Glycan Knoten Analyse: Ein Bottom-up-Ansatz Glycomics

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, alle Glykane in einer biologischen Probe abzubauen und gleichzeitig die Monosaccharidzusammensetzung und die Bindungsinformationen zu erhalten. Erleichterung der Destillation interessanter Glykanmerkmale wie Sick-Cyalalierung und Halbierung von N-Acetylglucosamin in einzelne analytische Signale. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Glykomite direkt zu beantworten, z. B. welche einzigartigen Glykaneigenschaften in bestimmten Krankheitszuständen verändert sind.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Glykaneigenschaften, die bei Krankheiten tendenziell verändert werden, wie z. B. Beta-1-6-Verzweigung und Corfulcosulation, in einzelne analytische Signale destilliert werden, anstatt auf mehrere intakte Glykane verteilt zu werden. Im Allgemeinen müssen Einzelpersonen diese Methode wirklich mit schlechten N-Acetylcysteinen aufgrund der unsachgemäßen Verarbeitung von frisch permethylierten Glykanen zu kämpfen haben. Bereiten Sie die Proben vor, indem Sie zunächst neun Mikroliter jedes biologischen Analyten in separate 1,5-Milliliter-Reagenzgläser überführen.

Zu jeder Probe fügen Sie einen Mikroliter deionisiertes Wasser und 270 Mikroliter hochreines DMSO hinzu. Und kräftig mischen, indem man sie vortext. Nach der Probenvorbereitung werden die mit Natriumhydroxid beladenen Spin-Säulen wie im Textprotokoll beschrieben zusammengebaut.

Geben Sie mit einer Analysespritze 105 Mikroliter Jodmethan zu jedem Analyten und verschließen Sie die Röhrchen sofort. Wirbeln Sie die Proben gründlich durch. Trennen Sie die zuvor vorbereiteten Spin-Säulen und zentrifugieren Sie sie 15 Sekunden lang bei 2.400 Gs. Nachdem Sie die Reservoirröhrchen und den Zufluss entsorgt haben, schließen Sie die Säulen wieder an und legen Sie sie in einen neuen Satz Röhrchen, die für jeden Analyten beschriftet sind.

Verwenden Sie einen 1000-Mikroliter-Rohrkopf, um jede Analytlösung auf die entsprechende Spinsäule zu übertragen. Sobald die Analytlösung hinzugefügt wurde, crimpen Sie etwa zwei Milliliter vom Ende einer 200-Mikroliter-Rohrkopfspitze und lassen Sie die Spitze in der Säule, um sie als Rührer zu verwenden. Rühren Sie die Säulen mit den Pfeifenkopfspitzen alle zwei bis drei Minuten vorsichtig um.

Nach 11 Minuten ziehen Sie den Netzstecker aus der Steckdose und zentrifugieren Sie sie 15 Sekunden lang bei 2.400 Gs. Entfernen Sie sofort die Spin-Säulen und setzen Sie sie in neue Reservoirröhrchen ein, wobei Sie die Durchflusslösung aufbewahren, aber die Stopfen entsorgen. Geben Sie 300 Mikroliter Acetonnitril in die Säulen und zentrifugieren Sie sie 30 Sekunden lang bei 9.600 Gs.Übertragen Sie nun die ersten permethylierten Durchflusslösungen in silanisierte Glasreagenzgläser mit 3,5 Millilitern Natriumphosphatpuffer. Stellen Sie sicher, dass das übertragene Übermaterial klar ist und dass kein festes Material übertragen wird.

Am Boden der Kunststoffrohre hat sich ein kleines weißes Kügelchen gebildet. Vermeiden Sie das Übertragen von offensichtlichem festem Material. Andernfalls führt dies zu einer schlechten Ausbeute an N-Acetylcystein-Glucosamin-Glykannoten.

