Name: Glycan Knoten Analyse: Ein Bottom-up-Ansatz Glycomics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Erfahren Sie eine verbesserte Bottom-up-Glycomics-Methode zur Analyse von Glykanen in biologischen Proben mittels GC-MS. Diese Technik destilliert krankheitsrelevante Glykanmerkmale in einzelne analytische Signale und unterstützt die frühe Krebserkennung.

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Diese Arbeit wurde vom College of Liberal Arts and Sciences der Arizona State University in Form von Laborstartgeldern für CRB unterstützt. Es wurde auch durch ein Stipendium der Flinn Foundation (Grant No. 1977) und des National Cancer Institute der National Institutes of Health unter der Fördernummer R33CA191110 unterstützt. JA wurde vom National Institute of General Medical Sciences des National Institutes of Health Postbaccalalureate Research Education Program (PREP) unter der Fördernummer R25GM071798 unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder.

<ol><li>Li, M., Song, L., Qin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+changes%3A+cancer+metastasis+and+anti-cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer vaccines.</a> J Biosciences. 35 (4), 665-673 (2010).</li>
<li>Stanley, P., Schachter, H., Taniguchi, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStanley%2C+P+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 8: N-Glycans(2009).</li>
<li>Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+frequency+of+protein+glycosylation%2C+as+deduced+from+analysis+of+the+SWISS-PROT+database%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database.</a> Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).</li>
<li>Brockhausen, I., Schachter, H., Stanley, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrockhausen%2C+I+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 9: O-GalNAc Glycans (2009).</li>
<li>Rini, J., Esko, J., Varki, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRini%2C+J+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 5: Glycosyltransferases and Glycan-processing Enzymes (2009).</li>
<li>Gercel-Taylor, C., Bazzett, L. B., Taylor, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+aberrant+tumor-reactive+immunoglobulins+in+the+circulation+of+patients+with+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Presence of aberrant tumor-reactive immunoglobulins in the circulation of patients with ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 81 (1), 71-76 (2001).</li>
<li>An, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+glycans+in+serum+for+the+discovery+of+potential+biomarkers+for+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Profiling of glycans in serum for the discovery of potential biomarkers for ovarian cancer.</a> J Proteome Res. 5 (7), 1626-1635 (2006).</li>
<li>Kanoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+serum+IgG+oligosaccharide+chains+with+prostate+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in serum IgG oligosaccharide chains with prostate cancer progression.</a> Anticancer Res. 24 (5B), 3135-3139 (2004).</li>
<li>Kyselova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+serum+glycome+due+to+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Alterations in the serum glycome due to metastatic prostate cancer.</a> J Proteome Res. 6 (5), 1822-1832 (2007).</li>
<li>Okuyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucosylated+haptoglobin+is+a+novel+marker+for+pancreatic+cancer%3A+a+detailed+analysis+of+the+oligosaccharide+structure+and+a+possible+mechanism+for+fucosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fucosylated haptoglobin is a novel marker for pancreatic cancer: a detailed analysis of the oligosaccharide structure and a possible mechanism for fucosylation.</a> Int J Cancer. 118 (11), 2803-2808 (2006).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+microarrays+with+multi-lectin+detection%3A+unique+lectin+binding+patterns+as+a+tool+for+classifying+normal%2C+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+sera%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein microarrays with multi-lectin detection: unique lectin binding patterns as a tool for classifying normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer sera.</a> J Proteome Res. 6 (5), 1864-1874 (2007).</li>
<li>Comunale, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+serum+associated+fucosylated+glycoproteins+in+the+development+of+primary+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of serum associated fucosylated glycoproteins in the development of primary hepatocellular carcinoma.</a> J Proteome Res. 5 (2), 308-315 (2006).</li>
<li>Goldman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Hepatocellular+Carcinoma+Using+Glycomic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of Hepatocellular Carcinoma Using Glycomic Analysis.</a> Clin Cancer Res. 15 (5), 1808-1813 (2009).</li>
<li>Aurer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+glycosylation+of+Igg+heavy+chain+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Coll+Antropol%22%5BJournal%5D)">Aberrant glycosylation of Igg heavy chain in multiple myeloma.</a> Coll Antropol. 31 (1), 247-251 (2007).</li>
<li>Abd Hamid, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+to+reveal+potential+glycan+markers+from+serum+glycoproteins+associated+with+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A strategy to reveal potential glycan markers from serum glycoproteins associated with breast cancer progression.</a> Glycobiology. 18 (12), 1105-1118 (2008).</li>
<li>Kyselova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+diagnosis+and+prognosis+through+quantitative+measurements+of+serum+glycan+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Breast cancer diagnosis and prognosis through quantitative measurements of serum glycan profiles.</a> Clin Chem. 54 (7), 1166-1175 (2008).</li>
<li>Hongsachart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteomic+analysis+of+WGA-bound+glycoprotein+biomarkers+in+sera+from+patients+with+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Glycoproteomic analysis of WGA-bound glycoprotein biomarkers in sera from patients with lung adenocarcinoma.</a> Electrophoresis. 30 (7), 1206-1220 (2009).</li>
<li>Arnold, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+glycan+biomarkers+for+the+detection+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Novel glycan biomarkers for the detection of lung cancer.</a> J Proteome Res. 10 (4), 1755-1764 (2011).</li>
<li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Anal Chem. 82 (24), 10208-10215 (2010).</li>
<li>Kodar, K., Stadlmann, J., Klaamas, K., Sergeyev, B., Kurtenkov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+G+Fc+N-glycan+profiling+in+patients+with+gastric+cancer+by+LC-ESI-MS%3A+relation+to+tumor+progression+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin G Fc N-glycan profiling in patients with gastric cancer by LC-ESI-MS: relation to tumor progression and survival.</a> Glycoconj J. 29 (1), 57-66 (2012).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgG+Fc-glycosylation+profiling+reveals+associations+with+age%2C+sex%2C+female+sex+hormones+and+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Human IgG Fc-glycosylation profiling reveals associations with age, sex, female sex hormones and thyroid cancer.</a> J Proteomics. 75 (10), 2824-2834 (2012).</li>
