Massenspektrometrische Analyse Glycosphingolipid Antigene

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine spezifische und empfindliche Methode zu entwickeln, um Einblicke in das Expressionsprofil von Glykofingerlipid-Antigenen in Immunorganen und -zellen zu erhalten. Dazu werden zunächst die Glykolipide aus den Zellen extrahiert. Der zweite Schritt besteht darin, neutrale Glyko-Fingering-Lipide von sauren Glyko-fingalen Lipiden zu trennen.

Nachdem die Phospholipide aus den neutralen Lipiden entfernt wurden, werden die extrahierten Glykolipide chemisch modifiziert, indem eine Perm-Methylierungsreaktion durchgeführt wird, bei der alle Hydroxylgruppen der Hexosen durch Methoxygruppen ersetzt werden. Letztendlich werden die extrahierten Glykofingerlipide mittels matrixgestütztem Laser, DESORPTIONSIONISATION, Flugzeit, Massenspektrometrie, abgekürzter Schimmelpilz-TOF MS und Eisenfallen-Massenspektrometrie analysiert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der analytischen HPLC und der Antikörperfärbung besteht darin, dass die Massenspektrometrie empfindlicher ist und massive Moleküle genau misst.

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, wie z. B. die Messung einer geringen Abundanz von Glykolipid-Antigenen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie oder Diagnose von Krebs, da viele Glykolipid-Antigene wie GD zwei und globales H als Krebs-Biomarker exprimiert werden. Ich werde das Verfahren als Studentin aus dem Labor von Professor DA Pen Zoe demonstrieren.

Dr. David Hawk wird Eingriffe an den Massenspektrometrie-Instrumenten durchführen, bevor er mit diesem Verfahren beginnt. Bereiten Sie basophile Leukämiezellen von Ratten vor, indem Sie die Zellen mit einem Hämozytometer zählen. Nach der Ttripper-Blau-Färbung sollte die Lebensfähigkeit der Zellen höher als 95 % sein. Extrahieren Sie die Lipide, indem Sie den Zellen zunächst sechs Milliliter eines volumetrischen Verhältnisses von eins zu eins zusetzen.

Verwenden Sie eine ausgiebige Beschallung für ein bis zwei Stunden mit dem Lösungsmittel mit gemischter Polarität. Dieses Verfahren wird zweimal mit einem Volumenverhältnis von 55 bis 25 bis 20 Isopropanolhexanwasser wiederholt, das wie im schriftlichen Verfahren beschrieben als abschließende Extraktion hergestellt wurde. Fügen Sie sechs Milliliter Chloroform, Methanol hinzu und beschallen Sie vorher.

Nach der Beschallung und der Zentrifugation wird das unlösliche Material fünf Minuten lang bei 4.000 U/min pelletiert. Ziehen Sie an den Senna, bevor Sie sie vier Stunden lang in einem Schnellsauger trocknen. Um die neutralen Lipide von den sauren Lipiden zu trennen, wird die Anionenaustauschchromatographie an einer kleinen Säule von de A e sedex A 20 durchgeführt.

Nach der Vorbereitung des DEAE SEDEX A 25, wie in der schriftlichen Prozedur zu diesem Video beschrieben, bereiten Sie die Säule mit einer Glaswand und einer 9-Zoll-Nudelpipette vor. Verpacken Sie die Glaswand sorgfältig, damit kein Harzpulver durch die Säule gelangt. Geben Sie DEAE sedex A 25 Harz auf den Hals der neun Zoll langen Luftpipette, ohne die Säule trocknen zu lassen.

Stellen Sie sicher, dass sich kein Harz im Eent befindet. Die Lipide werden in einem Volumenverhältnis von 30 bis 60 zu acht aus Chloroform-Methanol-Wasser aufgelöst und resuspendiert und die gelösten Proben auf die Säule aufgetragen. Die neutralen Lipide fließen durch die Säule, während die geladenen Lipide in der Säule verbleiben und die saure Lipidfraktion mit acht Millilitern Natriumacetat in Methanol eluieren.

Hier ist die getrocknete negativ geladene Fraktion nach der Behandlung mit Natriumacetat zu sehen. Entsalzen Sie die Fraktionen durch Dialyse mit dem Objektträger Eliza Dialysekassette nach der Dialyse. Trocknen Sie die Fraktionen vor der vorläufigen Analyse der Lipide mit Hilfe der Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie oder H-P-T-L-C zurück, um H-P-T-L-C durchzuführen. Lösen Sie die isolierten neutralen Glykofingerlipide oder gsl in 200 Mikrolitern eines Eins-zu-Eins-Volumenverhältnisses von Chloroform-Methanol-Lösungsmittel.

