Name: Eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza Hämagglutinin spezifische Antikörper induziert (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza-Hämagglutinin-spezifische Antikörper. Dieses Protokoll ermöglicht die schnelle Analyse der Antikörper-vermittelten zellulären Zytotoxizität innerhalb von 24 Stunden.

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Dieses Projekt wurde teilweise mit Bundesmitteln aus dem National Institute of Allergy and Infectious Diseases finanziert, National Institutes of Health, Department of Health And Human Services, unter CEIRS Vertrag P01AI097092-04S1 (P.E.L.).

Die Experimente in diesem Manuskript vorgeformt wurden folgende Icahn School of Medicine der institutionellen Code von Ethik und Vorschriften durchgeführt.
1. Ausdruck des Influenza-Virus Hämagglutinin über Transfektion oder Infektion
Transfektion:
<ol><li>Platte menschlichen embryonalen Niere (HEK 293T) Zellen bei einer Dichte von 2 x 104 Zellen/Brunnen in einer weißen Gewebekultur behandelt 96-Well-Platte und lassen Sie es für 4 h in einem Inkubator 37 °C (mit 5 % CO2).</li>
	<li>Transfizieren Zellen mit 100 ng der DNA Kodierung für virale Hämagglutinin und 0,2 μl Transfection Reagens pro Bohrloch in einem Gesamtvolumen von 50 μL. Hinweis: Beide Plasmid und Transfectant Reagenz 1 x Opti-Minimum wesentlichen Medien (MEM) reduziert Serum Medium verdünnt werden.</li>
	<li>Entfernen Sie nach Platten in einem Inkubator 37 °C mit 5 % CO2 für 18 h Inkubation, Transfektion Medium.</li>
</ol>(2) Infektion
<ol><li>Platte A549 oder Madin Darby canine Nieren-Zellen bei einer Dichte von 2 x 104 Zellen/Brunnen in einer weißen Gewebekultur wachsen mindestens 18 Stunden in einem 37 °C Inkubator mit 5 % CO2und 96-Well-Platte behandelt.</li>
	<li>Verdünnten Virus in 1 x MEM und infizieren Zellen bei einer Vielzahl von Infektionen von 3, 1 oder 0,33 für 1 h in einem Inkubator 37 °C mit 5 % CO2. Gesamtvolumen sollte 100 μL entsprechen. Hinweis: 10 X MEM wird verdünnt mit Wasser zu einer 1 x MEM arbeiten Lager für die oben genannten Virus-Verdünnung.</li>
	<li>Nach der Infektion, entfernen das Inokulum und 100 μl 1 x MEM in die Platte in der Abwesenheit von Trypsin.</li>
	<li>Wachsen Sie infizierte Zellen für 18 bis 24 h in einem Inkubator 37 °C mit 5 % CO2.</li>
</ol>3. Beurteilung der FcRg/NFAT-vermittelte Aktivierungs der Luciferase-Aktivität durch monoklonale Antikörper oder Sera
<ol><li>Zunächst ersetzen Sie Wachstumsmedien transfizierte oder infizierten Zellen mit 25 µL Assays Medien (1 X RPMI 1640 ergänzt mit 4 % (Vol/Vol) niedrige IgG fetalen bovine Sera).</li>
	<li>Durchführen Sie in eine separate 96-Well-Platte vierfach Verdünnungen der Antikörper des Interesses ab 30 μg/mL mit Hilfe der Assay-Medien. Verdünnungen in Triplicates durchführen und eine Beispiel-Platte-Layout ist in Figur 1Adargestellt. Stellen Sie sicher, ein Steuerelement, das Antikörper (keine Antikörper-Kontrolle) ausschließt sowie ein Hintergrund-Steuerelement (Testpuffer allein). Hinweis: für beide der "keine Antikörper" und Hintergrund-Kontrollen, fügen Sie 25 µL Testpuffer statt Antikörper.</li>
	<li>Übertragen Sie 25 μL der seriell verdünnten Antikörper von Schritt 3.2 in entsprechenden Vertiefungen auf Platte transfizierten Zellen oder infizierten Zellen.</li>
	<li>Inkubieren Sie Platte in einem Inkubator 37 °C (mit 5 % CO2) für 15 min.</li>
	<li>Fügen Sie 25 μL der entsprechenden veränderten Effektor Jurkat Zelle murinen FcgRIV oder menschliche FcgRIIIa (75.000 von Zellen/weit) zum Ausdruck bringen. Gesamtvolumen für jede sollte gut 75 µL und der Start Endkonzentration des Antikörpers ist bei 10 µg/mL (Abbildung 1 b). Hinweis: Für das Hintergrund-Steuerelement fügen Sie 25 µL Testpuffer statt Effektorzellen hinzu. Um Antikörper-abhängige zellvermittelte Phagozytose zu untersuchen, kann eine modifizierte Jurkat-Zelle mit dem Ausdruck der menschlichen FcgRIIa verwendet werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie Platte in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2 6 h.</li>
	<li>Tauwetter und warmen Luciferase Substratpuffer in einem 37 °C Wasser für ca. 1 h vor dem Gebrauch. Hinweis: Um die Luciferase Substratpuffer machen, bereiten Sie lyophilisierter Luciferase Assay Substrat in Testpuffer zur Verfügung gestellt. Die rekonstituierte Substratpuffer kann bis zu sechs Wochen bei-30 °C bis-10 °C aufbewahrt werden.</li>
	<li>Alle Vertiefungen mit Ausnahme der Hintergrundkontrolle 75 μl/Well der Luciferase Substratpuffer hinzufügen.</li>
	<li>Lesen Sie auf einem Luminometer.</li>
	<li>Falten-Induktion mit folgender Gleichung berechnen: Falten Induktion (induzierte Wert-Background-Wert) = / (keine mAb-Wert-Background-Wert).</li>
</ol>

