Name: Kombinierte optogenetische und Gefrierbruch Replica Immunmarkierung Eingang spezifische Anordnung der Glutamate Receptors in der Maus Amygdala zu untersuchen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Lernen Sie die kombinierte optogenetische und Gefrierbruch-Replika-Immunmarkierung zur Analyse von Glutamatrezeptoren in der Maus-Amygdala. Diese Methode ermöglicht die korrelierte Untersuchung synaptischer Struktur und Funktion.

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Die Förderung erfolgte durch den FWF-Grant Nr. P-22969-B11 des österreichischen Wissenschaftsfonds an F. Ferraguti, durch die Gemeinnützige Hertie-Stiftung und das Werner Reichardt Zentrum für Integrative Neurowissenschaften sowie durch die DFG (CIN-Exc. 307) an I. Ehrlich.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie hat seit über 40 Jahren eine wichtige Technik in Ultrastrukturforschung gewesen. das Fehlen einer wirksamen Mittel jedoch die molekulare Zusammensetzung von Membranen zu studieren erzeugt einen deutlichen Rückgang in ihrer Nutzung. In jüngster Zeit hat es eine große Wiederbelebung in Gefrierbruch - Elektronenmikroskopie war aufgrund der Entwicklung wirksamer Weise zu integrale Membranproteine ​​durch Immunogoldmarkierung zeigen 1, 2, nämlich der FRIL - Technik. Die FRIL Technik besitzt mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden Immunogoldmarkierung ultra. Erstens sind Proteine ​​leicht zugänglich an Antikörper, die Empfindlichkeit zu erhöhen. Zweitens Exposition von großer Teil der Plasmamembran Spezialisierungen wie der postsynaptischen Membran, auf der zweidimensionalen Oberfläche des Replika ermöglicht die Inspektion der räumlichen Verteilung und physikalische Kontiguität der Moleküle von Interesse ohne aufwendige und zeitraubende Rekonstruktion serial ultradünne Schnitte. Drittens erhöht die Verfügbarkeit der beiden Hälften der Plasmamembran, die Anzahl von Proteinen, die für jede einzelne Struktur gekennzeichnet werden können, sofern geeignete Antikörper zur Verfügung stehen. Beim Brechen wird die hydrophobe Seite der geteilten Membran mit Kohlenstoff-Platin beschichtet, die verbleibenden Proteindomänen auf der gebrochenen Oberfläche verschanzt. Dies verhindert den Zugang von Antikörpern gegen Antigene in diesen Domänen. Zum Beispiel auf dem P-Gesicht einer Replik nur Epitope der plasmatischen Raum mit Blick kann nur durch Antikörper, während auf der E-Gesicht erkannt werden Epitope der exoplasmic Raum zugewandten kann durch Antikörper (siehe Abbildung 2) gebunden sein. Auf der anderen Seite leidet der FRIL - Technik auch gewisse Einschränkungen 2. Frakturen zufällig auftreten, könnte es schwierig sein, bestimmte Zellen oder Strukturen zu zielen. Dies kann auch zu einer Stichprobenverzerrung führen, beispielsweise in Synapse Sammlung, die unterschiedliche Wahrscheinlichkeit fra gegebenencturing entlang der Membran von Strukturen mit unterschiedlichen Krümmung (zB Stacheln gegen Wellen). Außerdem ist die Zuordnung von Membranproteinen zu einer der beiden Flächen nicht vorhersagbar. Daher sollte die Verteilung eines Proteins an das P-face oder E-face, insbesondere für quantitative Studien werden sorgfältig untersucht Antikörper reaktiv intrazellulären und extrazellulären Domänen verwenden. Schließlich kann die Identifizierung in der Nachbildung bestimmter Strukturen, wie präsynaptischen Axonterminalen, schwierig sein, wenn nur auf morphologischen Merkmalen basieren. die Verwendung spezifischer Antikörper für Proteine ​​Markers oder der Transduktion von markierten integrale Membranproteine ​​oder Kanäle unter Verwendung von viralen Vektoren zusätzliche Werkzeuge bietet Identifizierung der gebrochenen Membranen zu erleichtern jedoch. Zum Beispiel nahm diese Studie die Vorteile der Transduktion von ChR2-YFP in Thalamus Neuronen ihre axonalen efferents in der Amygdala oder der Etikettierung μ-Opioid-Rezeptoren zu identifizieren postsynaptischen mir zu offenbarenmbranes von ITC Neuronen. Um in Bezug auf Gewebefixierung durchführen sollte die FRIL Technik erfolgreich, besondere Sorgfalt getroffen werden. Starke Gewebefixierung (&gt; 2% Paraformaldehyd) kann in einer hohen Rate von Querbrüchen und einer Abnahme in Etikettierungs Empfindlichkeit führen. Auf der anderen Seite, schwach Fixierungen machen das Gewebe Handhabung und Zubereitung (zB Schneiden von Abschnitten) schwierig. Es ist auch wichtig zu steuern, dass die Dicke der getrimmten Blöcke entspricht der Dicke des doppelseitigen Klebebands. Wenn die Dicke der Probe niedriger ist als die des Bandes, die Oberfläche des Gewebes nicht an die Oberfläche der beiden Metallträger befestigen kann folglich die gefrorenen Probe wird nicht zerbrochen. Wenn das Gewebe dicker ist, wird es mit unvermeidbare strukturelle Verzerrungen zusammengedrückt werden, wenn das Sandwich aus den beiden Kupferträger hergestellt wird. Die Temperatur, bei der die Probe