<li>Takeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucosylated+haptoglobin+is+a+novel+type+of+cancer+biomarker+linked+to+the+prognosis+after+an+operation+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Fucosylated haptoglobin is a novel type of cancer biomarker linked to the prognosis after an operation in colorectal cancer.</a> Cancer. 118 (12), 3036-3043 (2012).</li>
<li>Parekh, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+rheumatoid+arthritis+and+primary+osteoarthritis+with+changes+in+the+glycosylation+pattern+of+total+serum+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG.</a> Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).</li>
<li>Mehta, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+levels+of+galactose-deficient+anti-Gal+immunoglobulin+G+in+the+sera+of+hepatitis+C+virus-infected+individuals+with+fibrosis+and+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Increased levels of galactose-deficient anti-Gal immunoglobulin G in the sera of hepatitis C virus-infected individuals with fibrosis and cirrhosis.</a> J Virol. 82 (3), 1259-1270 (2008).</li>
<li>Horvat, T., Zoldoš, V., Lauc, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutional+and+clinical+implications+of+the+epigenetic+regulation+of+protein+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Evolutional and clinical implications of the epigenetic regulation of protein glycosylation.</a> Clinical Epigenetics. 2 (2), 425-432 (2011).</li>
<li>Zoldoš, V., Novokmet, M., Bečeheli, I., Lauc, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+epigenomics+of+the+human+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Genomics and epigenomics of the human glycome.</a> Glycoconj J. 30 (1), 41-50 (2013).</li>
<li>Lowe, J. B., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+approach+to+Mammalian+glycan+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">A genetic approach to Mammalian glycan function.</a> Annu Rev Biochem. 72, 643-691 (2003).</li>
<li>Tuccillo, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+Glycosylation+as+Biomarker+for+Cancer%3A+Focus+on+CD43%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Aberrant Glycosylation as Biomarker for Cancer: Focus on CD43.</a> Biomed Res Int. , (2014).</li>
<li>Varki, A., Kannagi, R., Toole, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVarki%2C+A+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 44: Glycosylation Changes in Cancer (2009).</li>
<li>Brockhausen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucin-type+O-glycans+in+human+colon+and+breast+cancer%3A+glycodynamics+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Mucin-type O-glycans in human colon and breast cancer: glycodynamics and functions.</a> EMBO reports. 7 (6), 599-604 (2006).</li>
<li>Ohtsubo, K., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+in+cellular+mechanisms+of+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease.</a> Cell. 126 (5), 855-867 (2006).</li>
<li>Bertozzi, C. R., Sasisekharan, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertozzi%2C+CR+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch 48 Glycomics (2009).</li>
<li>Borges, C. R., Rehder, D. S., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+surrogate+analysis+of+glycotransferase+activity+in+whole+biospecimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiplexed surrogate analysis of glycotransferase activity in whole biospecimens.</a> Anal Chem. 85 (5), 2927-2936 (2013).</li>
<li>Mcinnes, A. G., Ball, D. H., Cooper, F. P., Bishop, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+Carbohydrate+Derivatives+by+Gas-Liquid+Partition+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Separation of Carbohydrate Derivatives by Gas-Liquid Partition Chromatography.</a> J Chromatogr. 1 (6), 556-557 (1958).</li>
<li>Ciucanu, I., Caprita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Per-O-methylation+of+neutral+carbohydrates+directly+from+aqueous+samples+for+gas+chromatography+and+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Per-O-methylation of neutral carbohydrates directly from aqueous samples for gas chromatography and mass spectrometry analysis.</a> Anal Chim Acta. 585 (1), 81-85 (2007).</li>
<li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0008621584852428">A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates.</a> Carbohydr Res. 131, 209-217 (1984).</li>
<li>Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+permethylation+of+glycans+for+mass+spectrometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">Solid-phase permethylation of glycans for mass spectrometric analysis.</a> Rapid Commun Mass Sp. 19 (23), 3421-3428 (2005).</li>
<li>Kang, P., Mechref, Y., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+solid-phase+permethylation+of+glycans+prior+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">High-throughput solid-phase permethylation of glycans prior to mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Sp. 22 (5), 721-734 (2008).</li>
<li>Goetz, J. A., Mechref, Y., Kang, P., Jeng, M. H., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomic+profiling+of+invasive+and+non-invasive+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Glycomic profiling of invasive and non-invasive breast cancer cells.</a> Glycoconj J. 26 (2), 117-131 (2009).</li>
<li>Goetz, J. A., Novotny, M. V., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic%2Fchemical+release+of+O-glycans+allowing+MS+analysis+at+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic/chemical release of O-glycans allowing MS analysis at high sensitivity.</a> Anal Chem. 81 (23), 9546-9552 (2009).</li>
<li>Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMulloy%2C+B+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. Ch. 47: Structural Analysis of Glycans (2009).</li>
<li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silanizing+glassware%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Silanizing glassware.</a> Curr Protoc Immunol. 21, A.3K.1-A.3K.2 (1997).</li>
<li>Stellner, K., Saito, H., Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+aminosugar+linkages+in+glycolipids+by+methylation.+Aminosugar+linkages+of+ceramide+pentasaccharides+of+rabbit+erythrocytes+and+of+Forssman+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Determination of aminosugar linkages in glycolipids by methylation. Aminosugar linkages of ceramide pentasaccharides of rabbit erythrocytes and of Forssman antigen.</a> Arch Biochem Biophys. 155 (2), 464-472 (1973).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Im Allgemeinen ist die erfolgreiche Herstellung von partiell methylierten Alditolacetate (PMAAs) von Hexosen behaftet mit weniger Schwierigkeiten und ist robuster als die erfolgreiche Produktion von N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. Der genaue Mechanismus hinter diesem Phänomen , wie es in jedem Schritt dieses Verfahrens abspielt ist unbekannt, aber die einzigartige Chemie der N - acetyl - Gruppe beziehen muss ( und nicht Hydroxylgruppe), die Hexosen zu HexNAcs relativ einzigartig ist. Der Mechanismu...

