Kombinierte optogenetische und Gefrierbruch Replica Immunmarkierung Eingang spezifische Anordnung der Glutamate Receptors in der Maus Amygdala zu untersuchen

Das Ziel dieses Verfahrens, das die Optogenetik mit der Freeze-Fracture-Replica-Immunmarkierungstechnik kombiniert, ist es, die Dichte ionotroper Glutamatrezeptoren an Synapsen in der Mausamygdala mit identifizierten prä- und postsynaptischen Elementen zu analysieren. Die hohe Reproduzierbarkeit und Vielseitigkeit dieser Freeze-Fracture-Replica-Immunmarkierungstechnik bietet in Kombination mit der Optogenetik einen sehr leistungsfähigen Ansatz für die korrelierte Analyse der strukturellen und funktionellen Eigenschaften von Synapsen. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens sind: die planare Ansicht der prä- und postsynaptischen Elemente und die quantitative Analyse von Proteinen in diesen spezialisierten Mikrodomänen.

Verschiedene Techniken können an eine Vielzahl unterschiedlicher Gewebe angepasst werden, um die Verteilung und Organisation integraler Membranproteine zu untersuchen. Im Allgemeinen ist dieser kombinierte optogenetische FRIL-Ansatz für Anfänger eine Herausforderung, da eine große Auswahl an verschiedenen Geräten und Maschinen erforderlich ist. Es ist wichtig, die Modulation mit einer anderen Methode zu beginnen, da einige andere Schritte schwer zu erlernen sind.

Zum Beispiel das Frakturieren und Replizieren von gefrorenen Proben: Um dieses Verfahren zu beginnen, kleben Sie einen koronalen Block des Mausgehirns auf die Halterung des Vibro-Slicers. Richten Sie den Gewebeblock so aus, dass der Neokortex der vibrierenden Klinge zugewandt ist. Als nächstes schneiden Sie die koronalen Abschnitte, die die Amygdala enthalten, mit einer Dicke von 140 Mikrometern in nullpunkt einen molaren, eiskalten PB auf. Und sammeln Sie sie in einer Sechs-Well-Schale im selben Puffer.

Schneiden Sie unter einem Stereomikroskop den interessierenden Bereich aus den Scheiben in einer Petrischale aus, die mit Silikonelastomer beschichtet und mit Nullkomma eins molaren PB gefüllt ist. Übertragen Sie dann den abgeschnittenen Block in die Kryoschutzlösung und halten Sie ihn über Nacht bei sechs Grad Celsius. Bereiten Sie in diesem Schritt die Kupferträger für die Verwendung in den aufeinanderfolgenden Phasen des FRIL-Verfahrens vor, indem Sie sie mit einem Blatt Shammy Skin als Anlaufentferner polieren. Befestigen Sie unter dem Mikroskop einen Ring aus doppelseitigem Klebeband an dem Kupferträger, der als Halteschacht für den abgeschnittenen Block dient.

Legen Sie dann den abgeschnittenen Block mit einer Platindrahtschlaufe in das Loch des doppelseitigen Klebebandes. Entfernen Sie überschüssige Kryoprotektivlösung mit einem Filterpapier oder einer Bürste. Decken Sie anschließend die Halterung mit einer anderen Transportbox ab.

So dass der Gewebeblock zwischen den beiden Trägern eingeklemmt ist. Um die Probe einzufrieren, setzen Sie das Trägersandwich in den Probenhalter ein. Setzen Sie anschließend den Probenhalter in die Hochdruck-Gefriereinheit ein.

Starten Sie den Gefrierzyklus, indem Sie die Jet-Auto-Taste drücken, entfernen Sie sofort den Probenhalter und tauchen Sie die Spitze in eine isolierte Box mit flüssigem Stickstoff. Nehmen Sie dann vorsichtig das Trägersandwich aus dem Probenhalter und legen Sie es in ein vorgekühltes Kryofläschchen. Lagern Sie die Kryofläschchen mit den Trägern bis zur Replikation in einem Kryotank.

Entfernen Sie vor dem Einsetzen der Elektronenstrahlkanone die Abschirmung mit der Prallplatte. Setzen Sie die Einstelllehre zum Zentrieren des Filaments durch die untere Kathodenabdeckung in das Spannzangenfutter ein. Schieben Sie dann das neue Filament über das Messgerät, bis die Drucklamellen die Enden des Filaments klemmen.

Entfernen Sie dann die Einstelllehre und setzen Sie den Carbonstab ein. Fixieren Sie es, indem Sie die Spannzange des Verdampferstangenhalters festziehen. Stellen Sie sicher, dass sich die Höhe des Endes der Stange in der Mitte der zweiten Spule von unten befindet.