gebrochen wird (in diesem Protokoll -115 ° C) spielt auch eine wichtige Rolleauf die Struktur der Replik. Höhere Temperaturen können eine höhere Rate von Artefakten, wie beispielsweise die Kondensation von Wasserdampf auf der Oberfläche des Gewebes erzeugen, bevor oder während der Verdampfung. Niedrigere Temperaturen (&lt;-125 ° C) kann während des Fracturing-off von Material das Risiko der Spaltung erhöhen. Dieses Material kann auf die Oberfläche der Probe fallen oder ihm in Verbindung zu bleiben. Diese Flocken von Material sind auch beschichtet und Kontrast auf das Bild dunkle Flecken zu erzeugen. bei niedrigeren Temperaturen beeinflussen können Fracturing auch die Häufigkeit von Kreuzbrüchen vor allem für kleine feine Strukturen wie dendritischen Dornen. Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Herstellung der Repliken ist das Detergens-Verdauung. Wenn die Verdauung nicht vollständig ist, wird das unverdaute Gewebe als dunkle Flecken auf der Replik, an der TEM die Analyse der Struktur Verwechselung. Darüber hinaus kann die unverdauten Gewebe unspezifisch Falle oder binden Antikörper, die Erhöhung der Hintergrundmarkierung. Auf der anderen Seite ist die Verwendung von Detergenss für Gewebe Verdauung können die Moleküle zu denaturieren, um die Replik zugeordnet ihre Sekundär- und Tertiärstrukturen zu verändern. Daher ist für bestimmte Antigene kann es notwendig sein, um allmählich die Konzentration von SDS mit zusätzlichen Waschschritten verdünnt. Für Immunmarkierung ermöglicht die Verfügbarkeit der verschiedenen Größen von Goldteilchen an Sekundärantikörper konjugiert gleichzeitig zu erfassen, sondern nur qualitativ, multiple Proteine, auch in bestimmten Mikrodomänen der Plasmamembran, wie beispielsweise die postsynaptischen Spezialisierung. Jedoch aufgrund sterischer Hinderung, sind quantitative Studien zum Nachweis von nur einem Molekül begrenzt. Die Größe der Goldpartikel können auch die Markierungsausbeute beeinflussen. Für die Auslegung der Kennzeichnung in FRIL, sollte es im Auge behalten werden, dass die Immun Teilchen irgendwo innerhalb einer Halbkugel mit einem Radius von 20 bis 25 nm von der Antigen aufgrund der flexiblen komplexe Form angeordnet werden kanned durch die primären und sekundären Antikörper 26. Für weitere Informationen über die Theorie und Praxis der FRIL und verwandte Techniken, verweisen wir den Leser auch auf andere methodische Artikel 27, 28. Die FRIL Technik wurde für die hochauflösende quantitative Analysen von Glutamatrezeptorlokalisierung in verschiedenen Synapsenpopulationen 29, 30. Darüber hinaus kann die Erfassungsempfindlichkeit der FRIL Technik für die AMPA-Rs wurde geschätzt , so hoch wie ein Immunogold Teilchen pro eine funktionelle AMPA kürzlich verwendete -R Kanal 29. Somit ist dieser Ansatz insgesamt sehr nützlich, um die Muster der postsynaptischen Expression von AMPA-Rs und NMDA-Rs an zentralen Synapsen zu quantifizieren und zu analysieren. Hier haben wir gezeigt, seine Anwendbarkeit bei PIN / MGn-ITC Synapsen, eine Website, die meisten wahrscheinlich wichtig für die Weiterleitung US Informationen während der Angstkonditionierung. Verwendung von einem Antikörper gegen die extrazelluläre hochkonservierten Aminosäurereste des AMPA-Rezeptor-Untereinheiten GluA1-GluA4, fanden wir eine gleichmäßige Verteilung von Goldpartikeln in IMP Clustern postsynaptischen Membran Spezialisierungen entspricht. Die Dichte von AMPA-Rs in ITC Stacheln war signifikant höher im Vergleich zu Welle Synapsen gezielt durch PIN / MGn Thalamus Afferenzen. An beiden Wirbelsäule und Welle Synapsen, eine positive Korrelation zwischen Kennzeichnung für AMPA-Rs und postsynaptischen Bereich erkannt wurde, ein gemeinsames Merkmal andere glutamatergen Synapsen 25. Die geringe Abweichung in der Dichte von AMPA-Rs im PIN / MGn-ITC Synapsen zeigt eine homogene Verteilung ähnlich wie bei anderen Synapsen durch Thalamus efferents 7 ausgebildet, unterscheidet sich aber von kortikalen Synapsen 25. Im Gegensatz dazu war die Dichte des NMDA-Rs variabler und nicht zwischen Wirbelsäule und Welle Synapsen was darauf hindeutet, eine andere Regelung als AMPA-Rs unterscheiden. In der Zukunft wird nicht nur die hohe Reproduzierbarkeit der FRIL-Technik ermöglichen die basale molekulare Zusammensetzung von zentralen Synapsen zu beurteilen, sondern kann Erkennung von c erleichternHanges in ionotropen Glutamat - Rezeptor - Zahlen und subsynaptischen Verteilung nach Angst Lernen ergänzt ex-vivo - Aufnahmen von prä- und postsynaptischen Eigenschaften dieser Eingänge. Abschließend könnte dieser Ansatz von anderen Forschern verwendet werden, um Einblicke in Struktur-Funktionsbeziehungen von Eingangsspezifischen Synapsen in vielen anderen neuronalen Schaltungen, bei denen die Herkunft der Eingänge zu entwirren und die Art und Zusammensetzung der postsynaptischen Elemente von entscheidender Bedeutung ist aber problematisch .