Glycolipide, Glycoproteine, Proteoglycane und Glycosaminoglycane bilden die vier Hauptklassen von komplexen, heterogenen Kohlenhydrate als Glykane gemeinsam bekannt. So allgegenwärtig und integrale Bestandteile der Plasmamembran, Glykokalyx, und die extrazelluläre Matrix und Flüssigkeiten, teilzuhaben Glycane in so unterschiedlichen biochemischen Prozesse wie Endozytose intrazellulär Handel, Zellmotilität, Signaltransduktion, molekularen Erkennung, Rezeptoraktivierung, Zelladhäsion, Wechselwirkung Wirt-Pathogen , die interzelluläre Kommunikation, immunosurveillance und Immunantwort Initiation. 1 Präsent in fast jeder Domäne des Lebens, wie Glycosyltransferasen bekannte Enzyme , die Glykan Polymere wirken im Tandem bauen mit Glycosidhydrolasen (auch als Glycosidasen bekannt, die Glykane brechen) zu konstruieren, gestalten, und schließlich produzieren abgeschlossen Glykan Polymere 2. Obwohl jeder Glycosyltransferase auf verschiedenen Glycokonjugaten arbeiten kann, eine Glycosyltransferaseallgemein schmiedet eine linkage- und Anomer-spezifischen glykosidischen Bindung durch die Monosaccharid - Einheit eines bestimmten aktivierten Nucleotidzucker Donator übertragen (beispielsweise GDP-Fucose) zu einer bestimmten Kategorie von nucleophilen Akzeptoren (beispielsweise ein Lipid, Polypeptid, eine Nukleinsäure, oder wachsende Oligosaccharid). Es wurde geschätzt , dass mehr als 50% der Proteine ​​(insbesondere Membran und sekretorischen Proteinen) sind post-translational durch Glykosylierung modifiziert 3 Rudimentäre kombinatorischen Berechnungen eine Anerkennung für die große Variabilität bieten, Vielseitigkeit und Spezifität an Glykoproteine ​​durch Glykosylierung gewährt. Wenn ein Polypeptid Substrat 10 Glykosylierungsstellen zum Beispiel, hat , und jede Seite kann mit 1 von nur 3 verschiedene Monosaccharid des reduzierenden Enden, dann theoretisch die endgültige Glykoprotein kann 3 10 = 59.049 verschiedene Identitäten annehmen eine glycosidische Bindung bilden. In Glykoproteine ​​bilden Glykosidbindungen gemeinsam mit der Seitenketten-Stickstoff of Asparaginresten in der Sequenz Asn-X-Ser / Thr (X ist eine beliebige Aminosäure außer Prolin sein kann) N zu ergeben Glycane 2 und Seitenketten - Hydroxylgruppen von Serin und Threonin - Resten O 4 - Glycane zu ergeben. Die Zusammensetzung einer glycome der Zelle (dh sein Komplement von Glykosylierungsprodukte) ist einzigartig und begrenzt , da mit wenigen Ausnahmen, Glycosyltransferasen strenge Spender zeigen, Akzeptor und Verknüpfung Spezifität. 5 Wichtige und reichlich Blutplasma Glykoproteine ​​anomale Glykosylierung als nachgeschalteter Folge leiden viele pathologische Zustände abnormer Glycosyltransferase Expression und Aktivität aufgrund, insbesondere Krebs und entzündlichen Erkrankungen. 6-24 Vor allem aufgrund der epigenetischen Faktoren ist die glycome wesentlich vielfältiger, dynamischer und komplexer als das Proteom und Transkriptom. 25,26 Während etwa 1% des Säugetiergenoms , die Bildung, Modifikation kodiert, undMontage von Glycanen, 27 Glykosylierung erfolgt in einem nicht-template risch-ein deutlichem Gegensatz zu Polypeptid und Nukleinsäure - Biosynthese. Das Zusammenspiel zwischen der relativen Menge und Aktivität der Glycosylierungsenzyme und solche Umweltfaktoren als Nährstoff und Vorläufer Verfügbarkeit bestimmt letztendlich die Art, die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Glykosylierung. 5,28 Embryonalentwicklung (zB Bestimmung und Differenzierung), Zellaktivierung, und die Progression durch der Zellzyklus Einfluss Genexpression (dh Transkription und Translation) und die Identität und die Menge der verfügbaren Glycosyltransferasen ändern, deren Tätigkeit die unmittelbare stromauf Determinante des Glycans Profil der Zelle. Weil (einige) die proliferative, Klebstoff und invasive Eigenschaften von Krebszellen ähneln denen der gewöhnlichen embryogenen Zellen, spezifische Änderungen in Glykan Biosynthesewege (zB Vorläufer Akkumulation, deregulierten Expression aberrant Modifikation, strukturelle Abschneiden oder neuartige Bildung) dienen als universelle Krebs Biomarker , die verschiedenen Stadien der Tumorbildung zeigen, Progression, Migration und Invasion 29 Obwohl Glykosylierung sehr komplex ist, offenbar nur wenige Änderungen in der Glykosylierung der Karzinogenese und Metastasierung ermöglichen kann. offenbar gewisse &quot;anomale&quot; Glykosylierungsprodukte tatsächlich Krebszellen profitieren , indem ihnen die Immunerkennung zu entziehen und die Anforderungen der Migration in unwirtlichen intravaskulären und metastatischen Umgebungen überleben. 28,30,31 nicht überraschend, haben Versuche gezeigt , dass zu stören oder zu verhindern Muster verändert Genexpression und anomale Glykan Bildung kann tumorigenesis stoppen. 29 Dennoch sind die anomalen in einer Biofluid Probe nachgewiesen Glykane (zB Urin, Speichel und Blutplasma oder Serum) kann nicht sein , direkte Indikatoren für Krebs (oder eine andere Krankheit), sondern stromabwärts Ergebnisse der subtilen, aber signifikantVeränderungen im Immunsystem oder quantifizierbaren Auswirkungen eines schädlichen Zustand in einem unberechenbaren Organ. 