Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, quantifizierbare Beobachtungen des zeitlichen und räumlichen Auftretens von neuronalen exozytären Vesikelfushion und Axonverzweigungen zu machen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. wann und wo die Vesikelfusion während der neuronalen Entwicklung Membranmaterial in die expandierende Plasmamembran einbringt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Bildgebung lebender Zellen kombiniert, um sowohl eine hohe räumliche als auch eine zeitliche Auflösung in einzelnen Zellen zu erfassen, und biochemische Ansätze zur Erfassung populationsbasierter Informationen.

Nach der Kultivierung und Simulation kortikaler Neuronen mit Netrin-1 oder einer Kontrolle gemäß Protokolltext. Aspirieren Sie PBS aus der ersten Vertiefung eines Zustands und ersetzen Sie es durch 250 Mikroliter Homogenisierungspuffer. Inkubieren Sie fünf Minuten lang auf Eis und homogenisieren Sie die Zellen dann mit einem Zellheber auf Eis.

Aspirieren Sie das PBS aus der nächsten Vertiefung mit demselben Zustand und geben Sie die kürzlich homogenisierte Mischung in die Vertiefung, wodurch die Proteinkonzentrationen erhöht werden. Übertragen Sie anschließend die homogenisierte Lösung in ein vorgekühltes 1,6-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen auf Eis und fügen Sie 20 % Triton X-100 hinzu, um eine Endkonzentration von 1 % zu erreichen. Inkubieren Sie die Röhrchen zwei Minuten lang auf Eis, um die Proteine zu lösen.

Zentrifugieren Sie dann 10 Minuten lang bei 6.010 RCF bei 4 Grad Celsius, um das ungelöste Material zu pelletieren. Der Überstand des Lie-Zustands wird in ein neues gekühltes 1,6-Milliliter-Röhrchen auf Eis überführt. Verwenden Sie als Nächstes den Bradford-Assay, um die Proteinkonzentration zu bestimmen.

Verwenden Sie dann einen Homogenisierungspuffer mit 1 %Triton X-100 und 5X Probenpuffer, der mit BME ergänzt ist, um die Proben auf eine Endkonzentration von 3-5 Milligramm pro Milliliter zu verdünnen. Jede Versuchsprobe gleichmäßig auf zwei Röhrchen aufteilen. Dann inkubieren Sie eine Probe 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und die andere 30 Minuten lang bei 100 Grad Celsius.

Drehen Sie die Röhrchen intermittierend um, um die Proben in Lösung zu halten. Führen Sie dann SDS-Seiten- und Western-Blotting gemäß dem Textprotokoll durch. Nach dem Einrichten des TIRF-Mikroskops und der Probe und dem Finden einer neuronalen Brennebene gemäß dem Textprotokoll.

Starten Sie die Lasersoftware und stellen Sie eine Verbindung zur Lasersteuerungssoftware her. Stellen Sie die Beleuchtung auf Weitfeld ein und wählen Sie das Objektiv aus. Stellen Sie dann den Brechungsindex der Probe ein und stellen Sie die Laserintensität ein, indem Sie die TTL für den Laser 491 deaktivieren.

Die Optimierung der Bildgebungsparameter ist bei der Bildgebung von bodenintakten exozytären Vesikeln wichtig, um Fokusdrift und Phototoxizität zu vermeiden und gleichzeitig Bilder mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis zu erzeugen, das für die Analyse ausreicht. Stellen Sie den Schieberegler auf 100 ein, und verringern Sie ihn dann wieder auf einen Wert zwischen 20 und 40. Überprüfen Sie dann erneut die TTL.

Fokussieren Sie anschließend erneut bei Durchlichtbeleuchtung auf die Probe. Wählen Sie dann in der Imaging-Software die Laserbeleuchtung 491 aus und öffnen Sie den Verschluss. Legen Sie den Kondensor kopfüber auf die optische Bank, um die Linse nicht zu zerkratzen.

Stellen Sie den Brennpunkt des Lasers an der Decke fein ein ein ein und zentrieren Sie den Punkt bei entferntem Kondensor auf die Mitte der geschlossenen Feldblende. Tauschen Sie dann den Kondensator aus und senden Sie in der TIRF-Software die Eindringtiefe auf 110 Nanometer. Wechseln Sie dann für die Bildgebung von der Weitfeldbeleuchtung in den TIRF-Beleuchtungsmodus.