Laden Sie die Probe auf eine Kieselgel-Dünnschicht-Chromatographieplatte. Lassen Sie die Platten nach dem Trocknen der Platte in einem Volumenverhältnis von 60 bis 35 bis acht aus Chloroform-Methanol-Wasser laufen. Visualisieren Sie die Glykofingerlipide mit Arsenal Schwefelsäure bei 300 Grad Celsius für die sauren Lipide oder Ganglioside.

Verwenden Sie ein Volumenverhältnis von 55 bis 25 bis 20 Isopropanolhexan als Lösungsmittel und führen Sie das H-P-T-L-C auf die gleiche Weise ein. Zu diesem Zeitpunkt enthält die neutrale Fraktion nicht nur neutrale Glykofingerlipide, sondern auch Phospholipide, die durch Acetylierung und para-Acetylierungsreaktion entfernt werden müssen. Zuerst trocknen Sie die Durchlauffraktion DEAE sedex A 25 in der Drehzahl VAC unter Kühlung für vier Stunden.

Nachdem die Proben getrocknet sind, legen Sie sie wieder in den Speed Back und trocknen Sie weitere vier Stunden. Stellen Sie sicher, dass diese Proben vollständig trocken sind, da jegliches Restwasser die Para-Acetylierungsreaktion verhindert. Geben Sie einen Milliliter PERINE und 0,5 Milliliter Essigsäure-an-Hydrid zu den Proben für die para-Acetylierungsreaktion von bis zu 200 Mikrogramm Glyko-Fing-Lipiden, die über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert werden.

Eine Temperatur, bei der die GSL besser einen Milliliter Toluol hinzufügen sollten, um eine vollständige Verdampfung zu gewährleisten und das para sierte Material drei Stunden lang durch Speed-Vac zu trocknen. Wenn die Proben noch nicht vollständig trocken sind, beschleunigen Sie VAC, bis sie trocken sind, hier ist die getrocknete Paracex-Probe. Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine Floris-Siegelsäule vor, indem Sie die Floris-Dichtungsperlen zunächst durch Inkubation in einem 110 Grad Celsius heißen Ofen vollständig trocknen.

Bereiten Sie dann die Säule in einer Nudelpipette mit Glaswolle vor, indem Sie die Kügelchen bis zum Hals in die Nudelpipette füllen und in einem Volumenverhältnis von vier zu eins von eins zwei di Chlor Ethan Hexan Elution aus der Rauchzellensäule sehr schnell ausgleichen. Die schnelle Flüchtigkeit der Lösungsmittel kann zu einer Säulentrocknung führen. Daher sollten alle Lösungsmittelgemische vor dem Betrieb der Säule vorbereitet werden.

Da es nicht möglich ist, die Säule während der Elution zu stoppen. Die Percet-Probe in einem Milliliter wird auf ein Volumenverhältnis von vier zu eins von eins, zwei Di Chlor ETH Ethan Hexan aufgetragen. Waschen Sie die Säule mit sechs Millilitern des gleichen Lösungsmittels, gefolgt von 10 Millilitern eines Elus mit zwei Di Chlorethan.

Der neutrale Percet GSL mit sechs Millilitern eines Eins-zu-Eins-Volumenverhältnisses von eins zu zwei Dichloraceton. Dieser Schritt entfernt die Percet-Phospholipide aus den Glyko-Fingering-Lipiden, da die Percet-Glyko-Fingering-Lipide an die Fluorol-Säule binden, während dies bei Percet-Phospholipiden nicht der Fall ist. Nachdem Sie die Fraktionen zwei Stunden lang mit hoher Geschwindigkeit zurückgetrocknet haben, entacetylieren Sie drei Stunden lang bei Raumtemperatur mit zwei Millilitern 0,5 molaren Natrium, Methoxid und zwei Millilitern Methanol.

Nach der Inkubation wird das Gemisch mit drei Millilitern Methanol und Essigsäure neutralisiert und durch Geschwindigkeit zurückgetrocknet, Diesel durch Dialyse, indem die getrockneten Produkte in drei Millilitern Wasser aufgelöst und in den Objektträger Eliza Dialysekassette injiziert werden, gefolgt von einer Dialyse gegen Wasser für 24 Stunden, wobei das Wasser mindestens zweimal gewechselt wird, um das dialysierte gsl durch Speed Vac zu trocknen, bis die Proben vollständig trocken sind Für die Dauerwellenmethylierung. Zuerst geben Sie GSL in ein Glasröhrchen mit Schraubverschluss und Teflonauskleidung bei 150 Mikrolitern Dimethylsulfoxid, ohne spezielle Trocknungsbedingungen oder Inertgasatmosphäre in der chemischen Haube zu verwenden, und bereiten Sie pulverförmiges Natriumhydroxid aus Natriumhydroxidpartikeln vor, indem Sie sie in einem chemischen Mörser mit einem Stößel mahlen. Geben Sie anschließend das Natronlauge mit einem Spatel in die Probenlösung.

