Optimierung eines Assay Quantitative Mikroneutralisations

Das übergeordnete Ziel dieses Mikroneutralisationsassays ist es, alle Arten von aktuell zirkulierenden Influenzaviren und die Aktivität von Antikörpern und antiviralen Messungen quantitativ, hochdurchsatzfähig und hochempfindlich zu charakterisieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Virologie zu beantworten, wie z. B. die antigene Charakterisierung von Influenzaviren, die quantitative Neutralisation von Antikörpern und antivirale Aktivitäten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die gesamte infizierte Zellpopulation charakterisiert, einschließlich sichtbarer und unsichtbarer Plaques und Einzelzellinfektionen.

Der Mikroneutralisationsassay wird von Dr. Yipu Lin, stellvertretender Direktor des WHO-Kooperationszentrums für Influenza in London, vorgeführt. Die Biosicherheitsstufe (BSL) für das folgende Protokoll beträgt BSL 2 für saisonale Influenzaviren und BSL 3+ für potenzielle pandemische Influenzaviren. Zu Beginn aliquotieren Sie genügend Zellen in 96-Well-Platten.

Inkubieren Sie die Zellen zwei bis drei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2, um die Konfluenz zu erreichen. Sterilisieren Sie eine Multiwell-Plattenwaschmaschine mit 70 % Ethanol und verwenden Sie PBS oder VGM, um sie zu spülen. Verwenden Sie dann 200 Mikroliter Viruswachstumsmedium (VGM), um die konfluenten Zellen zu waschen.

Aspirieren Sie das VGM aus den Zellen und geben Sie sofort 50 Mikroliter VGM in jede Vertiefung. Geben Sie anschließend 900 Mikroliter VGM in jedes der sechs sterilen Röhrchen. Pipettieren Sie dann 100 Mikroliter Virus in das erste Röhrchen und mischen Sie es gut.

Bereiten Sie serielle Verdünnungen des Virus vor, beginnend mit dem ersten Röhrchen, und wechseln Sie die Spitzen zwischen jeder Verdünnung. Fügen Sie 50 Mikroliter jeder Virusverdünnung hinzu, beginnend mit der höchsten Verdünnung, um die Wells einer 96-Well-Platte zu duplizieren. Stellen Sie die Platte dann zwei bis drei Stunden lang auf 37 Grad Celsius, damit das Virus die Zellen infizieren kann.

Nachdem Sie das Overlay gemäß dem Textprotokoll vorbereitet haben, entfernen Sie das Inokulum aus den Vertiefungen. Geben Sie dann 200 Mikroliter Overlay in jede Vertiefung und inkubieren Sie über Nacht ungestört bei 37 Grad Celsius. Geben Sie 200 Mikroliter eiskaltes 4%PFA in PBS A in die Vertiefungen und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius oder 20 Minuten bei Raumtemperatur.

Nach der Inkubation aspirieren Sie das PFA und verwenden 200 Mikroliter PBS A pro Vertiefung, um die Platte zweimal zu waschen. Geben Sie 100 Mikroliter Permeabilisierungspuffer auf die Platte und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Teller dann mit PBS A zweimal.

Geben Sie anschließend 50 Mikroliter eines monoklonalen Maus-Antikörpers gegen Influenza Typ A pro Vertiefung in die Vertiefungen und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Schütteln. Verwenden Sie nach der Inkubation 300 Mikroliter Waschpuffer, um die Vertiefung dreimal zu waschen. Geben Sie dann 50 Mikroliter eines HRP-konjugierten Ziegen-Sekundärantikörpers zu den Proben und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Nachdem Sie die Vertiefungen wie zuvor dreimal gewaschen haben, fügen Sie 50 Mikroliter Substrat pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten oder bis die Entwicklung einer blauen Farbe deutlich sichtbar ist. Um die Reaktion zu stoppen, verwenden Sie 200 Mikroliter destilliertes Wasser, um die Brunnen zweimal zu waschen. Bewahren Sie die Platte nach dem Trocknen an der Luft an einem dunklen Ort auf.

Platzieren Sie eine Well-Platte im Scanbereich eines Flachbettscanners unter Verwendung der L-förmigen Positionsgrenze, um sicherzustellen, dass eine optimale und wiederholbare Bildgebungsposition erreicht werden kann. Scannen Sie die Platte mit den hier gezeigten Einstellungen. Führen Sie dann die Well-Plate-Reader-Software aus, um die erforderliche Viruskonzentration zu berechnen, indem Sie auf die Schaltfläche Bild laden klicken, um ein Bild zu laden.