<ol><li>Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+serum+haemagglutination-inhibiting+antibody+in+protection+against+challenge+infection+with+influenza+A2+and+B+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses.</a> J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).</li>
<li>Throsby, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosubtypic+neutralizing+monoclonal+antibodies+cross-protective+against+H5N1+and+H1N1+recovered+from+human+IgM%2B+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells.</a> PloS One. 3 (12), e3942(2008).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324 (5924), 246-251 (2009).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-H1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Broadly+Neutralizing+Monoclonal+Antibody+That+Targets+the+Fusion+Domain+of+Group+2+Influenza+A+Virus+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin.</a> J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).</li>
<li>Friesen, R. H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+solution+to+group+2+influenza+virus+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A common solution to group 2 influenza virus neutralization.</a> PNAS. 111 (1), 445-450 (2014).</li>
<li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Conserved+Protective+Epitopes+on+Influenza+B+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses.</a> Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).</li>
<li>Krammer, F., Palese, P., Steel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Universal+Influenza+Virus+Vaccine+Design+and+Antibody+Mediated+Therapies+Based+on+Conserved+Regions+of+the+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microb+and+Immunol%22%5BJournal%5D)">Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin.</a> Curr Top Microb and Immunol. , Chapter 408 (2014).</li>
<li>Impagliazzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+trimeric+influenza+hemagglutinin+stem+as+a+broadly+protective+immunogen%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.</a> Science. , (2015).</li>
<li>Nachbagauer, R., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Microbiology+and+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microb+Infect%22%5BJournal%5D)">Clinical Microbiology and Infection.</a> Clin Microb Infect. , 1-7 (2017).</li>
<li>Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+universal+influenza+virus+vaccine+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+virology%22%5BJournal%5D)">Novel universal influenza virus vaccine approaches.</a> Current opinion in virology. 17, 95(2016).</li>
<li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+vaccine+based+on+the+conserved+hemagglutinin+stalk+domain%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly+protective+stalk-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies.</a> J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Tan, G. S., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+Stalk-Reactive+Antibodies+Are+Boosted+following+Sequential+Infection+with+Seasonal+and+Pandemic+H1N1+Influenza+Virus+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin Stalk-Reactive Antibodies Are Boosted following Sequential Infection with Seasonal and Pandemic H1N1 Influenza Virus in Mice.</a> J Virol. 86 (19), 10302-10307 (2012).</li>
<li>Hai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+viruses+expressing+chimeric+hemagglutinins%3A+globular+head+and+stalk+domains+derived+from+different+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes.</a> J Virol. 86 (10), 5774-5781 (2012).</li>
<li>Dunand, C. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Neutralizing+and+Non-Neutralizing+Human+H7N9+Influenza+Vaccine-Induced+Monoclonal+Antibodies+Confer+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection.</a> Cell Host and Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly-Reactive+Neutralizing+and+Non-neutralizing+Antibodies+Directed+against+the+H7+Influenza+Virus+Hemagglutinin+Reveal+Divergent+Mechanisms+of+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Path%22%5BJournal%5D)">Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection.</a> PLoS Path. 12 (4), e1005578(2016).</li>
<li>DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+hemagglutinin+stalk-specific+antibodies+require+Fc%CE%B3R+interactions+for+protection+against+influenza+virus+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus in vivo.</a> Nat Med. 20 (2), 143-151 (2014).</li>
<li>DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+anti-influenza+antibodies+require+Fc+receptor+engagement+for+in+vivo+protection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection.</a> J Clin Invest. 126 (2), 605-610 (2016).</li>
<li>Potter, C. W., Oxford, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+immunity+to+influenza+infection+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Determinants of immunity to influenza infection in man.</a> Brit Med Bull. 35 (1), 69-75 (1979).</li>
<li>Memoli, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Antihemagglutinin+and+Antineuraminidase+Antibodies+as+Correlates+of+Protection+in+an+Influenza+A%2FH1N1+Virus+Healthy+Human+Challenge+Model%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Antihemagglutinin and Antineuraminidase Antibodies as Correlates of Protection in an Influenza A/H1N1 Virus Healthy Human Challenge Model.</a> mBio. 7 (2), e00417(2016).</li>