Die Definition der funktionalen Architektur von Biomembranen in Nanometer-Bereich ist in den letzten Jahren durch die Entwicklung einer Anzahl von Techniken, Immunmarkierung geeignet für die Transmissionselektronenmikroskopie in Frage gestellt. Allerdings sind diese Techniken, beispielsweise vor und nach dem Einbetten Immunogold, haben eine Reihe von wichtigen Beschränkungen, die eine schlechte Erkennung von Antigenen und / oder begrenzte quantitative Beurteilung der membrangebundene Proteine ​​umfassen. Diese Einschränkungen werden besonders kritisch bei der Untersuchung der Feinstruktur des Nervensystems, die durch einen hohen Grad an Zell Vielfalt und Synapse Heterogenität gekennzeichnet ist. Diese Heterogenität resultiert sowohl aus strukturellen und funktionellen Vielfalt diktiert durch die prä- und postsynaptischen Elemente und durch die differentielle Expression, Anreicherung oder Interaktion von Signalproteinen, wie Rezeptoren, Transporteure und Effektormoleküle. Ein neuer Ansatz für die direkte immunolabeling von integralen oder vernetzten Membranproteinen in Detergens-solubilisierten Gefrierbruch - Replikate (FRIL) wurde ursprünglich vor 1 von Fujimoto zwei Jahrzehnten eingeführt. Diese ursprüngliche Verfahren hatte jedoch mehrere Einschränkungen, dh starke Fragmentierung von Repliken, die mit individuell zugeordneten Zellen in komplexen Geweben sinnvolle Korrelationen von markierten Molekülen behindert wie das Gehirn. Vor ungefähr 10 Jahren, Shigemoto und Fukazawa verbessert schrittweise die Technik 2. Dies wurde an den Boulder Laboratorien der Colorado State University durch die Bemühungen von einer anderen Gruppe von Wissenschaftlern parallel, der auch deutlich die Technik verbessert, insbesondere für die Untersuchung von gap junctions 3. Die Verbesserung der Gefrier-Fracturing-Protokolle und Maschinen, sowie die Einführung von Schnellgefrieren (unter hohem Druck), erlaubt es nun Ermittler ungebrochene Repliken von Exemplaren der relativ großen Größe zu erzeugen, und hallogh hochwertige Bilder der meisten zellulären Komponenten ohne die Einschränkungen und Artefakte, die durch starke chemische Fixierungen hergestellt. Die FRIL Technik bietet den großen Vorteil einer sehr quantitative in - situ - Identifizierung von einem oder mehreren Proteinen (gleichzeitig) in histologisch kartiert und zytologisch identifizierten Zellen in komplexen Geweben, wie dem Gehirn, mit dem zusätzlichen Vorteil einer Draufsicht auf prä- und postsynaptischen Elemente in einem einzigen Replik. Daher ist der FRIL-Technik trotz seiner vielen technischen Hürden, hält das Versprechen für eine Reihe von sehr bedeutenden wissenschaftlichen Durchbruch, insbesondere zur Korrelation der strukturellen und funktionellen Eigenschaften der einzelnen Synapsen. Während der letzten Jahrzehnte hat sich eine große Menge an Informationen wurden auf die Struktur erhalten, molekularen Aufbau und physiologische Funktion von Synapsen; noch Synapsen sind morphologisch und molekular sehr unterschiedlich in Abhängigkeit von der Vor- und postsynaptischen pamieten Neuronen 4. Nur für eine Handvoll Synapse Typen waren Struktur-Funktions - Studien bisher 5-7 erreicht. Dies war vor allem auf technische Zwänge, die eine genaue Identifizierung der Art der prä-und postsynaptischen Elemente verhindert. Ultrastrukturelle Analyse über verschiedene synaptische Kontakte sowohl in Bezug auf die synaptische Größe und Inhalt in Neurotransmitterrezeptoren 6, kritische Einblicke in die Variabilität der postsynaptischen Membran Spezialisierungen vorgesehen , die einen großen Einfluss auf die Festigkeit und Plastizität der synaptischen Transmission aufweist. Weiterhin gibt eine große Anzahl von Studien , dass die Anzahl von ionotropen Glutamat - Rezeptoren auf verschiedenen Arten von Synapse ausgedrückt in einem afferent- und zielabhängig 7-10 reguliert wird. Hier wird ein Verfahren erläutert, dass die Analyse der Struktur und der Rezeptor Zusammensetzung der postsynaptischen Membran Spezialisierungen ermöglicht mit definierend präsynaptischen Elemente und Funktion. Dieser Ansatz nutzt den Vorteil der präsynaptischen Expression kürzlich lichtempfindlichen Algenproteine, wie Channelrhodopsin2 (ChR2), entwickelt, und der FRIL-Technik das Muster der postsynaptischen Expression von α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic zu analysieren Säure (AMPA-Rs) und N-Methyl-D-Aspartat (NMDA-Rs) Glutamatrezeptoren. Dies wird an den Synapsen nachgewiesen durch Axone gebildet Ursprung aus den hinteren Thalamus medialen geniculate Kerne (PIN / MGn) auf Neuronen der Einlagerungen Zellmassen der Amygdala (ITC). ITC Neuronen sind kleine GABAergen Zellen stachelig in Cluster 11 rund um die basolaterale Amygdala - Komplex (BLA) organisiert, 12. ITC Neuronen sind dafür bekannt, exzitatorischen Eingänge von BLA Haupt Neuronen empfangen und den zentralen Kern (CEA) zu zielen, also als hemmender Gate funktioniert für den Informationsfluss zwischen dem BLA und CeA 12-15. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass ITC Neuronen befindet sich in der medio-dorsale Cluster zwischen BLA und CeA erhalten auch direkte und konvergente erregenden Eingänge von sensorischen Thalamus und zeitlichen kortikalen Regionen, die so modifiziert sind auf Angst während Pavlovian auditorischen Angstkonditionierung 16 zu lernen. Angst Anlage ist eine der am besten verstanden, Formen des assoziativen Lernens in Bezug auf die Mechanismen des Gehirns. In Angstkonditionierung, einem zunächst neutral konditionierten Reiz (CS, zum Beispiel ein Ton) mit einem aversiven unkonditionierten Stimulus (US, zum Beispiel ein mildes Fuß - Schock) , was zu einem CS-US - Verband gepaart und Angstreaktion 17 konditioniert, 18. Erregende Eingänge von beiden Thalamus und Neokortex Bereiche, die Information , die die CS und US tragen, wurden jeweils bekannt auf pyramidalen Neuronen des lateralen Kern der Amygdala (LA) zu konvergieren und 19 Plastizität zu unterziehen. Unsere früheren Arbeiten zeigten, dass sensorische Informationen auch an ITC Neuronen weitergegeben parallel ist <sbis&gt; 16. Als ein erster Schritt zu einer mechanistischen molekulare Analyse der einzelnen sensorischen Input auf ITC Neuronen Synapsen, verwendeten wir ein Adeno-assoziierten Virus (AAV) ChR2 mit dem gelben fluoreszierenden Protein (YFP) markiert auszudrücken. Die AAV wurde in die PIN / MGn injiziert und die Axonterminalen wurden durch ihre Expression von ChR2-YFP identifiziert. Wir haben beide von der FRIL-Technik erzeugt Flächen, die die Dichte der postsynaptischen AMPA-Rs und NMDA-Rs an Synapsen mit ITC Neuronen, die durch PIN / MGn Axonterminalen gebildet zu beurteilen.