32 Obwohl sie universal Informationen über die glycome viele molekulare Wechselwirkung basierenden glycomics Techniken (beispielsweise Lectin / Antikörper - Arrays und metabolische / kovalente Markierung) liefern , hängen von der Erkennung von ganzen Glykanstrukturen und liefern keine detaillierte Strukturinformationen zu den einzelnen Glykane. In deutlichem Gegensatz dazu kann der Massenspektrometrie (MS) identifizieren und individuelle Glykanstrukturen quantifizieren und solche strukturellen Informationen wie die Befestigungsstellen an Polypeptid Kerne aufzudecken. Deregulierten Expression oder Aktivität von nur einer Glycosyltransferase kann eine Kaskade von schädlichen molekularen Vorgänge in mehreren Glycosylierungswege initiieren. Da jeder Glycosyltransferase auf mehr als einem Glykokonjugat Substrat und in den verschiedenen wachsenden Glykan Polymere, dereguliert Biosyntheseketten ergeben dispropor arbeiten kanntional erhöhte Mengen von 33 jedoch nur ein Glykan Produkt , sondern mehrere heterogene Klassen von anomalen Glykane in intra- oder extrazellulären Flüssigkeiten., so einzigartig anomale Glykane manchmal gelten als unpraktisch als Biomarker für Krebs oder andere Glykan-affektiven Erkrankungen , da im Vergleich zu den großen Pool von gut regulierten Glykane, diese anomale Glykane nur ein sehr geringer Anteil, der kann oft nicht nachweisbar bleiben, auch durch solche hochempfindliche Techniken wie Massenspektrometrie. Beispielsweise in intra- und extrazellulären Körperflüssigkeiten, die breite Proteinkonzentrations - Spektrum (die acht Grßenordnungen umspannt) können Detektions knapper Glycoproteine ​​zu verhindern , die durch die reichlicher Spezies maskiert sind. 32 Außerdem Glycosyltransferaseaktivität Bestimmung bleibt ein erheblicher praktischer und theoretische Herausforderung , weil viele Glycosyltransferasen fehlen in der klinischen biofluids oder inaktiv ex vivo. Trotz der Schwierigkeit, consistently Erfassung und extrem winzigen Mengen von einzigartigen Ganzen Glykane zu quantifizieren, Praktiker der Massenspektrometrie haben enorme Fortschritte in Richtung auf den Einsatz intakter Glykane als klinischer Marker gemacht. Wir haben vor kurzem einen komplementären Ansatz zur Analyse von intakten Glykane entwickelt, die GC-MS verwendet wird, die Erfassung aller konstituierenden Verzweigungspunkt und bindungsspezifischer Monosaccharide ( &quot;Glykan Knoten&quot;), die zusammen verleihen Einzigartigkeit jedes Glykan und in vielen erleichtert Fälle direkt als molekulare Surrogate dienen, die die relative Aktivität des schuldhaftem Glycosyltransferase (n) zu quantifizieren. Seit seiner ersten 1958 die direkte Anwendung auf Glykananalyse berichtet, Gaschromatographie (GC) ist eine leistungsfähige Technik erwiesen per-methyliert Mono- und Disacchariden 34 zu analysieren, bestimmen ihre anomericity und absolute Konfiguration und sie für die nachfolgende massenspektrometrische Analyse trennen. 35 zwischen 1984 und 2007, Ciucanu und Kollegeneine Festphasen - Glycan Permethylierung Technik eingeführt und verfeinert , die Natriumhydroxid und Iodmethan verwendet wird , durch Flüssig / Flüssig - Extraktion von permethyliertem Glykane mit Wasser und Chloroform. 35,36 Zwischen 2005 und 2008, Kang und Mitarbeiter integriert , um eine zeitsparende Spin -column Ansatz in den Permethylierung Schritt. 37,38 im Jahr 2008 erarbeitete die Goetz Forschungsgruppe eine quantitative Festphasen - Permethylierung Glykan-Profilierungsverfahren unter Verwendung von Matrix-assistierte Laser - Desorptions-Ionisations (MALDI) Massenspektrometrie zu vergleichen und möglicherweise unterscheiden invasive und nicht -invasive Brustkrebszellen; 39 dann, im Jahr 2009, die Goetz Team kombiniert enzymatische und chemische Release - Techniken zu spalten O - Glycane aus intakten Glykoproteinen in einer stark alkalischen Festphasen Permethylierung Schema 40 Obwohl die Goetz Verfahren gleichzeitige Permethylierung und chemischen Freisetzung erleichtert. O - Glycane, wurde es nur auf vorisolierten Glyco angewendetProteinen. Wir diese Technik im Jahr 2013 modifiziert und angepasst für ganze unfraktioniertem Biofluiden und homogenisiert Gewebeproben von Trifluoressigsäure enthält (TFA) Hydrolyse, Reduktion und Acetylierung Schritte. 33 Diese zusätzlichen Schritte auch Glykane aus Glycolipiden und N lösen -verknüpfte Glykane aus Glykoproteinen und wandeln sie in teilweise methylierte Alditolacetate (PMAAs, Abbildung 1), dessen Unterscheidungs ​​Methylierungs-and-Acetylierung Muster erleichtern die Analyse durch GC-MS und zu charakterisieren , in einzigartiger Weise die konstituierenden Glykan Knoten in der ursprünglichen intakten Glykan Polymer 41 (Abbildung 2). 33 letztlich diese Verfahren erzeugt ein zusammengesetztes Porträt aller Glykane in einem komplexen Biofluid basierend auf direkte, relative Quantifizierung von einzigartigen Glykan Funktionen wie &quot;Kern Fukosylierung&quot;, &quot;6-Sialylierung&quot;, &quot;bisecting GlcNAc&quot; und &quot;beta 1-6 Verzweigung&quot; - jeweils von einem einzigen GC-MS chromatographic Spitze. Dieser Artikel stellt eine weitere Optimierung der Permethylierung, Acetylierung, Isolation und Clean-up-Phasen zusammen mit Verbesserungen in der Art der relativen Quantifizierung.