<li>Jegaskanda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+cross-reactive+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+toward+2009+pandemic+influenza+A+virus+subtype+H1N1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Age-associated cross-reactive antibody-dependent cellular cytotoxicity toward 2009 pandemic influenza A virus subtype H1N1.</a> J Infect Dis. 208 (7), 1051-1061 (2013).</li>
<li>Jegaskanda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-Reactive+Influenza-Specific+Antibody-Dependent+Cellular+Cytotoxicity+Antibodies+in+the+Absence+of+Neutralizing+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-Reactive Influenza-Specific Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Antibodies in the Absence of Neutralizing Antibodies.</a> J Immunol. 190 (4), 1837-1848 (2013).</li>
<li>Jegaskanda, S., Wheatley, A. K., Kent, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScienceDirectAntibody-dependent+cellular+cytotoxicity+and+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">ScienceDirectAntibody-dependent cellular cytotoxicity and influenza virus.</a> Curr Opin Virol. 22 (C), 89-96 (2017).</li>
<li>Srivastava, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Dominant+Antibody-Dependent+Cell-Mediated+Cytotoxicity+Epitopes+on+the+Hemagglutinin+Antigen+of+Pandemic+H1N1+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of Dominant Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Epitopes on the Hemagglutinin Antigen of Pandemic H1N1 Influenza Virus.</a> J Virol. 87 (10), 5831-5840 (2013).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+specificity+plays+a+critical+role+in+regulating+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+against+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Epitope specificity plays a critical role in regulating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza A virus.</a> PNAS. 113 (42), 11931-11936 (2016).</li>
<li>Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+activation+of+Fc-mediated+effector+functions+by+influenza+virus+hemagglutinin+antibodies+requires+two+points+of+contact%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Optimal activation of Fc-mediated effector functions by influenza virus hemagglutinin antibodies requires two points of contact.</a> PNAS. , 201613225(2016).</li>
<li>Benjamin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Broadly+Neutralizing+Human+Monoclonal+Antibody+Directed+against+a+Novel+Conserved+Epitope+on+the+Influenza+Virus+H3+Hemagglutinin+Globular+Head%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A Broadly Neutralizing Human Monoclonal Antibody Directed against a Novel Conserved Epitope on the Influenza Virus H3 Hemagglutinin Globular Head.</a> J Virol. 88 (12), 6743-6750 (2014).</li>
<li>Ekiert, D. C., Kashyap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-neutralization+of+influenza+A+viruses+mediated+by+a+single+antibody+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cross-neutralization of influenza A viruses mediated by a single antibody loop.</a> Nature. 488 (7417), 526-532 (2013).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+Neutralizing+Anti-Influenza+Virus+Antibodies%3A+Enhancement+of+Neutralizing+Potency+in+Polyclonal+Mixtures+and+IgA+Backbones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Broadly Neutralizing Anti-Influenza Virus Antibodies: Enhancement of Neutralizing Potency in Polyclonal Mixtures and IgA Backbones.</a> J Virol. 89 (7), 3610(2015).</li>
<li>Kristensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Responses+with+Fc-Mediated+Functions+after+Vaccination+of+HIV-Infected+Subjects+with+Trivalent+Influenza+Vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Antibody Responses with Fc-Mediated Functions after Vaccination of HIV-Infected Subjects with Trivalent Influenza Vaccine.</a> J Virol. 90 (12), 5724-5734 (2016).</li>
<li>Greenberg, S. B., Criswell, B. S., Six, H. R., Couch, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+cytotoxicity+to+influenza+virus-infected+cells.+II.+Requirement+for+antibody+and+non-T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+%28Baltimore%2C+Md.+%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte cytotoxicity to influenza virus-infected cells. II. Requirement for antibody and non-T lymphocytes.</a> J Immunol (Baltimore, Md. : 1950). 119 (6), 2100-2106 (1977).</li>
<li>Corrales-Aguilar, E., Trilling, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+detecting+virus-specific+antibodies+triggering+activation+of+Fc%CE%B3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcγ receptors.</a> J Immunol Meth. 387 (1-2), 21-35 (2013).</li>
<li>de Vries, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus-specific+antibody+dependent+cellular+cytoxicity+induced+by+vaccination+or+natural+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Influenza virus-specific antibody dependent cellular cytoxicity induced by vaccination or natural infection.</a> Vaccine. 35 (2), 238-247 (2017).</li>
<li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+robust+reporter-based+ADCC+assay+with+frozen%2C+thaw-and-use+cells+to+measure+Fc+effector+function+of+therapeutic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies.</a> J Immunol Meth. 414 (1), 69-81 (2014).</li>
</ol>

Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Die hier beschriebene Methode ermöglicht dem Benutzer die Fähigkeit eines HA-spezifischen monoklonalen Antikörpers, der murinen FcγRIV zu messen. Das Ziel-Antigen, Influenza Virus Hämagglutinin, drückt sich auf der Oberfläche der Zellen nach der Infektion durch Viren oder Transfektion von Plasmid DNA. Der Test ist ein weiterer mit verschiedene Oberfläche ausgedrückt virale Proteine in Kombination mit anderen FcγRs (Menschen oder Murine) zugänglich. Darüber hinaus wir haben verwendet Sera Proben um zu beurteilen, die Fähi...

Immunität von der saisonalen Grippe-Impfstoff zur Verfügung gestellt wurde traditionell durch Hämagglutination Inhibition (HI) Assay1bewertet, das Vorhandensein von Antikörpern, die auf die Rezeptor-Bindungsstelle des das Hämagglutinin misst. Diese HI-aktive Antikörper sterilisieren Immunität verleihen können, aber sind in der Regel eng in ihrer Breite von Schutz, bietet Immunität gegen nur eine ausgewählte einige Stämme des Influenza-Virus. Die Isolierung und Charakterisierung von weitgehend reaktiven monoklonalen Antikörpern, die das Hämagglutinin (HA) erkennen schlagen vor, dass die Entwicklung eines universellen Grippeimpfstoffs in Reichweite2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. ist eines der Hauptziele des universellen Grippeimpfstoffs induzieren eine starke Antikörperantwort auf die konservierten Bereiche des Influenza-Virus9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. im großen und ganzen Antikörper, die diese konservierten Epitope, bestehend aus neutralisierende und nicht neutralisierende Antikörper17,18erkannt haben gezeigt, dass Fc-FcγR Interaktionen für erfordern optimale Schutz in Vivo und Highlight des Beitrags der Fc-vermittelten Immunität gegen die allgemeine Immunantwort auf Influenza Virus19,20.
Korrelate des Schutzes sind entscheidend bei der Beurteilung der Immunität gegen Infektionen. Diese Metriken ermöglichen Wissenschaftlern und Klinikern, die Wirksamkeit von Impfstoffen, die Bedeutung der Daten und der Verlauf der Behandlung zu schätzen. Das einzige etablierte Korrelat der Schutz gegen Influenza-Virus-Infektion ist die Hämagglutination Inhibition Assay. Ein Titer von 01:40 ist mit einer 50 % Reduktion des Risikos von Krankheit1,21 – und spiegelt das Vorhandensein von Antikörpern, die Agglutination zu hemmen, indem Sie auf den Rezeptor verbindlich vor Ort auf den kugelförmigen Kopf des HA. Allerdings sei auch darauf hingewiesen, dass T-Zell-Reaktionen möglicherweise eine bessere Korrelat der Schutz gegen Influenza-Virus-Infektion bei älteren Menschen. Ein kürzlich veröffentlichten Bericht zufolge Interessanterweise Neuraminidase Hemmung Tätigkeit ein besserer Prädiktor der Immunität gegen Grippe22sein kann. Glücklicherweise Tests typische in-vitro- , wie z. B. Neutralisation oder Neuraminidase Hemmung Assays HA Stiel oder Neuraminidase-spezifische Antikörper messen können. Die meisten dieser konventionellen in-vitro- Tests jedoch nur berücksichtigen sowohl die Funktion des Antigen-Bindung-Region des Antikörpers und Messen nicht die Rolle der Fc-Region. Darüber hinaus sind der Beitrag der nicht neutralisierende Antikörper, die über Fc-Rezeptor Engagement in Vivo zu schützen nicht erkannten17,18. Um Schutz durch Antikörper, die Fc-vermittelten Immunität wie Antikörper abhängige Zelle vermittelten Zytotoxizität (ADCC) induzieren zu messen, braucht man ein robuste in-vitro- Assay.
Die unten beschriebene Methode beurteilt die Fähigkeit von murinen monoklonalen Antikörpern, Fc-vermittelten Funktionen durch den Einsatz von gentechnisch veränderten Jurkat Zell-Linie mit dem Ausdruck einer Aktivierung induzieren Murine Typ 1 FcR, FcγRIV. Antikörper-Engagement von der FcγR transduces intrazellulären signalisieren, dass Trigger nuklearen Faktor der aktivierten T-Zellen vermittelten Luciferase-Aktivität. Der Test hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Techniken, die Isolierung und Kultur der primären Effektorzellen und die Verwendung der Durchflusszytometrie zur Aktivierung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen19,23,24 Erkennung erfordern ,25,26. Erstens kann das Protokoll hier beschriebenen leicht verschiedene virale Ziele, FcγRs und Antikörper verschiedener Arten (menschliche und murine) integrieren angepasst werden. Zweitens die Verwendung einer modifizierten Jurkat-Zelle Zeile zum Ausdruck zu bringen, die eine FcγR mit einer Luciferase Reporter-gen unter einem nuklearen Faktor von aktivierten T-Zellen (NFAT) für einen Großformat-Assay ermöglicht, die mit einer Platte Reader Messung der Lumineszenz leicht analysiert werden können. Hier wird die traditionelle Aktivierung des primären Effektorzellen mit der Induktion von NFAT-Luciferase auf Antikörper Engagement von einer FcγR auf der Oberfläche der Zelle Jurkat ersetzt. 96-Well-Platte Format Assays kann für die Messung von bis zu vier verschiedene Proben in Triplicates mit sieben Verdünnungen – eine Reihe von Proben, die umständlich mit traditionellen Techniken werden könnte. Gibt es weitere Punkte, die mit dieser Assay, die das Design von Experimenten und die Interpretation der Daten beeinträchtigen können. Das virale Ziel muss auf der Zelloberfläche in Reihenfolge für die Antikörper Anerkennung ausgesprochen werden. Um dies zu mindern, kann das Ziel-Antigen (z.B. eine interne virale Proteine) direkt auf die Oberfläche der Platte beschichtet werden. Allerdings hat dies noch nicht rigoros getestet. Darüber hinaus die modifizierte Zellinie Jurkat drückt nur eine Art der Aktivierung FcγR und drückt keine hemmenden FcγRs während Primärzelle Linien alle Rezeptoren in einem physiologischen Kontext auszudrücken.
Wir haben zuvor dieser Assay verwendet, um zu zeigen, dass Epitop-Spezifität in einem polyklonalen Kontext eine entscheidende Rolle spielt bei der Regulierung der Fc-vermittelten Effektor-Funktionen und optimale Aktivierung des Antikörper-abhängige zellvermittelte Reaktion zwei Punkte erfordert wenden Sie sich an27,28. Hier beschreiben wir eine Methode, die bewertet die Fähigkeit von Stiel-spezifischen monoklonalen Antikörpern zu engagieren und aktivieren die Murine FcγRIV aktivieren. Zwar gibt es Ausnahmen29,30, eine große Anzahl von weitgehend Antikörper Ziel antigenetisch erhaltenen Stiel und Umgebung das Hämagglutinin und somit eine wichtige Rolle bei der Entwicklung einer universellen Grippe Impfstoff.