Bringen Sie danach die Deflektorplatte wieder an und setzen Sie die Elektronenstrahlkanone in die Gefrierbrucheinheit ein. Bei diesem Verfahren stellen Sie den Strom und die Spannung für die Verdampfung ein. Legen Sie als Nächstes das gefrorene Trägersandwich in flüssigem Stickstoff in den Doppelrepliktisch ein.

Übertragen Sie dann den Doppelrepliktisch in das Dewargefäß und befestigen Sie ihn in einem Winkel von 45 Grad an der Probentischaufnahme. Nehmen Sie den Doppelrepliktisch mit einem Tischmanipulator auf. Setzen Sie es in die Gefrierbrucheinheit auf die kalte Stufe ein und warten Sie etwa 20 Minuten, bis sich die Temperatur des Doppelrepliktisches auf minus 115 Grad Celsius eingestellt hat.

Brechen Sie anschließend das Gewebe, indem Sie das Rad manuell gegen den Uhrzeigersinn drehen, das mit dem Tuch über dem Doppelrepliktisch verbunden ist. Wenn sich die Hülle dreht, zwingt sie den Doppelrepliktisch zum Öffnen, was zu einer Fraktur des Gewebes führt. Eine Schicht Carbon aus einem 90-Grad-Winkel wird auf die gebrochenen Flächen aufgebracht.

Sie anschließend die replizierten Proben aus dem Doppelrepliktisch und übertragen Sie sie auf eine mit TBS gefüllte Keramikplatte mit 12 Vertiefungen. Entfernen Sie das replizierte Gewebe mit einem Platin-Schlaufendraht aus dem Probenträger. Für den SDS-Aufschluss geben Sie eine Replik in ein Vier-Milliliter-Glasfläschchen, das mit einem Milliliter SDS-Aufschlusspuffer gefüllt ist.

Lassen Sie es 18 Stunden lang bei 80 Grad Celsius unter Schütteln verdauen. Für die Immunmarkierung waschen Sie das Replik 10 Minuten lang in frischem SDS-Verdauungspuffer. Inkubieren Sie es dann mit primären und sekundären Antikörpern, verdünnt in 2 % BSA-TBS, in einer feuchten Kammer bei 15 Grad Celsius für 24 bis 72 Stunden.

Montieren Sie danach das Replikat auf einem formweit beschichteten, 100-zeiligen Parallelstabgitter. Bilden Sie die Nachbildung mit einem Transmissionselektronenmikroskop bei 80 oder 100 Kilovolt ab. Nehmen Sie dann die digitalen Bilder über eine CCD-Kamera auf.

Wenn es offline ist, suchen Sie die entsprechenden Bereiche auf dem Image aus dem Replikat anhand verschiedener Orientierungspunkte. Vier Wochen nach der AAV-Injektion wird Channelrhodopsin-2 zur Expression von Channelrhodopsin-2 in der hinteren thalamischen Kerngruppe effektiv anterograd entlang der thalamischen Axone transportiert, um die interkalierten Zellmassen der Amygdala zu erreichen. Die postsynaptische Spezialisierung glutamaterger Synapsen kann in einer Replik als ein Cluster von Intramembranpartikeln auf der E-Fläche der Plasmamembran erkannt werden und wird oft von der P-Fläche ihres präsynaptischen Elements begleitet.

Hier wurden Channelrhodopsin-2- und Glutamatrezeptoren anhand von Goldpartikeln unterschiedlicher Größe sichtbar gemacht, die an die Sekundärantikörper konjugiert waren. Aufgrund des Mangels an strukturellen oder molekularen Werkzeugen, um auf derselben Replik nachzuweisen, ob die postsynaptische Membran zu den interkalierten Neuronen gehört. Die entsprechende Replik wurde für mu-Opioid-Rezeptoren markiert, einen Marker für diese Neuronen.

Als Beispiel für die quantitative Analyse der Glutamatrezeptordichte an diesen Synapsen sind hier die Streudiagramme der Anzahl der Goldpartikel für Ampa-Rezeptoren im Vergleich zur synaptischen Fläche an Stacheln und Dendriten. Was eine positive Korrelation in beiden Strukturen zeigt. Beim Versuch dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die einzelnen Schritte stark voneinander abhängig sind.

Daher kann ein Fehler in einem der Schritte das gesamte Verfahren gefährden. Die Betrachtung eines großen Teils der Plasmamembran-Spezialisierungen auf einer zweidimensionalen Oberfläche der Replik ermöglicht die Untersuchung der räumlichen Verteilung und der physikalischen Kontinuität von Molekülen von Interesse ohne mühsame und zeitaufwändige Rekonstruktion von seriellen Artrophin-Abschnitten. Dieser Ansatz kann von anderen Forschern genutzt werden, um Einblicke in die Struktur-Funktions-Beziehungen bestimmter Synapsen in neuronalen Schaltkreisen zu gewinnen.

Wo es darum geht, den Ursprung der Eingaben und die Natur der postsynaptischen Elemente zu entwirren. Ist entscheidend, aber problematisch.