<table><tbody><tr><td>Natronlaugekugeln&nbsp;</td><td>367176</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>20-40 Mesh, Reagenzgrad 97%</td></tr><tr><td>0,9 ml Spin-Säule</td><td>69705</td><td>Pierce-Abteilung von ThermoFisher Scientific</td><td>Enthält Stopfen und Polyethylen-Fritten</td></tr><tr><td>GC-MS Autosampler-Fläschchen (silanisiert)*</td><td>C4000-9</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Target DP Fläschchen mit hoher Rückgewinnung, 1,5&nbsp; ml, 12&nbsp; mm x 32&nbsp; mm, enthält mit Teflon ausgekleidete durchstechbare Kappen</td></tr><tr><td>1,5 ml Reagenzgläser aus Polypropylen</td><td>05-402-25</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Deckel mit Schnappverschluss</td></tr><tr><td>2 ml Reagenzgläser aus Polypropylen</td><td>05-408-138</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Deckel mit Schnappverschluss</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>D8418</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>BioReagenz für die Molekularbiologie, Reagenzqualität >99,0%</td></tr><tr><td>Jodmethan&nbsp;</td><td>I8507</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Enthält Kupfer als Stabilisator, ReagentPlus 99%</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>A955-4</td><td>ThermoFisher Wissenschaftlich</td><td>Optima LC/MS</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>75002436: Sorvall Legend Micro 17 Zentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>24 x 1,5/2,0 Rotor mit ClickSeal Bioabdichtungsdeckel. Katalognummer des Rotors: 75003424</td></tr><tr><td>Reagenzglas 13 x 100 Glas (silanisiert)*</td><td>53283-800</td><td>VWR</td><td>13 mm x 100 mm Reagenzgläser aus Borosilikatglas mit Schraubverschluss</td></tr><tr><td>Kappen für Reagenzgläser</td><td>14-930-15D</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Kimble&Handel; Schwarze Phenol-Schraubverschlüsse; 13&nbsp; mm-415 GPI Gewinde; PTFE-beschichtete Gummiauskleidung.</td></tr><tr><td>Natriumchlorid&nbsp;</td><td>S7653</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>>99,5% rein</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>4440-08</td><td>Macron Feinchemikalien&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure&nbsp;</td><td>299537</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>99 % durch Redestillation für die Proteinsequenzierung gereinigt&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumborhydrid</td><td>71321</td><td>Fluka Analytisch&nbsp;</td><td>99%</td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid-Lösung&nbsp;</td><td>320145</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>NH3Gehalt: 28,0-30,0%</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>AH230-4</td><td>Honeywell Burdick & Jackson</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Qualität Essigsäure&nbsp;</td><td>320099</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>99,70 %</td></tr><tr><td>Vakuum-Exsikkator aus Kunststoff</td><td>Jedes Modell in angemessener Größe</td><td>FoodSaver</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäureanhydrid&nbsp;</td><td>539996</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>99,50 %</td></tr><tr><td>Dichlormethan &nbsp;</td><td>D143SK-4</td><td>ThermoFisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>Stabilisierte HPLC-Qualität</td></tr><tr><td>Aceton&nbsp;</td><td>9006-03</td><td>J.T.Baker</td><td>Baker analysiert&nbsp;</td></tr><tr><td>Beheizter Verdampfungsverteiler (Haupteinheit)</td><td>pi18823</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heiz- und Rührmodul; Modell mit drei Blöcken und Heiz- und Rührfunktion</td></tr><tr><td>Beheizter Verdampfungsverteiler (Überkopfverdampfer)</td><td>pi18826</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>ThermoScientific* Reacti-Vap Verdampfer, 27 Anschlüsse; Zur Verwendung mit Reacti-Therm Heizmodul mit drei Blöcken</td></tr><tr><td>Probenhalterblöcke aus Aluminium für den Verdampfungsverteiler</td><td>pi18816</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Block, Aluminium, Reacti-Block S-1, hält 13&nbsp; Reagenzgläser mit Durchmesser mm, 13 Löcher (14&nbsp; mm Ø x 45&nbsp; mm tief)</td></tr><tr><td>Gaschromatograph</td><td>Modell A7890</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>Ausgestattet mit CTC PAL