Mit Hilfe der Weitfeld-Epifluoreszenz können nun VAMP2-Fluorenten gefunden werden, die Zellen durch die Okulare exprimieren. Um Photobleaching und Phototoxizität zu reduzieren, passen Sie dann die Bildgebungsparameter an, um das Signal-Rausch-Verhältnis und den Dynamikbereich bei minimaler Belichtungszeit und Laserintensität zu maximieren. Stellen Sie den kontinuierlichen Autofokus pro Zelle ein.

Nehmen Sie dann ein Zeitrafferbild auf, das fünf Minuten lang alle 0,5 Sekunden aufgenommen wird. Für den Netrin-1-stimulierten Zustand in einer Laminar-Flow-Haube geben Sie eine Endkonzentration von 500 Nanogramm pro Milliliter Netrin-1 in eine Zellschale und stellen Sie die Schale vor der Bildgebung eine Stunde lang wieder in den Inkubator. Um die Häufigkeit exozytärer Ereignisse zu quantifizieren, normiert pro Zellfläche und Zeit.

Öffnen Sie in ImageJ Bildstapel, indem Sie die Datei in das Fenster ziehen oder Datei, Öffnen, Dateiname auswählen. Um stabile Fluoreszenzsignale zu entfernen, die keine Vesikelfusionsereignisse darstellen, verwenden Sie Bild, Stapel, Z-Projekt, Projektionstyp Durchschnittliche Intensität. Um eine durchschnittliche Z-Projektion des gesamten Stapels zu erstellen.

Subtrahieren Sie das resultierende mittlere Bild von jedem Bild im Zeitraffer mit Prozess, Bildrechner, Bild 1 Ihrem Stapel, Operation Bild zwei subtrahieren. Das Ergebnis ist eine neu erstellte Z-Projektion. Dies wird exozytische Ereignisse betonen.

Zählen Sie nun mit dem Auge exotische Fusion-Ereignisse, die als Flecken beugungsbegrenzter Fluoreszenzsignale identifiziert werden können, die schnell diffundieren, wenn VAMP2-Fluoren in der Plasmamembran diffundiert. Markieren Sie das erste Bild mit Bild, Anpassen, Schwellenwert und passen Sie den Schieberegler an, bis die gesamte Zelle als Schwellenwert markiert ist. Wählen Sie dann unter Analyze (Analysieren) die Option Set Measurements (Messungen festlegen) aus, und überprüfen Sie die Bereichs- und Anzeigebeschriftung.

Legen Sie mit dem Stab-Nachzeichner den Schwellenwert für den Zellbereich fest und drücken Sie zum Messen die Taste M. Übertragen Sie die gesammelten Daten gemäß dem Textprotokoll in eine Tabelle. Nach zwei Tagen in vitro stellen Sie die Bildgebungsschale mit Glasboden mit nicht transfizierten Neuronen in eine vorgewärmte, feuchte Klimakammer.

Verwenden Sie ein Mikroskop, das mit einem Apochromaten 1,4 NA DIC-Objektiv mit sechs DX-Planplatten und einem Kondensor mit hoher numerischer Apertur ausgestattet ist, um die beste Bildqualität und Auflösung zu erzielen. Als nächstes stellen Sie mit Durchlichtbeleuchtung die Fokusebene ein, um Neuronen durch das Okular zu finden. Für die DIC-Bildgebung von Axonverzweigungen ist die richtige Einstellung der kühleren Beleuchtung ein wesentlicher Bestandteil der Bildoptimierung und entscheidend für die Erzielung analysierbarer Ergebnisse.

Wenn sich die interessierenden Neuronen im Sichtfeld befinden, verwenden Sie dann die Mehrbereichserfassungsfunktion in der Bildgebungssoftware, um die XYZ-Positionen von mindestens sechs Zellen zu finden und zu speichern. Fügen Sie nun eine Endkonzentration von 250 Nanogramm pro Milliliter Netrin-1 oder einen anderen interessierenden Faktor hinzu, um die Zellen zu simulieren, und drücken Sie auf Start der Mehrbereichserfassung. Erfassen Sie sequenziell Bilder an jeder Position alle 20 Sekunden für 24 Stunden.