Schieben Sie anschließend auf der Registerkarte "Globaler Schwellenwert" den roten Balken im Histogramm, um den Sampling-Schwellenwert anzupassen. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Aktualisieren, um die Auswirkungen auf ein Bild zu untersuchen. Aktivieren Sie nun das Kontrollkästchen Neutralisation/Titration berechnen.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Probenahme, um die infizierte Zellpopulation (ICP) zu quantifizieren. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern, um die Stichprobenergebnisse zu speichern. Um die Titrationsergebnisse zu erhalten, laden Sie die Well-Platten-Definitionskarte oder geben Sie sie ein.

In der Titration: Optimale Viruspopulation gibt den Schwellenwert an. Wählen Sie die Registerkarte Titrationsprozess, um die Titrationsergebnisse zu berechnen. Überprüfen Sie dann die Titrationsergebnisse, bevor Sie auf die Schaltfläche Speichern und Schließen klicken, um die Ergebnisse zu speichern.

Eine ausführlichere Anleitung zur Software finden Sie in der Ergänzung S1. Um die Virusneutralisation durchzuführen, bereiten Sie die Zellmonoschicht zwei bis drei Tage im Voraus vor. Geben Sie dann 50 Mikroliter VGM in jede Vertiefung der Platte.

Verwenden Sie die Spalten 11 und 12 für die Virus- bzw. Zellkontrolle. Geben Sie 50-Mikroliter-Aliquots einer Verdünnung von 1 zu 20 behandeltem Serum (RDE) in die erste Reihe der Spalten eins bis 10. Führen Sie zweifache serielle Verdünnungen durch, indem Sie 50 Mikroliter von Reihe A in Reihe H überführen und 50 Mikroliter aus Reihe H verwerfen. Geben Sie dann 50 Mikroliter Verdünnungsmittel in jede Vertiefung der Zellkontrollsäule

Geben Sie 50 Mikroliter des Virus in jede Vertiefung der Platte, mit Ausnahme der Zellkontrollsäule. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für zwei bis drei Stunden. Entfernen Sie dann das Inokulum und fügen Sie das Overlay zu jeder Vertiefung hinzu.

Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius ungestört. Fixieren und färben Sie dann die Platten, wie zuvor in diesem Video gezeigt. Um die Neutralisation zu quantifizieren, platzieren Sie eine Well-Platte im Scanbereich eines Flachbettscanners, wie weiter oben in diesem Video gezeigt.

Scannen Sie die Platte und führen Sie die Well-Platten-Reader-Software aus, um die erforderlichen Virustiter wie zuvor zu berechnen. Geben Sie nach dem Laden oder Eingeben der Well-Plattenkarte unter Neutralisation:Infektionsabzug den Schwellenwert an. Wählen Sie dann Neutralisationsprozess aus, um die Titer zu berechnen.

Überprüfen Sie abschließend die Titer und klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern und Schließen, um die Neutralisationsergebnisse zu speichern. Hier sind Titrationsergebnisse aus neueren antigenen Charakterisierungsexperimenten von acht Inputviren mit Verdünnungen zwischen 1,0 mal 10 zu minus eins und 1,0 mal 10 zu minus sechs. Die Grafik zeigt, dass die ICPs mit zunehmender Virusverdünnung abnehmen.

Die Kurven wurden gegen die ICPs der gleichen Viren normalisiert, die Infektionen in allen Zellen innerhalb einer Vertiefung hervorriefen. In dieser Tabelle sind die Virusverdünnungen aufgeführt, die 30 % der ICP-Sättigung erzeugten und die als Eingangsvirusverdünnung für die Neutralisation ausgewählt wurden. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse eines Neutralisationsexperiments mit einem Eingangsvirus gegen fünf Antiseren.

Die Grafik veranschaulicht den Infektionsprozess mit zunehmender Serumverdünnung. Die normalisierte positive Population auf der vertikalen Achse stellt das Verhältnis der ICPs aus der entsprechenden Antiserenantwort zum durchschnittlichen ICP des Referenzvirus dar. Schließlich wurden die Neutralisationstiter als Kehrwerte der Antiserumverdünnungen bestimmt, was einer 50%igen ICP-Reduktion entspricht.

Dieser Assay konzentriert sich auf Konsistenz, Geschwindigkeit und Nachweisempfindlichkeit, einschließlich quantifizierter Titration von Eingangsviren, Hochdurchsatz-Bildgebung und Datenverarbeitung. Es ist kostengünstig, benutzerfreundlich und wurde routinemäßig in viralen Antigenstudien eingesetzt.