Autosampler</td></tr><tr><td>Massenspektrometer&nbsp;</td><td>GCT Premier (Time-of-Flight)</td><td>Gewässer&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Split-Mode-Liner (deaktiviert / silanisiert)</td><td>5183-4647</td><td>Agilent</td><td>Enthält einen kleinen Stopfen aus silanisierter Glaswolle</td></tr><tr><td>DB-5ms GC-Säule</td><td>122-5532</td><td>Agilent</td><td>30 m x 0,25 mm ID x 0,25 Mikron Schichtdicke</td></tr><tr><td>Chlortrimethylsilan</td><td>95541</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Vakuum-Exsikkator (für die Silanisierung von Glaswaren)</td><td>EW-06536-30</td><td>Cole-Parmer</td><td>12" breit; 230 mm Plattengröße</td></tr><tr><td colspan="4">*Die Silikonisierung von Glaswaren wird intern über Nacht unter Verwendung von Chlortrimethylsilandampf in einem großen Glas-Vakuum-Exsikkator durchgeführt.</td></tr></tbody></table>

glycan knoten analyse: ein bottom-up-ansatz glycomics

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Glykane werden in einem nicht vorlagengesteuerten Prozess von Enzymen, den Glykosyltransferasen, synthetisiert und spielen eine Schlüsselrolle bei verschiedenen signifikanten intra- und extrazellulären Ereignissen. Viele pathologische Erkrankungen, insbesondere Krebs, beeinflussen die Genexpression, was wiederum die relative Häufigkeit und das Aktivitätsniveau von Glykosidhydrolase- und Glykosyltransferase-Enzymen deregulieren kann. Einzigartige aberrante Vollglykane, die aus deregulierten Glykosyltransferase(n) resultieren, sind oft in Spuren in komplexen Bioflüssigkeiten vorhanden, was ihren Nachweis schwierig und manchmal stochastisch macht. Bei richtiger Probenvorbereitung kann jedoch eine der ältesten Formen der Massenspektrometrie (Gaschromatographie-Massenspektrometrie, GC-MS) routinemäßig die Ansammlung von Verzweigungspunkt- und Bindungs-spezifischen Monosacchariden ("Glykanknoten") nachweisen, die in komplexen Bioflüssigkeiten vorhanden sind. Ergänzend zu herkömmlichen Top-Down-Glykomik-Techniken beinhaltet der hierin diskutierte Ansatz das Sammeln und Kondensieren jedes konstituierenden Glykanknotens in einer Probe zu einem einzigen unabhängigen analytischen Signal, das detaillierte strukturelle und quantitative Informationen über Veränderungen des Glykoms als Ganzes liefert und potenziell deregulierte Glykosyltransferasen aufdeckt. Verbesserungen der Permethylierung und der nachfolgenden Flüssig-Flüssig-Extraktionsstufen, die hierin bereitgestellt werden, verbessern die Reproduzierbarkeit und die Gesamtausbeute, indem sie eine minimale Exposition von permethylierten Glykanen gegenüber alkalischen wässrigen Bedingungen ermöglichen. Modifikationen an der Acetylierungsstufe erhöhen das Reaktionsausmaß und die Gesamtausbeute zusätzlich. Trotz ihrer Reproduzierbarkeit zeigt sich, dass die Gesamtausbeuten von N-Acetylhexosamin (HexNAc) teilweise permethylierten Alditolacetaten (PMAAs) von Natur aus niedriger sind als ihr erwarteter theoretischer Wert im Vergleich zu Hexose-PMAAs. Die Berechnung des Verhältnisses der Fläche unter dem extrahierten Ionenchromatogramm (XIC) für jedes einzelne Hexose-PMAA (oder HexNAc-PMAA) zur Summe dieser XIC-Flächen für alle Hexosen (oder HexNAcs) bietet eine neue Normalisierungsmethode, die die relative Quantifizierung einzelner Glykanknoten in einer Probe erleichtert. Obwohl diese Methode derzeit in Bezug auf ihre absoluten Nachweisgrenzen eingeschränkt ist, beschleunigt sie die Analyse klinischer Bioflüssigkeiten und ist als ergänzender Ansatz zur traditionellen Top-down-Glykomik vielversprechend.

Ein Gesamtionenstrom - Chromatogramm (TIC) zeigt erfolgreiche Permethylierung, Hydrolyse, Reduktion und Acetylierung von menschlichem Blutplasma - Proben in Bezug auf Fälle , in denen zwei kritische Permethylierung Schritte falsch ausgeführt wurden , sind in Abbildung 3 dargestellt. Absolute Ausbeute an HexNAcs Bezogen auf Hexosen: N</e...

Dieser Artikel stellt eine verbesserte Form einer neuartigen Bottom-up-Glykomics-Technik vor, die entwickelt wurde, um das gepoolte Zusammensetzungsprofil von Glykanen in unfraktionierten Bioflüssigkeiten durch die chemische Zerlegung von Glykanen in ihre konstituierenden bindungsspezifischen Monosaccharide für den Nachweis durch GC-MS zu analysieren. Mögliche Anwendungen sind die Früherkennung von Krebs und anderen glykan-affektiven Störungen.