<table><tbody><tr><td>A549 Zellen&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>Adenokarzinomische humane alveoläre Basalepithelzellen</td></tr><tr><td>HEK 293T-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Menschliche embryonale Nierenzellen</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668019</td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>1X Opti-MEM Reduced Serum</td><td>Medium ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>Mit Weißgewebekulturen behandelte 96-Well-Platte</td><td>Corning, Inc.&nbsp;</td><td>3917</td><td>Assay-Platten</td></tr><tr><td>10X MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat-Zell-exprimierendes FcgRIV</td><td>Promega</td><td>M1201</td><td>Kit enthält Zellen, Bio-Glo Luciferase Assay-System, 1X RPMI und Serum mit niedrigem IgG-Gehalt</td></tr><tr><td>Jurkat-Zellen exprimierendes humanes FcgRIIIa</td><td>Promega</td><td>G7010</td><td>Kit enthält Zellen, Bio-Glo Luciferase Assay-System, 1X RPMI und Serum</td></tr> <tr><td>mit niedrigem IgG-GehaltDas</td><td>Promega</td><td>G9901</td> Kit enthält Zellen, ein humanes FcgRIIa <td>Promega G9901 Kit enthält Zellen, ein Bio-Glo Luciferase Assay-System, ein 1X RPMI und ein Serum-Luminometer mit niedrigem IgG-Gehalt</td></tr><tr><td></td><td>BioTek</td><td>Synergy H1 Multi-Mode Reader</td><td>Lumineszenzplatten-Reader</td></tr><tr><td>Bio-Glo Luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>G7940</td><td>Enthält Luciferase Assay-Puffer und Luciferase-Assay-Substrat</td></tr><tr><td>Madin Darby Canine Nierenzellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td>Nierenzellen bei Hunden</td></tr></tbody></table>