<table><tbody><tr><td>Surgery</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktischer Rahmen</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>kann durch einen anderen stereotaktischen Rahmen für Mäuse ersetzt</td></tr> werden <tr><td>Stereotaktischer Rahmen Mausadapter</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Gasanästhesiemaske für Mäuse</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>nicht mehr lieferbar, ersetzt durch Art.-Nr. 51609M</td></tr><tr><td>Druckinjektionsgerät, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, USA</td><td>T25-2-900</td><td>andere Druckinjektionsgeräte (z.B. Picospritzer) können verwendet werden</td></tr><tr><td>Kwik Fill Glaskapillaren</td><td>World Precision Instruments, Deutschland</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Anästhesiegerät, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Deutschland</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>DC Temperaturregler und Heizkissen</td><td>FHC, USA</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Horizontaler Mikropipettenabzieher Modell P-1000</td><td>Sutter Instruments, USA</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sterilisator für chirurgische Werkzeuge, Sterilisator 75</td><td>Melag, Deutschland</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (Serotyp 2/9)</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>schnell grün</td><td>Roth, Deutschland</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran-Anästhetikum, Isofuran CP (1 ml/ml)</td><td>CP Pharma, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiseptikum, Betadin (Providon-Jod)</td><td>Purdure Products, USA</td><td>BSOL32</td><td>kann durch andere Desinfektionsmittel ersetzt</td></tr><tr><td>werden Analgetikum, Metacam Lösung (5 mg/ml Meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim, Deutschland</td><td></td><td>kann durch andere Analgetika ersetzt werden</td></tr><tr><td>Bepanthen Augensalbe</td><td>Bayer, Deutschland</td><td>0191</td><td>kann durch andere Augensalben ersetzt werden</td></tr><tr><td>Bohrer NM3000 (SNKG1341 und SNIH1681)</td><td>Nouvag, Schweiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Nahtnadel</td><td>Fine Science Tools, Deutschland</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Geflochtene Seidennaht</td><td>Fine Science Tools, Deutschland</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td><>Unternehmen<</td><td>strong>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Gewebepräparat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd EM grade</td><td>Agar Scientific Ltd., Vereinigtes Königreich</td><td>AGR1018</td><td></td></tr><tr><td>Gesättigte Pikrinsäurelösung</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P6744-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H20</td><td>Merck Millipore, Deutschland</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4-2H2O&nbsp;</td><td>Merck Millipore, Deutschland</td><td>1063451000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore, Deutschland</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>4N NaOH</td><td>Carl Roth, Deutschland</td><td>T198.1</td><td></td></tr><tr><td>Thiopental</td><td>Sandoz, Österreich</td><td>5.133</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>GenPure Reinstwassersystem</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td></td>50131235</tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>ISMATEC, Deutschland</td><td>ISM 930C</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>MACHEREY-NAGEL, Deutschland</td><td>MN 615 1/4</td><td></td></tr><tr><td>Vibroslicer, VT1000S</td><td>Leica Microsystems, Österreich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic</td><td>Skalpell Alcon Laboratories, USA</td><td></td><td>kann durch andere Ophthalmic Skalpelle ersetzt werden</td></tr><tr><td>Perfusionskanüle</td><td>Vieweg, Deutschland</td><td>F560088-1</td><td>kann durch ähnliche Artikel anderer Firmen ersetzt werden</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td>strong<td><>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>High-pressure&nbsp; Gefrieren</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kupfer Träger</td><td>Ingenieurbüro M. Wohlwend, CH</td><td>528</td><td></td></tr><tr><td>Sidol Polish</td><td>Henkel, Deutschland</td><td></td><td>kann durch gleichen Artikel anderer Firmen ersetzt werden</td></tr><tr><td>Sämischleder</td><td>Haushaltsfachhandel Locher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5mm</td><td>Stubai, Österreich</td><td></td><td>kann durch gleichen Artikel anderer Hersteller ersetzt</td> werden</tr><tr><td>Denaturiertes Ethanol</td><td>Donauchem, Österreich</td><td></td><td>kann durch gleichen Artikel anderer Hersteller ersetzt</td></tr><tr><td>werden Aceton</td><td>Roth, Deutschland</td><td>9372.5</td><td>ACHTUNG!</td></tr><tr><td>Hochdruck-Gefriermaschine HPM 010</td><td>BalTec, CH; jetzt Leica Microsystems</td><td>HPM010</td><td>nicht mehr produziert, ersetzt durch LeicaEM HPM100</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olympus, Japan</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff</td><td></td><td></td><td>ACHTUNG!</td></tr><tr><td>Kryo-Fläschchen</td><td>Roth, Deutschland</td><td>E309.1</td><td>können durch denselben Artikel anderer Hersteller ersetzt</td></tr><tr><td>werden CryoCane</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5015-0001</td><td>kann durch denselben Artikel anderer Hersteller ersetzt</td></tr><tr><td>werden CryoSleeve</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5016-0001</td><td>kann durch denselben Artikel anderer Hersteller ersetzt werden</td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff-Lagerbehälter</td><td>Cryopal, Frankreich</td><td>GT38</td><td>kann durch den gleichen Artikel anderer Hersteller ersetzt werden</td></tr><tr><td>Nichtionisches Reinigungsmittel (Lavocid)</td><td>Werner & Mertz Professional, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td><>Unternehmen</td><td><>Katalognummer</td><td>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Gefrierbruch und Replikation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sandstrahler, Mikromat 200-1</td><td>JOKE Joisten & Kettenbaum, Deutschland</td><td>SANDURET 2-K</td><td>kann durch den gleichen Artikel anderer Hersteller ersetzt werden</td></tr><tr><td>Siliziumcarbid SIC 360, Körnung 25 - 21&micro;</td><td>JOKE Joisten & Kettenbaum, Deutschland</td><td>955932</td><td></td></tr><tr><td>Freeze Fracture System BAF 060</td><td>BalTec, CH; jetzt Leica Microsystems</td><td>BAF060</td><td></td></tr><tr><td>Keramik 12 Well-Platte</td><td>Gr&ouml; pel, Österreich</td><td>14511</td><td>kann durch denselben Artikel anderer Firmen ersetzt</td></tr> werden <tr><td>Trizma base</td><td>SIGMA, USA</td><td>T1503</td><td>kann durch denselben Artikel anderer Firmen ersetzt</td></tr> werden <tr><td>Trizma hydrochlorid</td><td>SIGMA, USA</td><td>T3253</td><td>kann durch denselben Artikel anderer Firmen ersetzt</td></tr> werden <tr><td>Natriumchlorid</td><td>Merck, Deutschland</td><td>1.064.041.000</td><td>kann durch denselben Artikel anderer Firmen</td></tr> <tr><td>ersetzt werdenSDS, Natriumlaurylsulfat</td><td>Roth, Deutschland</td><td>5136.1</td><td>VORSICHT! ; &nbsp; Kann durch denselben Artikel anderer Hersteller ersetzt werden</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Merck, Deutschland</td><td>1.076.871.000</td><td>Kann durch denselben Artikel anderer Hersteller ersetzt</td></tr><tr><td>werden TRIS</td><td>Roth, Deutschland</td><td>5429.3</td><td>Kann durch denselben Artikel anderer Hersteller ersetzt</td></tr><tr><td>werden Universal Hybridization Oven</td><td>Binder, Germany</td><td>7001-0050</td><td>kann durch denselben Artikel anderer Hersteller ersetzt</td></tr> werden<tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Immunolabelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA, USA</td><td>A9647</td><td>kann ersetzt werden durch denselben Artikel von anderen Firmen</td></tr><tr><td>Anti-GFP Antikörper</td><td>Molekulare Sonden, USA</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pan-AMPAR Antikörper</td><td>Frontier Institute, Japan</td><td>pan AMPAR-GP-Af580-1</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NMDAR1 Antikörper, Klon 54.1</td><td>Merck Millipore, Deutschland</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>Opioidrezeptor-Mu (MOR) Antikörper</td><td>ImmunoStar, USA</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>EM Anti-Meerschweinchen für Ziege, 5 nm; Sekundärantikörper</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM. GAG5</td><td></td></tr><tr><td>EM Anti-Kaninchen für Ziegen, 15 nm; Sekundärantikörper</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM. GAR15</td><td></td></tr><tr><td>Esel-Anti-Kaninchen, 10 nm, Sekundärantikörper</td><td>AURION, Niederlande</td><td>DAR 10 nm</td><td></td></tr><tr><td>Kupfergitter, 100 parallele Stangen</td><td> Agar scientific, UK</td><td>G2012C</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Major Science, USA</td><td>MO-RC</td><td>kann durch denselben Artikel von anderen Unternehmen ersetzt werden</td></tr><tr><td>Pioloform Pulver</td><td>&nbsp; Agar scientific, UK</td><td>R1275</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Roth, Deutschland</td><td>3313.1</td><td>VORSICHT! ; &nbsp; kann durch denselben Artikel anderer Firmen ersetzt werden</td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>><>Unternehmen</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>EM Analyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM120 TEM</td><td>Philips/FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Morada CCD-Kamera</td><td>Soft Imaging Systems, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTEM Ver. 5.2, Bildgebungssoftware</td><td>Soft Imaging Systems, Deutschland</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kombinierte optogenetische und gefrierbruch replica immunmarkierung eingang spezifische anordnung der glutamate receptors in der maus amygdala zu untersuchen