Glycan Knoten Analyse: Ein Bottom-up-Ansatz Glycomics

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, alle Glykane in einer biologischen Probe vollständig abzubauen, wobei die Zusammensetzung der Monosaccharide und die Bindungsinformationen erhalten bleiben. Dadurch wird die Isolierung interessanter Glykanmerkmale wie sialischer Verzweigungen und des zusätzlichen N-Acetylglucosamins in einzelne analytische Signale erleichtert. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Glykomik direkt zu beantworten, beispielsweise, welche einzigartigen Glykanmerkmale in bestimmten Krankheitszuständen verändert sind.Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass Glykan-Merkmale, die bei Krankheiten verändert sind, wie beispielsweise Beta-1-6-Verzweigungen und Core-Fucosylierung, in einzelne analytische Signale überführt werden, anstatt sich auf mehrere intakte Glykane zu verteilen. Im Allgemeinen haben Personen, die diese Methode durchführen, häufig mit geringen Ausbeuten an N-Acetylcysteinen aufgrund unsachgemäßer Verarbeitung frisch permethylierter Glykane zu kämpfen. Bereiten Sie die Proben vor, indem Sie zunächst jeweils neun Mikroliter jedes biologischen Analyten in separate 1,5-Milliliter-Reaktionsgefäße überführen.Zu jeder Probe ein Mikroliter deionisiertes Wasser und 270 Mikroliter hochreines DMSO hinzufügen und kräftig durch Vortexen vermischen. Nach der Probenvorbereitung die mit Natriumhydroxid beladenen Säulchen gemäß der schriftlichen Anleitung zusammenbauen.Unter Verwendung einer Analysespritze 105 Mikroliter Iodmethan zu jeder Probe hinzufügen und die Röhrchen sofort verschließen. Die Proben gründlich verwirbeln. Die zuvor vorbereiteten Säulchen vom Vakuum abkoppeln und 15 Sekunden bei 2.400 × g zentrifugieren. Nach dem Verwerfen der Sammelröhrchen und der Durchlauf-Flüssigkeit die Säulchen erneut aufsetzen und in ein frisches Satz Röhrchen stellen, die für jede Probe entsprechend beschriftet sind.Verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipettenspitze, um jede Analytlösung auf die entsprechende Säule des Drehkolbens zu übertragen. Sobald die Analytlösung zugegeben wurde, knicken Sie etwa zwei Milliliter vom Ende einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze ab und lassen Sie die Spitze zur Verwendung als Rührer in der Säule. Rühren Sie die Säulen mit den Pipettenspitzen alle zwei bis drei Minuten vorsichtig um. Nach 11 Minuten ziehen Sie die Säulen aus dem Gerät und zentrifugieren sie 15 Sekunden bei 2.400 G. Entfernen Sie sofort die Säuleneinsätze und stellen Sie sie in neue Sammelröhrchen, wobei Sie die Durchlauf-Lösung aufbewahren, die Stopfen jedoch entsorgen. Geben Sie 300 Mikroliter Acetonitril zu den Säulen hinzu und zentrifugieren Sie sie 30 Sekunden bei 9.600 G. Überführen Sie nun die ersten permethylierten Durchlauf-Lösungen in silanisierte Glasröhrchen, die 3,5 Milliliter Natriumphosphatpuffer enthalten. Achten Sie darauf, dass die übertragene Überstandslösung klar ist und kein Feststoff mitübertragen wird.Am Boden der Plastikröhrchen hat sich ein kleines weißes Pellet gebildet. Vermeiden Sie es, offensichtliches festes Material mitzuübertragen. Andernfalls führt dies zu geringen Ausbeuten an N-Acetylcystein-Glucosamin-Glycan-Aufzeichnungen.Vortexen Sie unmittelbar nach der Übertragung aller Proben jede Probe der Charge einzeln. Anschließend werden die Acetonitril-Durchlauf-Lösungen mit dem restlichen Flüssigkeitsanteil in den jeweiligen Reagenzgläsern vereinigt. Auch in diesem Schritt ist darauf zu achten, dass kein fester, weißer Rückstand mitübertragen wird.Decken, schütteln und unmittelbar vor dem Fortfahren zum nächsten Probenansatz die kombinierten Lösungen vortexen. Nach der Permethylierung 1,2 Milliliter Chloroform in jedes Reagenzglas innerhalb eines Abzugs hinzufügen. Danach die Röhrchen verschließen und den Inhalt kräftig mischen.Um die Schichten zu trennen, die Lösungen kurz bei 3.000 G zentrifugieren. Mit einer Pasteurpipette den größten Teil der oberen wässrigen Phase abziehen und verwerfen, wobei etwa drei Milliliter der Phase zurückbleiben. 3,5 Milliliter des 0,2-molaren Natriumphosphatpuffers hinzufügen, dann das Reagenzglas verschließen, mischen und zentrifugieren. Diesen Flüssig-Flüssig-Extraktionsschritt insgesamt dreimal durchführen.Etwa ein Milliliter der wässrigen Phase in der letzten Extraktion zurücklassen. Überführen Sie nun mithilfe einer sauberen, silanisierten Pasteurpipette die Chloroformphase vorsichtig in ein sauberes und beschriftetes, silanisiertes Glasröhrchen, wie im Textprotokoll beschrieben. Trocknen Sie die Proben in einem vorgeheizten Verdampfungsmanifold, der auf 75 Grad Celsius eingestellt ist, unter einem schwachen Strom von Stickstoffgas. Stellen Sie sicher, dass der Gasstrom die Flüssigkeitsoberfläche stört, jedoch ohne sie zu verspritzen. Sobald die Proben trocken sind, sind sie bereit für die Hydrolyse. Geben Sie 325 µL 2 M Trifluoressigsäure (TFA) zu jeder Probe hinzu und mischen Sie