eine methode zur bewertung von fc-vermittelten effektor-funktionen durch influenza hämagglutinin spezifische antikörper induziert

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antikörper spielen eine entscheidende Rolle bei der Kopplung der angeborenen und der adaptiven Immunantwort gegen virale Erreger durch Antigen-bindenden Domänen und Fc-Regionen. Wir beschreiben hier, wie die Aktivierung gemessen Effektor-Funktionen durch monoklonale Antikörper gezielt die Influenza Virus Hämagglutinin mit dem Einsatz einer gentechnisch Jurkat-Zelllinie, die mit dem Ausdruck einer Aktivierung Art von Fc 1. Fc-FcγR. mit dieser Methode, die Beitrag der spezifischen Fc-FcγR-Wechselwirkungen durch Immunglobuline übertragenen kann durch ein in-vitro- Test bestimmt werden.

Wir konnten zeigen, dass ein Stiel-spezifische mAb, 6F12, aber nicht Kopf-spezifischen Kopf-spezifische mAb, PY102, konnte durch heraufregulierende CD107a und Interferon-γ-19primäre natürliche Killerzellen aktivieren. Um die Fähigkeit einer Stiel-spezifischen Antikörper, primären menschlichen NK-Zellen aktivieren zu modellieren, wir zeigen, dass ein Stiel-spezifische mAb, 6F12, robust aktivieren kann, die modifizierte Jurkat-Zelle mit dem Ausdruck der murinen FcγRIV von ~ 14-fold. Auf der anderen ...

Wir beschreiben eine Methode, um der Aktivierung des Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Antikörper dieses Ziel der Influenza Virus Hämagglutinin messen. Dieser Test kann auch angepasst werden, um die Fähigkeit der monoklonale Antikörper oder polyklonalen Seren gezielt andere virale Oberfläche Glykoproteine induzieren Fc-vermittelten Immunität zu beurteilen.

Eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza Hämagglutinin spezifische Antikörper induziert