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie hat seit über 40 Jahren eine wichtige Technik in Ultrastrukturforschung gewesen. das Fehlen einer wirksamen Mittel jedoch die molekulare Zusammensetzung von Membranen zu studieren erzeugt einen deutlichen Rückgang in ihrer Nutzung. Kürzlich hat es die Entwicklung wirksamer Weise eine große Wiederbelebung in Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie durch gewesen integrale Membranproteine ​​durch Immunogoldmarkierung offenbaren. Eines dieser Verfahren wird als Detergens-solubilisierten Gefrierbruch-Replica Immunmarkierung (FRIL) bekannt. Die Kombination der FRIL-Technik mit Optogenetik ermöglicht eine korrelierte Analyse der strukturellen und funktionellen Eigenschaften der zentralen Synapsen. Mit diesem Ansatz ist es möglich, sowohl prä- und postsynaptischen Neuronen, die durch ihre jeweiligen Expression eines markierten Kanalrhodopsin und spezifische molekulare Marker zu identifizieren und zu charakterisieren. Das unverwechselbare Erscheinungsbild der postsynaptischen Membran Spezialisierung der glutamaterge Synapsen ermöglicht es ferner, auf die Kennzeichnung von ionotropen Glutamatrezeptoren, zu quantifizieren und die intrasynaptischen Verteilung dieser Rezeptoren zu analysieren. Hier geben wir einen Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Verfahren erforderlich paired Repliken vorzubereiten und wie sie zu immunolabel. Wir werden auch die Einschränkungen und Einschränkungen der FRIL Technik diskutieren, insbesondere solche mit Vorspannungen Potential Abtastung zugeordnet ist. Die hohe Reproduzierbarkeit und Vielseitigkeit der FRIL-Technik, wenn sie mit Optogenetik kombiniert wird, bietet einen sehr leistungsfähigen Ansatz zur Charakterisierung der verschiedenen Aspekte der synaptischen Transmission bei identifiziert neuronaler Schaltkreise im Gehirn. Hier haben wir ein Beispiel geben, wie dieser Ansatz wurde verwendet, Einblicke in Struktur-Funktionsbeziehungen von exzitatorischen Synapsen an Neuronen der interkalierten Zellmassen der Maus Amygdala zu gewinnen. Insbesondere haben wir die Expression von ionotropen Glutamatrezeptoren an identifizierten Eingaben untersucht oderiginated vom Thalamus hinteren intralaminären und medialen geniculate Kerne. Diese Synapsen wurde gezeigt, dass sensorische Informationen, die für Angst Lernen Relais und plastischen Veränderungen auf Angstkonditionierung zu unterziehen.