Fügen Sie dann 80 Mikroliter IO-Methan mit einer 100-Mikroliter-Hamilton-Spritze hinzu. Schütteln Sie das Gemisch eine Stunde lang bei Raumtemperatur, nachdem Sie die Methylierungsreaktion mit zwei Millilitern Wasser abgeschreckt haben, extrahieren Sie die perm methylierten Produkte durch Zugabe von zwei Millilitern Dichlormethan. Glykolipide befinden sich in der Dichlormethan-Phase, der unteren Phase, sodass die obere Phase in eine neue Glasröhre übertragen werden kann.

Die perm-methylierten Produkte können dann für insgesamt drei Extraktionen wieder mit Chlormethan extrahiert werden. Die kombinierten Dichlormethan-Extrakte werden dreimal mit zwei Millilitern Wasser gewaschen, wobei die obere wässrige Phase nach jeder Wäsche nach der letzten Wäsche abgelassen wird, die Proben in ein neues Röhrchen umgefüllt und getrocknet werden. Mit dem Speed-Vac können die Proben dann in 100 bis 200 Mikrolitern Methanol für die massenspektrometrische Analyse gelöst werden, die wie im schriftlichen Verfahren beschrieben durchgeführt wird. Die Proben wurden an die Proteomik-Einrichtung des MD Anderson Cancer Center der University of Texas geschickt und mit einem MALDI bis MS MS-Massenspektrometer sowie einem Ionenfallen-LTQ-Massenspektrometer analysiert.

Hier sehen Sie ein Beispiel für die MALDI MS-Analyse der Glykofingerlipide aus der Leukämiezelllinie RBL der Ratte, einem Antigen präsentierenden Zelltyp, der Glykofingerlipid-Antigene an NKT-Zellen präsentiert. Die Ionen können spezifischen Glyko-Fingering-Lipidstrukturen in RBL-Zellen zugeordnet werden, die mit dem Medikament behandelt wurden, das die Lipidsynthese der Glykofinger hemmt. Es wurde eine signifikante Reduktion aller Glyko-Fingerlipide beobachtet.

Strukturisomere können nicht unterschieden werden. Die msms-Kapazität der angewandten Biosysteme 4, 700 ermöglicht die Fragmentierung von MS Ein-Ionen auf MS zwei Fragmente, wodurch begrenzte strukturelle Informationen erzeugt werden können. Die MS-2-Analyse ist jedoch oft nicht ausreichend, um Oligosaccharid-Isomere zu unterscheiden, während die Ionenfallen-MS-Analyse von Glykofingerlipiden die Untersuchung von Oligosaccharid-Isomeren zum Nachweis solcher Isomere ermöglicht.

Die Standard-IGB drei und GB drei wurden in mehreren Fragmentierungsrunden analysiert, bis Unterschiede gefunden wurden, wie sie in diesem Merkmal gezeigt werden. MS 4-Profil von Ionen, die von IGB drei oder GB drei abgeleitet sind, wenn verschiedene Verhältnisse von IGB drei und GB drei gemischt werden. Eine Standardkurve kann basierend auf der Ionenhäufigkeit von Signaturionen erstellt werden, die von jedem Isomer abgeleitet sind. In dem hier vorgestellten Beispiel könnten IGB drei und GB drei durch den Vergleich mit den Standards unterschieden werden.

Dieses Spektrum repräsentiert die MS-4-Analyse von 1 3 2 5, wobei das molekulare Eisen die IMRs von GB drei und IGB drei Signaturionen für IGB drei und Signaturionen für GB drei darstellt, was auf das Vorhandensein einer Mischung der beiden Isomere hindeutet. Das Verhältnis von IGB drei zu GB drei wurde durch Vergleich mit einer Normkurve berechnet. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Glykolipide während der Chromatographie vollständig wiederherzustellen, bevor die Glykolipide promethyliert werden.

Stellen Sie sicher, dass während der Reinigung mindestens 80 Mikrogramm Glykolipide zurückgewonnen werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Glykolipide mit einer semiquantitativen Massenspektrometrie-Methode analysiert. Sie beherrschen die wichtigsten Schritte der Glykolipidextraktion, der Trennung in neutrale und saure Fraktionen, der Modifikation durch Perm-Methylierungsreaktion und der Übermittlung modifizierter Glykolipide an Ihre Massenspektrometrie-Einrichtung.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem oder zwei Di Chlorethan, Chloressigsäure und I oto Methan äußerst gefährlich sein kann und krebserregend sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe und Laborkittel sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden. Respektieren Sie die Regeln und genießen Sie Ihre Entdeckung.