Eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza Hämagglutinin spezifische Antikörper induziert

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Fähigkeit eines Antikörpers oder einer Serumprobe zu bewerten, die Fc-vermittelte Effektorfunktion zu aktivieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in den Bereichen Immunologie und Vakzinologie zu beantworten, indem sie die Aktivierung der antikörperabhängigen Fc-vermittelten Immunität misst. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Experiment innerhalb von 24 Stunden von der Materialvorbereitung bis zur Datenanalyse durchgeführt werden kann.

Verfahren wird Mark Bailey, Doktorand aus dem Labor von Peter Palese, vorführen. Um die Hämagglutinin-Expression des Influenzavirus durch Transfektion zu induzieren, werden zuerst 293 Zellen der menschlichen embryonalen Niere mit einer Konzentration von zweimal 10 bis zu den vierten Zellen pro Vertiefung in einer mit Weißgewebekultur behandelten 96-Well-Platte platte. Nach vier Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 transfizieren Sie die Zellen mit 100 Nanogramm DNA, die für virales Hämagglutinin kodiert, und 0,2 Mikrolitern Transfektionsreagenz pro Vertiefung und einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern 1x optimal reduziertem Serummedium.

Geben Sie DNA-Liposomenkomplexe in jede Vertiefung, um sie zu transfizieren, und stellen Sie die Platte für weitere 18 Stunden in den Inkubator. Um die Hämagglutinin-Expression des Influenzavirus durch eine Infektion zu induzieren, werden A549-Zellen in einer mit Weißgewebekultur behandelten 96-Well-Platte für eine mindestens 18-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 in einer mit Weißgewebekultur behandelten Platte mit zwei mal 10 Zellen pro Vertiefung plattiert. Am Ende der Inkubation verdünnen Sie das Influenzavirus auf eine Mehrfachinfektion von drei von 100 Mikrolitern 1X MEM-Medium pro Vertiefung und infizieren Sie die A459-Zellen eine Stunde lang im Zellkultur-Inkubator.

Ersetzen Sie am Ende der Inkubation das Inokulum durch 100 Mikroliter frisches 1X MEM-Medium ohne Virus und stellen Sie die Zellen für weitere 18 bis 24 Stunden in den Inkubator zurück. Um die Fähigkeit spezifischer Antikörper von Interesse zu beurteilen, auf die Hämagglutinin-exprimierenden Zellen abzuzielen, wird der Überstand der viral betroffenen Zellkulturen durch 25 Mikroliter Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität oder ADCC-Testmedium ersetzt. Als nächstes führen Sie in einer separaten 96-Well-Platte vier vollständige Verdünnungen der interessierenden Antikörper in dreifacher Ausfertigung in frischem ADCC-Medium durch, beginnend bei 10 Mikrogramm pro Milliliter gemäß dem Schema, und achten Sie darauf, den Hintergrund und keine Antikörperkontrollen einzubeziehen.

Wenn der gesamte Antikörper verdünnt ist, werden 25 Mikroliter des verdünnten Antikörpers in die entsprechenden Vertiefungen in der experimentellen Zellplatte überführt und die Platte in den Zellkultur-Inkubator gelegt. Nach 15 Minuten wird 7,5 mal 10 zu den vierten modifizierten Effektor-Jurkat-Zellen addiert, die den entsprechenden Fc-Rezeptor pro Vertiefung in 25 Mikrolitern ADCC-Medium exprimieren, um ein Endvolumen von 75 Mikrolitern ADCC-Medium pro Vertiefung zu erhalten. Stellen Sie die Platte für sechs Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück und tauen Sie den Luciferase-Substratpuffer in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad in der letzten Stunde der Inkubation auf.

Wenn der Puffer fertig ist, fügen Sie 75 Mikroliter Luciferase-Substratpuffer zu allen Vertiefungen mit Ausnahme der Hintergrundkontrollvertiefung hinzu und lesen Sie die Platte auf einem Luminometer ab. Anschließend kann die Falteninduktion der antikörperabhängigen zellvermittelten Zytotoxizität in den transfizierten oder infizierten Zellkulturen berechnet werden. In diesem Experiment aktivierte und modifizierte ein bestandsspezifischer monoklonaler Antikörper Jurkat-Zellen, die den murinen Fc-Gamma-Rezeptor vier exprimieren, im Vergleich zu kopfspezifischen monoklonalen und Kontroll-IgG-Antikörpern robust und um das 14-fache.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Experiment einrichten können, um die Fähigkeit bestimmter Antikörper von Interesse zu bewerten, die Fc-vermittelte Immunität zu aktivieren.