Die FRIL Technik, wenn mit der Expression von optogenetische Aktoren mikrobiellen Ursprungs 21 kombiniert, das heißt, die Kanäle in der Plasmamembran integriert und wirksam anterograd entlang Axone transportiert, ermöglicht bei einer definierten Untergruppe quantitativ die postsynaptischen Expression von AMPA-Rs und NMDA-Rs zu prüfen , von Synapsen. Dies wird hier für Axone gezeigt aus verschiedenen Thalamuskernen Ursprung (zB PIN / MGn) auf ITC Neuronen in der Amygdala. Dieser Ansatz ermöglicht eine molekulare Analyse der einzelnen Sinnes Synapsen auf ITC Neuronen, einer Gruppe von Zellen, die bisher auf eine detaillierte anatomische und molekulare Charakterisierung refraktären waren. Vier Wochen nach der stereotaktische Injektion des rAAV-ChR2-YFP in die PIN / MGN ChR2-YFP-positive Axone dicht auf den LA innervated, die amygdalostriatal Übergangsbereich (Astria) und die mediale paracapsular I<html> TC - Cluster in der Amygdala, ein Muster vollständig im Einklang mit früheren Studien Tracing 16, 22. Wir haben auch intensiv Gold Immunmarkierung für die ChR2-YFP auf dem P-Gesicht von Axonen und Terminals in Gefrierbruch - Replik von rAAV-ChR2-YFP- erkannt injizierten Mäusen (5A), nicht aber in Nachbildungen von nicht-injizierten Mäusen. Der postsynaptischen Membran Spezialisierung der glutamatergen Synapsen in einem Replikat kann 7 durch die P-Fläche seines präsynaptischen Plasmamembran als ein Cluster von intramembranären Teilchen (IMPs) auf der E-Fläche der Plasmamembran 2, 23, und wird oft begleitet beachten (5B-C). Erlaubt diese Funktionen , um die postsynaptische Spezialisierung der glutamatergen Synapsen durch PIN / MGn Axonterminalen (Abbildung 5 und 6) gebildet , zu identifizieren. Wir markierten AMPA-Rs mit einem Antikörper, der alle vier Untereinheiten (GluA1-4) erkennt, während NMDA-Rs einen Antikörper gegen die essentiellen NR1-Untereinheit detektiert wurden. ntent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Wegen des Mangels an Werkzeugen auf dem gleichen Replik zu erkennen, ob diese Synapsen mit dendritischen Dornen oder Wellen von ITC Neuronen wurden, gekennzeichnet wir die entsprechende Replik Gesicht für μ -Opioid - Rezeptoren, wie ITC Neuronen exprimieren postsynaptisch hohe Niveaus dieser Rezeptoren 24. Dies erforderte die Identifizierung der gleichen postsynaptischen Profile in den beiden Replikaten (5C-F und 6A-D) eine Strategie verwendet , die Landmarken (4E) beschäftigt . <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig5.jpg" /> Abbildung 5. Der Nachweis von ChR2-YFP und Ionotropic Glutamate Receptors auf Replikat von Immunogold Partikel. (A) Ein Quer gebrochen Axonterminal (hellblau) und kleine Teile seiner P-Gesicht , markiert mit 15 nm Goldpartikeln Nachweis ChR2-YFP. Innerhalb des Terminals, wobei die Membran of zahlreiche synaptische Vesikel (sv) beobachtet werden. Notieren Sie sich die Spezifität der Immunmarkierung zu einem großen Teil an der Plasmamembran beschränkt. Kennzeichnung für ChR2 identifiziert das Terminal als von der PIN / MGn. Das Terminal bildet eine asymmetrische Synapse mit einer Wirbelsäule. Der postsynaptischen Membran Spezialisierung (PSD) an der E-Fläche zeigt eine charakteristische Gruppe von intramembranären Teilchen und mit 5 nm Goldpartikel offenbaren AMPA-Rs bezeichnet. (B) Die P-Gesicht eines ChR2-exprimierenden Axon (beschriftet mit 15 nm Goldpartikel) ist an der Grenze gezeigt zwei Dendriten, einer von ihnen besitzen zwei mit 5 nm Goldpartikeln markiert PSDs enthüllt NMDA-Rs. (CD) gegenüberliegenden Flächen der prä- und postsynaptischen Membranen eines PIN / MGn-ITC Synapse. (C) Das P-Gesicht des Terminals drückt ChR2 (beschriftet mit 15 nm Goldpartikel) und erstreckt sich über die E-Gesicht von zwei dendritischen Wellen, einer von ihnen mit zwei PSDs markiert für AMPA-Rs (5 nm Goldpartikel). ( <strong&gt; D) für μ-Opioid - Rezeptoren (10 nm Goldpartikel) Die entsprechende P-Fläche der beiden Dendriten bezeichnet. (EF) vergrößerte Ansichten der Flächen durch die gestrichelte Linie dargestellt. Maßstabsbalken:. 500 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Immunoparticles für AMPA-Rs in den PIN / MGn-ITC Synapsen waren über die IMP Cluster gefunden, um eine homogene Verteilung innerhalb der postsynaptischen Spezialisierung (5E) hindeutet. A signifikant höher (ungepaarter t-Test p &lt;0,018) Dichte von AMPA-R Markierung wurde in PIN / MGn beobachtet Synapsen auf ITC Stacheln (715 ± 38 Goldteilchen / &amp; mgr; m 2, n = 32) im Vergleich zu Synapsen auf ITC Dendriten (590 ± 44 Goldteilchen / &amp; mgr; m 2, n = 32). Insgesamt zeigten sich die Dichte von AMPA-Rs im PIN / MGn-ITC Synapsen eine relativ niedrigeVarianz (Variationskoeffizient CV = 0,37), die mit einer homogenen Verteilung. Immunoparticles für NMDA-Rs in den PIN / MGn-ITC Synapsen häufig ungleichmäßig innerhalb postsynaptischen IMP Cluster (5B) verteilt beobachtet wurden. Die Dichte des NMDA-R Markierung war ähnlich (ungepaarter t-Test p = 0,39) zwischen PIN / MGn Synapsen auf ITC Stacheln (1070 ± 153 Goldteilchen / &amp; mgr; m 2, n = 8) und ITC Dendriten (812 ± 183 Goldteilchen / &amp; mgr; m 2, n = 9). Anders als für die AMPA-Rs beobachtet wurde, wurde die Dichte des NMDA-Rs in PIN / MGn-ITC Synapsen sehr variabel (CV = 0,54). <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig6.jpg" /> Abbildung 6. AMPA-Rs und NMDA-Rs Immunmarkierung bei Identifizierte PIN / MGn-ITC - Synapse. (AB) gegenüberliegende Flächen der prä- und postsynaptischen Membranen eines PIN / MGn-ITCSynapse machte auf einen dendritischen Dorn in dem die P-Seite des Klemmen ChR2 drückt (mit 15 nm Goldpartikel markiert) und die PSD auf eine dendritische Wirbelsäule für AMPA-Rs (5 nm Goldpartikel) markiert. (CD) vergrößerte Ansichten der Bereiche durch die gestrichelte Linie dargestellt. Diese Bereiche wurden etwa 45 ° gegen den Uhrzeigersinn zu ermöglichen, eine bessere Sicht auf die PSD gedreht. (E) Scatterplots der Anzahl von AMPA-R - Partikel im Vergleich zu synaptischen Bereich in ITC Stacheln und Dendriten. In beiden Strukturen ist eine positive Korrelation beobachtet. (F) Scatterplots der Anzahl von NMDA-R Partikel gegen synaptischen Bereich in ITC Stacheln und Dendriten. Eine signifikante positive Korrelation wurde nur in dendritischen Dornen detektiert. Maßstabsbalken:. 500 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> weildie P-Fläche der präsynaptischen Plasmamembran oft teilweise die postsynaptischen IMP Cluster überlagert, wir den synaptischen Bereich von nur 30% der Synapsen schätzen konnte (Stacheln: mittlere Bereich 0,032 &amp; mgr; m 2, Bereich: 0,007 bis 0,063 &amp; mgr; m 2, n = 8; Dendriten: 0,047 &amp; mgr; m 2, Bereich: 0,024 bis 0,166 &amp; mgr; m 2, n = 11). Diese waren in einem ähnlichen Bereich wie zuvor analysiert telencephalic glutamatergen Synapsen 25. In beiden Stacheln und Dendriten, wurde die Zahl der Gold immunoparticles für AMPA-Rs in einzelnen Synapsen positiv mit dem synaptischen Bereich korreliert (Spearman, Stacheln: r = 0,88, Dendriten: r = 0,60, p &lt;0,0001) (6E). Umgekehrt wurde die Zahl der Gold immunoparticles für NMDA-Rs Bezeichnungen mit den synaptischen Bereich in Stacheln (Spearman, Stacheln: r = 0,90, p &lt;0,002) zu korrelieren , aber nicht in Dendriten (r = 0,21, p = 0,29) (Figur 6F ).