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Fähigkeit eines Antikörpers oder einer Serumprobe zu bewerten, die Fc-vermittelte Effektorfunktion zu aktivieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf den Gebieten der Immunologie und Impfstoffforschung zu beantworten, indem die Aktivierung der antikörperabhängigen, Fc-vermittelten Immunität gemessen wird. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass das Experiment innerhalb von 24 Stunden – von der Probenvorbereitung bis zur Datenanalyse – durchgeführt werden kann.Mark Bailey, Doktorand aus dem Labor von Peter Palese, wird dieses Verfahren demonstrieren. Um die Expression des Influenza-Virus-Hämaggglutinins durch Transfektion zu induzieren, säen Sie zunächst menschliche embryonale Nierenzellen 293 mit einer Konzentration von zwei mal 10 hoch 4 Zellen pro Vertiefung in eine weiße, zellkulturgeeignete 96-Loch-Platte aus. Nach vier Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 transfectieren Sie die Zellen pro Vertiefung mit 100 Nanogramm DNA, die für virales Hämaggglutinin kodiert, sowie mit 0,2 Mikrolitern Transfektionsreagenz in einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern 1X Opti-MEM mit reduziertem Serum.Fügen Sie DNA-Liposomen-Komplexe zu jedem Brunnen hinzu, um eine Transfektion durchzuführen, und geben Sie die Platte für weitere 18 Stunden in den Inkubator zurück. Um die Expression des Influenza-Virus-Hämagglutinins durch Infektion zu induzieren, säen Sie A549-Zellen mit einer Konzentration von zweimal 10 hoch 4 Zellen pro Brunnen in eine weiße, gewebekulturgeeignete 96-Well-Platte für eine Inkubation von mindestens 18 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 aus. Am Ende der Inkubation verdünnen Sie das Influenza-Virus auf eine Multiplizität der Infektion von drei in 100 Mikroliter 1X MEM-Medium pro Brunnen und infizieren die A549-Zellen für eine Stunde im Zellkultur-Inkubator.Ersetzen Sie am Ende der Inkubation das Inokulum durch 100 Mikroliter frisches 1X MEM-Medium ohne Virus und stellen Sie die Zellen für weitere 18 bis 24 Stunden in den Inkubator zurück. Um die Fähigkeit spezifischer Antikörper von Interesse, die an die Hämagglutinin-exprimierenden Zellen binden, zu bewerten, ersetzen Sie das Überstandmedium der virusbehandelten Zellkulturen mit 25 Mikrolitern Medium für den Antikörperabhängigen Zellvermittelten Zytotoxizitäts-(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity, ADCC)-Test. Führen Sie anschließend in einer separaten 96-Loch-Platte vier volle Verdünnungen der Antikörper von Interesse in Dreifachbestimmungen in frischem ADCC-Medium durch, beginnend bei 10 Mikrogramm pro Milliliter gemäß der schematischen Darstellung, und achten Sie darauf, die Hintergrund- und die „kein Antikörper“-Kontrollen einzuschließen.Wenn die gesamte Antikörperlösung verdünnt ist, überführen Sie 25 Mikroliter der verdünnten Antikörperlösung in die entsprechenden Versuchsbrunnen der Zellkulturplatte und stellen Sie die Platte in den Zellkulturinkubator. Fügen Sie nach 15 Minuten je Brunnen 7,5 × 10⁴ modifizierte Effektor-Jurkat-Zellen, die den passenden Fc-Rezeptor exprimieren, in 25 Mikrolitern ADCC-Medium hinzu, sodass sich ein Endvolumen von 75 Mikrolitern ADCC-Medium pro Brunnen ergibt. Stellen Sie die Platte für sechs Stunden wieder in den Zellkulturinkubator und tauchen Sie während der letzten Stunde der Inkubation den Luciferase-Substratpuffer in ein 37 °C warmes Wasserbad zum Auftauen ein.Wenn der Puffer bereit ist, 75 Mikroliter Luciferase-Substratpuffer zu allen Vertiefungen hinzufügen, mit Ausnahme der Hintergrundkontrollvertiefung, und die Platte in einem Luminometer messen. Anschließend kann die Faltung der Antikörper-abhängigen, zellvermittelten Zytotoxizität in den transfizierten oder infizierten Zellkulturen berechnet werden. In diesem Experiment aktivierte und modifizierte ein gegen den Bestandteil spezifischer monoklonaler Antikörper Jurkat-Zellen, die den murinen Fc-Gamma-Rezeptor 4 exprimierten, im Vergleich zu kopfspezifischen monoklonalen Antikörpern und Kontroll-IgG-Antikörpern um etwa das 14-Fache.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Experiment zur Beurteilung der Fähigkeit spezifischer Antikörper des Interesses, die Fc-vermittelte Immunität zu aktivieren, einrichtet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Ein einfaches Slot-Blot-Methode wurde für die Quantifizierung von Influenza Virus Hämagglutinin und Neuraminidase mit universellen Antikörper, die gegen ihre stärksten konservierten Sequenzen durch bioinformatische Analysen identifiziert entwickelt. Dieser innovative Ansatz kann eine sinnvolle Alternative zu quantitativen Bestimmung aller viralen Hämagglutinin und Neuraminidase.

Quantitative Analysen aller Influenza Typ A Viral Hämagglutininen und Neuraminidasen mit Universal Antikörper in Einfache Slot Blot Assays

Diese Methode beschreibt die Verwendung von Infrarot-Farbstoff basierende Imaging-System für den Nachweis von H1N1 in bronchioalveolar Lavage (BAL) Flüssigkeit von infizierten Mäuse mit einer hohen Empfindlichkeit. Diese Methodik in einem 96 durchgeführt werden kann - oder 384-Well-Platte, erfordert &lt;10 ul Volumen von Testmaterial und hat das Potenzial für die gleichzeitige Screening von mehreren Erregern.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Das Video zeigt einen Hämagglutinations-Inhibitions-Assay zum Nachweis von Serum-Antikörpern gegen spezifische Antigene. Die Bestätigung der Hämagglutinationshemmung in der Testvertiefung und der Hämagglutination in der Kontrollvertiefung wird durch unterschiedliche visuelle Muster erreicht. Dieser Assay spielt eine entscheidende Rolle bei der Bewertung der Immunantwort, der Wirksamkeit von Impfstoffen und der Untersuchung von Virusinfektionen in der Virologie und Immunologie.