Sofort jede Probe in der Charge vortexen, sobald alle Proben übertragen wurden. Kombinieren Sie dann die Acetonnitril-Durchflusslösungen mit dem Rest der Flüssigkeit in den jeweiligen Reagenzgläsern. Vermeiden Sie auch bei diesem Schritt die Übertragung von festen, weißen Rückständen.

Verschließen, schütteln und wirbeln Sie die kombinierten Lösungen unmittelbar auf, bevor Sie zur nächsten Probe übergehen. Nach der Permethylierung geben Sie 1,2 Milliliter Chloroform in jedes Reagenzglas in einem Abzug. Verschließen Sie dann die Röhrchen und mischen Sie den Inhalt kräftig.

Um die Schichten zu trennen, zentrifugieren Sie die Lösungen kurz bei 3.000 Gs.Verwenden Sie einen Weiderohrkopf, um den größten Teil der oberen wässrigen Schicht zu extrahieren und zu entsorgen, wobei etwa drei Milliliter der Schicht zurückbleiben. Geben Sie 3,5 Milliliter des 0,2-molaren Natriumphosphatpuffers hinzu und verschließen, mischen und zentrifugieren Sie das Reagenzglas. Führen Sie diesen Schritt der Flüssig-Flüssig-Extraktion insgesamt dreimal aus.

Bei der abschließenden Extraktion verbleibt etwa ein Milliliter der wässrigen Schicht. Verwenden Sie nun einen sauberen silanisierten Weiderohrkopf, um die Chloroformschicht vorsichtig in ein sauberes und beschriftetes Reagenzglas aus silanisiertem Glas zu übertragen, wie im Textprotokoll beschrieben. In einem vorgeheizten Verdampfungsverteiler, der auf 75 Grad Celsius eingestellt ist, trocknen Sie die Proben unter einem sanften Strom von Stickstoffgas.

Achten Sie darauf, dass der Gasstrom die Flüssigkeitsoberfläche stört, ohne sie zu bespritzen. Sobald die Proben getrocknet sind, sind sie bereit für die Hydrolyse. Geben Sie 325 Mikroliter 2 molare Trifluoressigsäure oder TFA zu jeder Probe und mischen Sie gut.

Verschließen Sie jedes Probenröhrchen unmittelbar nach der Zugabe zu allen Proben, um TFA-Verdunstung und Probenverlust während des nachfolgenden Erhitzungsschritts zu verhindern. Inkubieren Sie die Proben zwei Stunden lang bei 121 Grad Celsius, um die Glykane zu hydrolysieren. Während die Proben inkubiert werden, bereiten Sie den Verdampfungsverteiler erneut bei 75 Grad Celsius vor.

Nach der Inkubation werden die Proben unter einem stetigen Stickstoffstrom im Verdampfungsverteiler getrocknet. Überprüfen Sie die Proben regelmäßig, um sicherzustellen, dass sie mit der geringstmöglichen Trocknungszeit getrocknet werden. Zu jeder Probe werden 475 Mikroliter Natriumborhydrid mit 10 Gramm pro Liter hinzugefügt.

Mischen Sie die Proben dann gründlich, um alle Rückstände aufzulösen. Verschließen Sie die Reagenzgläser und lassen Sie die Reduktionsreaktion eine Stunde lang weitergehen. Geben Sie anschließend 63 Mikroliter Methanol in jede Probe.

Mischen Sie die Proben und trocknen Sie sie anschließend bei 75 Grad Celsius unter Stickstoff. Geben Sie 125 Mikroliter Methanol in die Essigsäurelösung zu jeder Probe. Mischen Sie die Proben und trocknen Sie sie anschließend erneut bei 75 Grad Celsius unter Stickstoff.

Stellen Sie sicher, dass die Proben vollständig trocken sind, indem Sie sie 20 Minuten lang unter Vakuum stellen. Nach dem Trocknen fügen Sie jeder Probe 18 Mikroliter deionisiertes Wasser hinzu. Dann zentrifugieren Sie die Proben kurz und mischen Sie sie gut, um einen Niederschlag aufzulösen.