Dieser Artikel zeigt, wie die Expression von Neurotransmitterrezeptoren quantifiziert und das Muster an Synapsen mit identifizierten prä- und postsynaptischen Elementen analysiert werden kann, indem eine Kombination aus viraler Transduktion optogenetischer Werkzeuge und der Freeze-Fracture-Replica-Immunmarkierungstechnik verwendet wird.

Kombinierte optogenetische und Gefrierbruch Replica Immunmarkierung Eingang spezifische Anordnung der Glutamate Receptors in der Maus Amygdala zu untersuchen

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Das Ziel dieses Verfahrens, das Optogenetik mit der Immunmarkierung von Freeze-Fracture-Replicas kombiniert, besteht darin, die Dichte ionotroper Glutamatrezeptoren an Synapsen im Amygdala des Mäuses mit identifizierten prä- und postsynaptischen Elementen zu analysieren. Die hohe Reproduzierbarkeit und Vielseitigkeit der Freeze-Fracture-Replica-Immunmarkierungstechnik bietet in Kombination mit der Optogenetik einen äußerst leistungsfähigen Ansatz für die korrelative Analyse der strukturellen und funktionellen Eigenschaften von Synapsen. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens sind: die ebene Ansicht der prä- und postsynaptischen Elemente sowie die quantitative Analyse von Proteinen in diesen spezialisierten Mikrodomänen.Verschiedene Techniken können an eine Vielzahl unterschiedlicher Gewebe angepasst werden, um die Verteilung und Organisation integraler Membranproteine zu untersuchen. Im Allgemeinen ist dieser kombinierte optogenetische FRIL-Ansatz für Anfänger herausfordernd, da eine große Bandbreite unterschiedlicher Geräte und Maschinen erforderlich ist. Der Beginn der Modulation mit einer anderen Methode ist entscheidend, da einige weitere Schritte schwer zu erlernen sind.Zum Beispiel das Brechen und Replizieren gefrorener Proben. Um dieses Verfahren zu beginnen, kleben Sie einen koronalen Block des Maushirns auf den Halter des Vibroschneidegeräts. Richten Sie den Gewebestück so aus, dass der Neokortex zur vibrierenden Klinge zeigt. Schneiden Sie anschließend koronale Schnitte, die die Amygdala enthalten, mit einer Dicke von 140 Mikrometern in eiskaltem, 0,1-molarem PB und sammeln Sie sie in einer 6-Well-Platte in demselben Puffer.Unter einem Stereomikroskop schneiden Sie den Bereich von Interesse aus den Schnitten in einer mit Silikonelastomer beschichteten Petrischale, die mit 0,1 M PB gefüllt ist. Überführen Sie dann den präparierten Block in die Kryoschutzlösung und lagern Sie ihn über Nacht bei 6 °C. In diesem Schritt bereiten Sie die Kupfereinsätze für die nachfolgenden Schritte des FRIL-Verfahrens vor, indem Sie diese mit einem Lederlappen als Politurmittel polieren. Befestigen Sie unter dem Mikroskop einen Ring aus doppelseitigem Klebeband am Kupfereinsatz, der als Haltevertiefung für den präparierten Block dient.Danach den zugeschnittenen Block mit einer Platindrathake in das Loch des doppelseitigen Klebebands legen. Überschüssige Kryoschutzlösung mit Filterpapier oder einem Pinsel entfernen. Anschließend die Haltevorrichtung mit einer weiteren Vorrichtung abdecken.So dass der Gewebeklotz zwischen den beiden Trägern eingeschlossen ist. Um die Probe einzufrieren, setzen Sie das Träger-Sandwich in die Probennadel ein. Anschließend wird die Probennadel in die Hochdruckgefriervorrichtung eingesetzt.Starten Sie den Einfrierzyklus durch Drücken der Jet-Auto-Taste, nehmen Sie den Probenträger sofort heraus und tauchen Sie die Spitze in eine isolierte Box mit flüssigem Stickstoff. Entfernen Sie dann vorsichtig das Träger-Sandwich vom Probenträger und legen Sie es in ein vorab gekühltes Kryoröhrchen. Bewahren Sie die Kryoröhrchen mit den Trägern bis zur Replikation in einem Kryotank auf.Bevor Sie die Elektronenstrahlkanone einsetzen, entfernen Sie den Schild mit der Ablenkplatte. Setzen Sie die Einstelllehre zur Zentrierung des Glühfadens durch die untere Kathodenabdeckung in die Klemmspindel ein. Danach schieben Sie den neuen Glühfaden über die Lehre, bis die Drucklamellen die Enden des Glühfadens festklemmen.Entfernen Sie dann die Einstelllehre und setzen Sie die Kohlenstoffstange ein. Befestigen Sie diese, indem Sie die Klemmschraube der Verdampferstangenhalterung festziehen, und stellen Sie sicher, dass sich die Endhöhe der Stange in der Mitte der zweiten Spule von unten befindet.Danach ersetzen Sie die Ablenkplatte und setzen die Elektronenstrahlpistole in die Gefrierriss-Einheit ein. Stellen Sie in diesem Verfahren den Strom und die Spannung für die Verdampfung ein. Anschließend setzen Sie das gefrorene Trägersandwich in den Doppelreplikattisch unter flüssigem Stickstoff ein.Überführen Sie anschließend die Doppelreplikatabelle in das Dewargefäß und befestigen Sie sie unter einem Winkel von 45 Grad am Probenträgeraufnehmer. Heben Sie die Doppelreplikatabelle mit einem Tischmanipulator auf, führen Sie sie in die Gefrierglasur-Einheit auf die kalte Stufe ein und warten Sie etwa 20 Minuten, damit sich die Temperatur der Doppelreplikatabelle auf minus 115 Grad Celsius einstellen kann.Anschließend wird das Gewebe durch manuelles Drehen des Rades gegen den Uhrzeigersinn gebrochen, das mit der Abdeckung über dem Doppel-Replikattisch verbunden ist. Wenn sich die Abdeckung dreht, wird der Doppel-Replikattisch geöffnet, wodurch das Gewebe gebrochen wird. Auf die Bruchflächen wird eine Kohleschicht aus einem Winkel von 90 Grad aufgebracht.Entfernen Sie anschließend die replizierten Proben von der Doppelreplikat-Tafel und überführen Sie sie in eine keramische 12-Loch-Platte, die mit TBS gefüllt ist. Entfernen Sie mit einem Platindraht-Öse die replizierte Gewebeprobe aus dem Probenträger. Überführen Sie für die SDS-Digestion ein Replikat in ein vier Milliliter fassendes Glasfläschchen, das mit einem Milliliter SDS-Digestionspuffer gefüllt ist.Lassen Sie es 18 Stunden bei 80 Grad Celsius unter Schütteln verdauen. Zum Immunfärbung waschen Sie die Replik 10 Minuten lang in frischem SDS-Verdauungspuffer. Anschließend inkubieren Sie sie mit primären und sekundären Antikörpern, verdünnt in 2 % BSA-TBS, in einer feuchten Kammer bei 15 Grad Celsius für 24 bis 72 Stunden.Anschließend die Replik auf einem formvarbeschichteten Raster mit 100 Linien parallel aufbringen. Die Replik mit einem Durchstrahlungselektronenmikroskop bei 80 oder 100 Kilovolt abbilden. Danach die digitalen Bilder über eine CCD-Kamera aufnehmen.Wenn es offline ist, finden Sie die entsprechenden Bereiche auf dem Bild der Replikat mithilfe unterschiedlicher Landmarken. Vier Wochen nach der AAV-Injektion, um Channelrhodopsin-2 in der posterioren thalamischen Kerngruppe zu exprimieren, wird Channelrhodopsin-2 effektiv anterograd entlang der thalamischen Axone transportiert, um die interkalierten Zellmassen der Amygdala zu erreichen. Die postsynaptische Spezialisierung glutamaterger Synapsen kann in einem Replikat als Ansammlung intramembranöser Partikel auf der E-Seite der Plasmamembran erkannt werden und wird oft von der P-Seite ihres präsynaptischen Elements begleitet.Hier wurden Channelrhodopsin-2 und Glutamatrezeptoren mithilfe von Goldpartikeln unterschiedlicher Größe, die an die sekundären Antikörper gekoppelt waren, sichtbar gemacht. Aufgrund des Fehlens struktureller oder molekularer Werkzeuge, um in derselben Replikat festzustellen, ob die postsynaptische Membran zu den interkalierten Neuronen gehörte, wurde die entsprechende Replikat für μ-Opioidrezeptoren markiert, einem Marker für diese Neuronen.Als Beispiel für die quantitative Analyse der Glutamatrezeptordichte an diesen Synapsen sind hier die Streudiagramme der Anzahl von Goldpartikeln für AMPA-Rezeptoren in Abhängigkeit von der synaptischen Fläche an Dornfortsätzen und Dendriten dargestellt, die in beiden Strukturen eine positive Korrelation aufzeigen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die einzelnen Schritte stark voneinander abhängen.Daher kann ein Fehler in einem der Schritte das gesamte Verfahren gefährden. Die Betrachtung eines großen Bereichs von Plasmamembranspezialisierungen auf der zweidimensionalen Oberfläche der Abformung ermöglicht die Untersuchung der räumlichen Verteilung und physikalischen Kontinuität von Molekülen des Interesses, ohne dass eine aufwändige und zeitraubende Rekonstruktion serieller Artrophin-Schnitte erforderlich ist. Dieser Ansatz kann von anderen Forschern genutzt werden, um Einblicke in die Struktur-Funktions-Beziehungen spezifischer Synapsen in neuronalen Schaltkreisen zu gewinnen.Wo es darum geht, den Ursprung der Eingaben und die Art der postsynaptischen Elemente zu entwirren, ist dies entscheidend, aber problematisch.