Der Hämagglutinationshemmungsassay zum Nachweis von Serumantikörpern gegen ein Zielantigen

Dieses Video zeigt einen Assay, der die Antikörper-vermittelte Aktivierung von T-Zell-Effektorfunktionen misst. Die Zugabe eines Influenzavirus-Hämagglutinin (HA)-spezifischen monoklonalen Antikörpers zu transfizierten Säugetierzellen, die HA exprimieren, führt zur Bildung von Immunkomplexen mit HA. Nach der Einführung von gentechnisch veränderten T-Zellen, die Fc-Rezeptoren und einen Luciferase-Reporter exprimieren, werden die T-Zellen durch die Antikörper-HA-Komplexe aktiviert, und diese...

Messung der Aktivierung von Fc-vermittelten Effektorfunktionen durch HA-Antikörper

Dieses Video zeigt einen Assay, der die Influenza-Neuraminidase (NA) misst, die die Antikörpertiter in einer Serumprobe hemmt. Eine Serumprobe, die Antikörper gegen NA enthält, wird auf eine mit Fetuin beschichtete Mikrotiterplatte gegeben. Nach Zugabe des Virus verhindern die Antikörper, dass virale NA Fetuin spaltet und seine Galaktose-Einheit freilegt. Anschließend wird ein Peroxidase-konjugiertes Lektin zugegeben, das an die exponierte Galaktose bindet. Der NA-hemmende Antikörpertiter wird...

Ein Assay zur Messung von Antikörpertitern zur Influenza-Neuraminidase-Hemmung

Unter Verwendung einer gedruckten Glykan-Microarray-Strategie wurde ein konventioneller 96-Well-Plattenassay für die Analyse der Hämagglutinin-Avidität und Spezifität des Influenza-A-Virus für Sialinsäure-haltige Rezeptoren miniaturisiert.

Ein miniaturisiertes Glycan Microarray-Test zur Beurteilung der Avidität und Spezifität von Influenza-A-Virus Hämagglutininarten

Wir beschreiben den Enzyme-linked Lectin Assay (ELLA) zur Messung von Influenza-Neuraminidase (NA)-Inhibitions-Antikörpertitern in Seren. Der Assay verwendet Erdnuss-Agglutinin, um Galaktose-Rückstände zu quantifizieren, die zugänglich werden, wenn NA Sialinsäure von Fetuin-beschichteten 96-Well-Platten entfernt.

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Die vorgestellten Protokolle wird beschrieben, wie einen Hämagglutination Inhibition Assay Quantifizierung des Influenza-spezifischen Antikörper-Titer von Serumproben von Grippe-Impfstoff Empfängern durchführen. Der erste Test bestimmt optimale virale Antigen-Konzentrationen durch Hämagglutination. Die zweite Probe quantifiziert Influenza-spezifischen Antikörper-Titer Hämagglutination Inhibition.

Eine optimierte Hämagglutination Inhibition (HI) Assay, Influenza-spezifischen Antikörper-Titer zu quantifizieren

Influenza A-Viren (IAVs) sind wichtige Humanpathogene Atemwege. Die Pathogenität von IAVs verstehen und neuartigen Impfstoff präklinischen Erprobung durchführen, sind Tiermodelle imitiert menschliche Physiologie erforderlich. Hier beschreiben wir Techniken zur Bewertung IAV Pathogenese, humorale Reaktionen und Wirksamkeit des Impfstoffes mit einem Maus-Modell der Infektion.

Influenza-A-Virus-Studien in einem Mausmodell der Infektion

Wir präsentieren ein Protokoll zur Verwendung eines Protein-Mikroarrays, das durch den Druck von Influenza-Antigenen auf nitrozellulosebeschichtete Dias konstruiert wurde, um gleichzeitig Serum für mehrere Antikörper-Isotypen gegen über 250 Antigene aus verschiedenen Virusstämmen zu sonden, Messung der Breite von Serumantikörpern über Virussubtypen hinweg.

Verwendung eines Influenza-Antigen-Mikroarrays zur Messung der Breite von Serum-Antikörpern über Virussubtypen hinweg

Dieses Papier beschreibt Protokolle zur Bewertung der Tfh- und GC-B-Antwort im Mausmodell einer Influenza-Virusinfektion.

Bewertung von T Follicular Helper Cells und Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

Lernen Sie eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza-Hämagglutinin-spezifische Antikörper. Dieses Protokoll ermöglicht die schnelle Analyse der Antikörper-vermittelten zellulären Zytotoxizität innerhalb von 24 Stunden.

Eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza Hämagglutinin spezifische Antikörper induziert (Video) | JoVE Journal

Eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza Hämagglutinin spezifische Antikörper induziert

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