gründlich. Decken Sie jeden Probenbehälter unmittelbar nach der Zugabe zu allen Proben fest ab, um die Verdampfung von TFA und Probenverlust während des anschließenden Erhitzungsschritts zu verhindern. Inkubieren Sie die Proben bei 121 Grad Celsius für zwei Stunden, um die Glykane zu hydrolysieren. Während die Proben inkubieren, bereiten Sie erneut das Verdampfungsmanifold bei 75 Grad Celsius vor.Nach der Inkubation die Proben im Verdampfungsmanifold unter einem gleichmäßigen Strom von Stickstoff trocknen. Die Proben regelmäßig überprüfen, um sicherzustellen, dass sie mit einem möglichst geringen Trocknungszeitraum getrocknet werden. Zu jeder Probe 475 Mikroliter einer 10 Gramm pro Liter Natriumborhydrid-Lösung hinzufügen.Anschließend die Proben gründlich mischen, um eventuelle Rückstände aufzulösen. Die Reagenzgläser verschließen und die Reduktionsreaktion eine Stunde lang fortsetzen lassen. Danach 63 Mikroliter Methanol zu jeder Probe hinzufügen.Mischen Sie die Proben und trocknen Sie sie anschließend bei 75 Grad Celsius unter Stickstoff. Geben Sie 125 Mikroliter einer Methanol-zu-Essigsäure-Lösung zu jeder Probe hinzu. Mischen Sie erneut und trocknen Sie die Proben danach erneut bei 75 Grad Celsius unter Stickstoff.Stellen Sie sicher, dass die Proben vollständig trocken sind, indem Sie sie 20 Minuten lang unter Vakuum stellen. Geben Sie nach dem Trocknen 18 Mikroliter entionisiertes Wasser zu jeder Probe hinzu. Zentrifugieren Sie die Proben anschließend kurz und mischen Sie sie gründlich, um jeglichen Niederschlag aufzulösen.Fügen Sie anschließend 250 Mikroliter Essigsäureanhydrid zu jedem Reaktionsgefäß hinzu. Verschließen Sie die Gefäße, wirbeln Sie gründlich nach und sonizieren Sie die Proben zwei Minuten lang in einem Wasserbad, um eine vollständige Auflösung eventueller Rückstände sicherzustellen. Inkubieren Sie die Proben dann 10 Minuten bei 50 Grad Celsius.Fügen Sie nun 230 µL konzentrierte TFA zu jeder Probe hinzu. Nach dem Verschließen und Mischen der Proben inkubieren Sie diese 10 Minuten lang bei einer Innentemperatur von 50 °C. Geben Sie 1,8 mL Dichlormethan zu jeder Probe hinzu und mischen Sie gründlich.Fügen Sie anschließend zwei Milliliter destilliertes Wasser zur Probe hinzu und führen Sie eine Flüssig-Flüssig-Extraktion zweimal durch. Gewinnen Sie die Dichlormethan-Schicht mit einer silanisierten Pasteur-Pipette. Überführen Sie die Probe in ein Auto-Sampler-Gefäß und trocknen Sie die Probe anschließend bei 74 Grad Celsius unter Stickstoff. Vor der GC-MS rekonstituieren Sie die Proben jeweils mit 120 Mikrolitern Aceton, verschließen und mischen Sie sie gründlich. Im Split-Modus verwenden Sie einen Autosampler, um ein Mikroliter jeder Probe in das GC-Split-Modus-Injektionsrohr einzuspritzen. Für Flugzeit-Massenspektrometer wird ein Split-Verhältnis von vierzig und Heliumgas im konstanten Flussmodus bei 0,8 Millilitern pro Minute empfohlen.Analysieren Sie die Probe mithilfe eines zweistufigen Temperaturgradienten, der 325 Grad Celsius erreicht. Unterziehen Sie die eluierenden Probenbestandteile einer Elektronenionisation. Analysieren Sie für einen Flugzeit-Massenanalysator die Fragmente M/z von 40 bis 800 mit einer Impulssummationsrate von 0,1 Sekunden.Um die Empfindlichkeit dieses Protokolls zu demonstrieren, wurde eine biologische Probe sorgfältig aufbereitet. Das resultierende Chromatogramm zeigt eine ausreichende Intensität zwischen den Peaks der gewünschten Produkte, was den Vergleich und die Analyse erleichtert. Anschließend wurde dieselbe Ausgangsprobe mit dem gleichen Verfahren verarbeitet.Der weiße Rückstand in der Permethylierungslösung, der durch die NaOH-Säule zentrifugiert wurde, wurde jedoch in die anschließende Mischung für die Flüssig/Flüssig-Extraktion überführt. Das Chromatogramm zeigt ein anderes Verhältnis der Peakintensitäten der gleichen Hauptprobenprodukte. Bei direktem Vergleich ist der Unterschied deutlich. Die deutliche Absenkung des Peaks der an der 4-Position verknüpften N-Acetylglucosamin in der zweiten Chromatogramm ist ein erkennbares Merkmal einer nicht erfolgreichen Permethylierung und Extraktion. Um den Nutzen dieses Ansatzes zur Detektion von Unterschieden in der Glykanzusammensetzung bei Krankheitszuständen zu verdeutlichen, wurden extrahierte Ionen-Chromatogramme aus einer normalen Blutplasma-Probe und einer Blutplasma-Probe von einem Krebspatienten bezüglich 2-verknüpfter Manosen normalisiert und übereinandergelegt. Quantitative Unterschiede in einzigartigen Glykan-Merkmalen wie der beta-1,6-Verzweigung sowie einer krankhaften Sialylierung sind leicht erkennbar.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Bottom-up-Glykomik-Analyse von Glykan-Strukturen durchführt. Dies ermöglicht die Aufbereitung interessanter Glykaneigenschaften wie Core-Fucosylierung, Sialylierung und bikettierende Glykanite in einzelne analytische Signale.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Chemie

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