektträger eine Stunde lang im Puffer. Um den Block zu entfernen, spülen Sie die Objektträger mit doppelt destilliertem Wasser ab. Übertragen Sie dann die Objektträger in Glasfärbehalter und laden Sie die Halter in einen schwingenden Plattenhalter, um die Objektträger fünf Minuten lang bei 10 g trocken zu schleudern.

Lagern Sie die Objektträger nach dem Trocknen bei Bedarf bei minus 20 Grad Celsius in verschlossenen Plastiktüten. Zur Vorbereitung eine weitere Befeuchtungskammer wie zuvor herstellen. Um die immobilisierten Glykane nachzuweisen, bereiten Sie biotinylierte SNA- und ECA-Lektine in einer Menge von 10 Mikrogramm pro Milliliter in Sondierungspuffer vor und fügen Sie jeder Verdünnung zwei Mikrogramm pro Milliliter Streptavidin 555 hinzu.

Um mit den Hämagglutininen zu färben, stellen Sie eine 20 Mikrogramm pro Milliliter Lösung des Präkomplex-Antikörpers in Blockpuffer in einem molaren Verhältnis von vier zu zwei zu eins her, wie im Textprotokoll beschrieben. Übertragen Sie 20 Mikroliter der vorbereiteten Lösungen in Vertiefungen einer 384-Well-Platte. Als nächstes verdünnen Sie die Lektine und Hämagglutinine eins zu eins in den entsprechenden Puffern.

Nehmen Sie acht Verdünnungen vor und füllen Sie jede Vertiefung mit 10 Mikrolitern Probe und 10 Mikrolitern Puffer. Inkubieren Sie die Platte nun 30 Minuten lang auf Eis. Geben Sie nun acht Mikroliter jeder Verdünnung in eine der 48 Mikrovertiefungen auf einem gedruckten Objektträger.

Dann inkubieren Sie den vorbereiteten Objektträger 90 Minuten lang in der Befeuchtungskammer. Waschen Sie die Folie nach 90 Minuten, während Sie sie vom Rand halten; Tauchen Sie es viermal in PBS-T, tauchen Sie es dann viermal in PBS und tauchen Sie es schließlich viermal in entionisiertes Wasser. Schleudern Sie nun die Folie wie zuvor.

Scannen Sie den Objektträger nach dem Schleudern sofort. Achten Sie darauf, das Objektträger vorsichtig und in der richtigen Ausrichtung in den Scanner einzulegen. Mit einer geringen Laserleistung von fünf Milliwatt scannen Sie die Objektträger iterativ und erhöhen die Verstärkung schrittweise von 25 auf 75 %. Bei der Optimierung der Scaneinstellungen ist zu beachten, dass die Fluorophore bei wiederholten Scans ausbleichen.

Analysieren Sie das gespeicherte Bild mit der zugehörigen Software auf Bindungssignale. Es kann eine Array-Liste geladen werden, die das Spotting-Muster enthält. Überlagern Sie es auf dem Scan, um die Platzierung der Rastermarkierungen zu erleichtern.

Verwenden Sie dann die Software, um die Punktintensitäten zu analysieren und die Ergebnisse als tabulatorgetrennte Textdatei zu speichern, um sie in eine Tabelle oder ein anderes Statistikpaket zu exportieren. Analysieren Sie die Daten, indem Sie die mittlere Signalintensität abzüglich des Hintergrunds berechnen. Nehmen Sie durchschnittlich vier der sechs Replikationsspots für jedes Sample, wobei Sie das höchste Signal und das niedrigste Signal auslassen.

Erstellen Sie dann ein Liniendiagramm des durchschnittlichen mittleren Signals abzüglich des Hintergrunds im Vergleich zu den acht Proteinkonzentrationen. Glätten Sie die resultierende Linie mit der nichtlinearen Regression. Das PAA-Array wurde verwendet, um die Rezeptorbindungsspezifität von Hämagglutininen des Influenza-A-Virus zu bewerten.

Das Array enthielt nicht-sialylierte Kontrollen in denselben Mikrovertiefungen. Als Positivkontrollen wurden pflanzliche Lektine mit bekannten Spezifitäten für die gedruckten Verbindungen verwendet. Das ECA-Lektin band an terminale Galaktose beta 1-4, war an Anacetylglucosamin gebunden und band nicht an dieselbe Verbindung, wenn die terminale Galaktose mit Sialinsäure verschlossen war.

Zur Untersuchung von alpha 2-6 verknüpfter Sialinsäure wurde das SNA-Lektin verwendet. Erwartungsgemäß bindete SNA nur an alpha 2-6 verknüpfte Sialinsäuren, jedoch mit bemerkenswerten Unterschieden in der Affinität für PAA-gebundene und nicht-PAA-gebundene Farbstoff-lacNAc-Wiederholungen. Als nächstes wurde ein H5-Hämagglutinin getestet, das von einem Vietnam/1203/04-Virus abgeleitet ist und nur Alpha-2-3-verknüpfte Sialinsäuren erkennt.

Das Bindungsprofil des H5-Hämagglutinins zeigte die erwartete Spezifität mit einer höheren Avidität für die PAA-verknüpften Strukturen. Schließlich wurde das H1-Hämagglutinin aus einem humanen saisonalen H1N1-Stamm getestet. Erwartungsgemäß bindete dieses Hämagglutinin nur an alpha 2-6 verknüpfte Sialinsäure-haltige Strukturen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik die Bindungsspezifitäten und relativen Aviditäten von Influenzaviren in einem einzigen Assay aufzeigen. Diese Technik wird die Effizienz von Influenza-Bindungsassays erheblich verbessern und den Verbrauch wertvoller biologischer Wirkstoffe reduzieren.