Pausieren der Akquisition und Neufokussierung bei Bedarf. Überprüfen Sie in der Imaging-Software die Bilder, indem Sie Apps, Multidimensionale Daten überprüfen auswählen und die gewünschte Datei öffnen. Identifizieren Sie stabile Axonäste, die sich während der Bildgebungssitzung gebildet haben.

Verwenden Sie das Werkzeug für den Spurbereich, um einen stabilen Axonzweig von der Basis des Axons bis zur Spitze zu messen. Nach der Behandlung von Neuronen mit Netrin und Botulinumtoxin und Fixierung und Immunfärbung sowie Immunfärbung für Beta-3-Tubolin und Aktin gemäß dem Textprotokoll. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, um Weitfeld-Epifluoreszenzbilder aufzunehmen.

Öffnen Sie einen Bildstapel in ImageJ und verwenden Sie zur manuellen Analyse der Verzweigungslinie, der segmentierten Linie und verfolgen Sie das Axon, das als der längste Neurit definiert ist, der sich vom Soma erstreckt. Speichern Sie mit Analyze, Tools, ROI Manager die Axon-Tracing als Interessenbereich. Verfolgen und speichern Sie dann jeden Axonast, der als Neurit definiert ist, der größer oder gleich 20 Mikrometer Länge ist.

Schließen Sie nur primäre Zweige in die Analyse ein. Hier ist ein Western Blot nach Abschluss des SDS-resistenten SNARE-Komplex-Assays zu sehen. Untersucht auf SNAP25, Syntaxin 1A und VAMP2.

Hier sind SNARE-Proteine in komplexen, identifizierbaren Monomeren dargestellt. Ein Beispiel für ein VAMP2-fluroen-vermitteltes exozytäres Ereignis, das im Laufe der Zeit in einem kortikalen Neuron auftritt, ist hier dargestellt. Die vergrößerten Einschübe bezeichnen das Soma, einen Axonast und einen axonalen Wachstumskegel, was den räumlichen Nutzen dieses Assays zeigt.

Kreise detonieren einzelne exozytäre Fusionsereignisse, die mit Hilfe der TIRF-Mikroskopie sichtbar sind. Diese Zeitraffer-DIC-Bildgebung zeigt die Netrin-stimulierte Bildung eines Axonastes in Echtzeit. Diese Positionen bezeichnen den anfänglichen Vorsprung von einer Zweigstelle.

Diese stellen voll ausgebildete stabile Äste von mindestens 20 Mikrometern dar, gemessen vom Hauptaxon bis zur Astspitze. In diesem Experiment wurden kortikale Neuronen an 3 DIV entweder mit Netrin-1 behandelt, das die Verzweigung stimuliert, oder mit Botulinum-A-Toxin, das SNAP25, einen Bestandteil des SNARE-Komplexes, spaltet und die Exozytose blockiert. Die Ergebnisse zeigen, dass eine SNARE-vermittelte Exozytose für eine Netrin-abhängige Verzweigung erforderlich ist.

Nach der Beherrschung kann die DIC-Bildgebung in einer einzigen Bildgebungssitzung über Nacht abgeschlossen werden. Die TIRF-Bildgebung einzelner exozytärer Ereignisse kann in 4-5 Stunden durchgeführt werden. Das biochemische Protokoll der SNARE-Komplexbildung kann in zwei Stunden durchgeführt werden.

Wenn Sie diese Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, sich einzuteilen und keinen einzigen Schritt zu überstürzen. Jeder Eingriff erfordert Aufmerksamkeit und Geduld, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Kotransfektion von markierten Vesikelkomponenten mit markierten Kandidatenfrachten durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.

Was ist also die Ladung der exozytären Vesikel? Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, um die Neuritogenese, die Axonverzweigung und andere Stadien der Morphogenese in jeder dissoziierten neuronalen Kultur zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die räumliche und zeitliche Natur von neuronalen exozytären Vesikelfusionsereignissen, die mit Veränderungen der neuronalen Morphogenese korrespondieren, beobachten und quantifizieren können.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Botulinumtoxin oder Hochleistungslasern äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter Sicherheitskleidung und die Verwendung des Sicherheitsverriegelungsmechanismus des Mikroskops getroffen werden sollten.