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Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Analyse der synaptischen Konnektivität zwischen dem medialen präfrontalen Kortex (mPFC) und Amygdala-Neuronen anhand von akuten Amygdala-Hirnschnitten von Mäusen. Die mPFC-Neuronen in diesen Mäusen exprimieren Channelrhodopsin, das mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert ist. Die Kanalrhodopsine erleichtern den Ioneneinstrom und die Generierung von Aktionspotentialen in den mPFC-Neuronen nach Lichtaktivierung. Folglich setzen mPFC-Neuronen...

Visualisierung und Kartierung neuronaler Signalwege in einem Amygdala-Hirnschnitt

Quelle: Schönherr, S., et. al. Kombinierte optogenetische und Gefrierfraktur-Replikat-Immunmarkierung zur Untersuchung der inputspezifischen Anordnung von Glutamatrezeptoren in der Maus-Amygdala. J. Vis. exp. (2016)Dieses Video zeigt die Immunmarkierung von gefrierfrakturierten Nachbildungen von Hirngewebe von Mäusen für die Elektronenmikroskopie. Die gebrochenen und beschichteten Repliken werden verdaut, um Rezeptoren freizulegen. Primäre und goldmarkierte Sekundärantikörper werden...

Immunmarkierung von neuronalen Membranproteinen in einer gefriergebrochenen Probe von Hirngewebe der Maus

Quelle: Maruoka, H., et. al. Gleichzeitige Bildgebung der Mikrogliadynamik und der neuronalen Aktivität bei wachen Mäusen. J. vis. exp.,  (2022) Dieses Video zeigt ein Zwei-Photonen-Mikroskopieverfahren zur Abbildung der neuronalen Aktivität und der Mikrogliadynamik bei einer wachen Maus während der visuellen Stimulation, wobei Kalziumtransienten und zelluläre Wechselwirkungen hervorgehoben werden.

Gleichzeitige Bildgebung der Mikrogliadynamik und der neuronalen Aktivität bei einer wachen Maus

Dieses Video zeigt das Kraniotomieverfahren, das die chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex der Maus mittels in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie in der transgenen Thy1-GFP-Linie ermöglicht. Dieser Ansatz wird mit der Injektion von mCherry-exprimierenden Adeno-assoziierten Viren in den dorsalen Hippocampus kombiniert. Diese Techniken ermöglichen eine langfristige Überwachung der erfahrungsabhängigen strukturellen Plastizität bei RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

Optogenetische Ansätze sind weit verbreitet zu manipulieren neuronale Aktivität und bewerten die Auswirkungen auf die Gehirnfunktion verwendet. Hier wird eine Technik erläutert , dass bei in - vivo - Expression des optischen Aktivator Channelrhodopsin, ermöglicht eine ex vivo Analyse der synaptischen Eigenschaften bestimmter großer Reichweite und lokale neuronale Verbindungen in Angst bezogenen Schaltungen.

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Schaltkreise in Hirnschnitten

Dieses Protokoll enthält einen Workflow, künstliche MicroRNA-vermittelten RNA-Interferenz mit Optogenetik Förderung insbesondere präsynaptischen Boutons mit reduzierten Expression von selektiven-Gens in intakte neuronale Schaltkreise zu kombinieren.

Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs, die Effekte gen Knockdown präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren

Diese Arbeit stellt eine Methode, um eine optogenetische Monoblock-Aufnahme zuverlässig aus einem wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode durchführen.

Optogenetik Identifikation eines neuronalen Typs mit einer Glas-Optrode wach Mäuse

Wir präsentieren ein Protokoll zur Bewertung des Gleichgewichts zwischen Glutamatfreisetzung und Clearance bei einzelnen kortikostriatalen glutamatergen Synapsen in akuten Scheiben von erwachsenen Mäusen. Dieses Protokoll verwendet den Fluoreszenzsensor iGluu zur Glutamaterkennung, eine sCMOS-Kamera zur Signalerfassung und ein Gerät zur fokalen Laserbeleuchtung.

Einzelne Synapsenindikatoren für Glutamatfreisetzung und Aufnahme in akuten Gehirnscheiben von normalen und Huntington-Mäusen

Mit optogenetischer Manipulation bestimmter neuronaler Populationen oder Hirnregionen kann das Verhalten bei frei beweglichen Tieren mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung verändert werden. Durch den Einsatz verschiedener optogenetischer Werkzeuge in Kombination mit chronisch implantierten optischen Fasern kann eine Vielzahl neuronaler Modulationen und Verhaltenstests durchgeführt werden.

Optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität, um das Verhalten bei frei beweglichen Mäusen zu modulieren

In vivo mikroendoskopische Kalzium-Bildgebung ist ein unschätzbares Werkzeug, das Echtzeit-Überwachung von neuronalen Aktivitäten bei frei verhaltenden Tieren ermöglicht. Jedoch, Anwendung dieser Technik auf die Amygdala war schwierig. Dieses Protokoll soll eine nützliche Leitlinie für die erfolgreiche Ausrichtung auf Amygdala-Zellen mit einem miniaturisierten Mikroskop bei Mäusen bieten.

Erfolgreiche In-vivo-Calcium-Bildgebung mit einem kopfmontierten Miniaturmikroskop in der Amygdala der frei verhaltenden Maus

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die virale Transduktion diskreter Hirnregionen mit optogenetischen Konstrukten beschreibt, um eine synapsenspezifische elektrophysiologische Charakterisierung in akuten Nagetierhirnschnitten zu ermöglichen.

Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entohinalen Kortex

Lernen Sie die kombinierte optogenetische und Gefrierbruch-Replika-Immunmarkierung zur Analyse von Glutamatrezeptoren in der Maus-Amygdala. Diese Methode ermöglicht die korrelierte Untersuchung synaptischer Struktur und Funktion.

Kombinierte optogenetische und Gefrierbruch Replica Immunmarkierung Eingang spezifische Anordnung der Glutamate Receptors in der Maus Amygdala zu untersuchen (Video) | JoVE Journal

Kombinierte optogenetische und Gefrierbruch Replica Immunmarkierung Eingang spezifische Anordnung der Glutamate Receptors in der Maus Amygdala zu untersuchen

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