Geben Sie anschließend 250 Mikroliter Essigsäureanhydrid in jedes Röhrchen. Verschließen Sie die Röhrchen, wirbeln Sie die Proben gründlich vor und beschallen Sie sie zwei Minuten lang in einem Wasserbad, um eine vollständige Auflösung aller Rückstände zu gewährleisten. Anschließend werden die Proben 10 Minuten lang bei 50 Grad Celsius inkubiert.

Geben Sie nun 230 Mikroliter konzentriertes TFA zu jeder Probe. Nachdem Sie die Proben verschlossen und gemischt haben, inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei einer Innentemperatur von 50 Grad Celsius. Geben Sie 1,8 Milliliter Dichlormethan in jede Probe und mischen Sie gut.

Geben Sie anschließend zwei Milliliter dionisiertes Wasser in das Röhrchen und führen Sie zweimal eine Flüssig-Flüssig-Extraktion durch. Die Dichlormethanschicht mit einem silanisierten Weiderohrkopf zurückgewinnen. In ein Autosampler-Fläschchen umfüllen und dann die Probe unter Stickstoff bei 74 Grad Celsius trocknen.

Vor der GC-MS werden die Proben mit jeweils 120 Mikrolitern Aceton rekonstituiert, verschlossen und gründlich gemischt. Im Split-Modus injizieren Sie mit einem Autosampler einen Mikroliter jeder Probe in den GC-Split-Mode-Liner. Für Flugzeit-Massenspektrometer wird ein Split-Verhältnis von vierzig und Heliumgas im Konstantstrommodus bei 0,8 Millilitern pro Minute empfohlen.

Analysieren Sie die Probe mit einem zweistufigen Gradienten, der 325 Grad Celsius erreicht. Die ausweichenden Probenkomponenten werden einer Elektronenionisation unterzogen. Für einen Time-of-Flight-Massenanalysator analysieren Sie die Fragmente M über Z 40 bis 800 mit einer Pulssummationsrate von 0,1 Sekunden.

Um die Empfindlichkeit dieses Protokolls zu demonstrieren, wurde eine biologische Probe sorgfältig verarbeitet. Das resultierende Chromatogramm zeigt eine angemessene Intensität zwischen den gewünschten Produktpeaks, um den Vergleich und die Analyse zu erleichtern. Die gleiche biologische Ausgangsprobe wurde dann mit dem gleichen Verfahren verarbeitet.

Der weiße Rückstand in der Permethylierungslösung, der durch die NAOH-Säule geschleudert wurde, wurde jedoch in das nachfolgende Gemisch für die Flüssig-Flüssig-Extraktion mitgeführt. Das Chromatogramm zeigt ein unterschiedliches Verhältnis der Peakintensität der gleichen Schlüsselprobenprodukte. Im direkten Vergleich ist der Unterschied krass.

Die deutliche Vertiefung des 4-Positionen-verknüpften N-Acetylglucosamin-Peaks im zweiten Chromatogramm ist ein erkennbares Merkmal einer erfolglosen Permethylierung und Extraktion. Um die Nützlichkeit dieses Ansatzes zum Nachweis von Unterschieden in der Glykanzusammensetzung in Krankheitszuständen zu würdigen, werden extrahierte Ionenchromatogramme aus einer normalen Blutplasmaprobe und einer Blutplasmaprobe eines Krebspatienten auf 2-verknüpfte Manos normalisiert und überlagert. Quantitative Unterschiede in einzigartigen Glykanmerkmalen wie Beta-1-6-Verzweigung sowie kranker Cyalalation sind leicht erkennbar.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Bottom-up-Glykomics-Glykanknotenanalyse durchführt. Erleichterung der Destillation interessanter Glykanmerkmale wie Corfulcosulation, Sick-Cyalalation und Halbierung von Glykanit in einzelne analytische Signale.