Name: Massenspektrometrische Analyse Glycosphingolipid Antigene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: Erfahren Sie die massenspektrometrische Analyse von Glycosphingolipid-Antigenen in Immunzellen. Diese Methode ermöglicht die hochsensitive Detektion niedrig konzentrierter Glykolipide für die immunologische Krebsforschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DZ wird von MD Anderson Cancer Center und NIH Zuschüsse AI079232 unterstützt. MD Anderson Cancer Center wird zum Teil durch NIH CA16672 unterstützt.

Ein. Lab Sicherheitsbedenken <ol><li> Alle organischen Lösungsmittel müssen in bestimmten Bereichen durch klare Kennzeichnung gespeichert werden. Siehe Etiketten fertigt für Arten von Feuerlöschern erforderlich. </li><li> Mehrere verwendeten Reagenzien sind potentiell krebserregend und kann Depressionen verursachen. Diese Reagenzien müssen in einer chemischen Kapuze mit Belüftung (siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte für Einzelheiten) behandelt werden. </li><li> Es wird empfohlen, dass beim Arbeiten mit organischen Lösungsmitteln und Zellen, persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe, Kittel und Schutzbrille zu allen Zeiten genutzt werden. </li></ol> 2. Extraktion von Glycosphingolipide vom Rat Leukemia Cells <ol><li> Shop RBL rat Leukämiezellen 8 (10.000.000 bis 100.000.000) in 16x100 mm Glasröhrchen unter -80 ° C Bedingungen. Zellen sind von einer Zählkammer nach Trypanblaufärbung gezählt. Lebensfähigkeit von Zellen sollte höher als 95%. </li><li> Entpacken Sie die Lipide mit umfangreichen sonicatIonen viermal für 1-2 Stunden mit jeweils gemischten polaren Lösungsmitteln. Verwenden 6 ml Chloroform-Methanol 1:1 (v / v) als das erste und das letzte Lösungsmittel. Sechs Milliliter Isopropanol: Hexan: H 2 O 55:25:20 (v / v / v, zu entfernen Oberphase durch Absaugen vor Gebrauch) kann dann als zweite und dritte Lösungsmittel verwendet werden. Das Lösungsmittel wird durch Mischen von Isopropanol: Hexan: H 2 O in einem 55:25:20-Verhältnis, schüttelte sie heftig, und ermöglicht eine obere Phase zu erscheinen, welche entfernt werden. Halten Sie die untere Phase zum Einsatz. </li><li> Folgen Beschallung mit Zentrifugieren zu Pellets das unlösliche Material. Bündeln die Überstände. Trocknen Sie sie in einem Speedvac für 4 Stunden. Stickstoffstrom Rotationsverdampfer oder kann verwendet werden, wenn Speedvac nicht verfügbar ist. Verwenden Sie eine gute Kühlfalle zu verdampfenden organischen Lösungsmitteln zu halten. Verunreinigung von organischen Lösungsmittels in Vakuumpumpenöl verschlechtern die Effizienz der Vakuumpumpe. </li><li> Führen Sie eine vorläufige Analyse unter Verwendung von Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC). Um Glykolipide quantifizieren, Bereiten eine 0,2% Orcinol in 50% iger Schwefelsäure-Lösung (100 mg in 50 ml) und einem Galactose-Standard (40 mg in 100 ml Stammlösung). Bereiten Sie in 30 ul Reaktionsvolumen eine Reihe von Verdünnungen als Standardkurve (von 0 g / L bis 20 g / L) zu verwenden. Fügen Sie 20 ul Methanol jeder Verdünnungsreihe Probe. Lösen Sie jedes Glykolipid Probe in 200 ul Methanol, beschallen, und verwenden Sie 20 ul für Glykolipid Mengenmessung. In 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit verschraubten Kappen (Sarstedt, 72.692.005), 0,4 ml von 0,2% Orcinol in 50% iger Schwefelsäure-Lösung zu jeder Probe, mit einer Reihe von Galactose-H 2 O-Methanol-Lösungen, die für die Standardkurve dienen . Kochen für 5 min in Heizblock bei 100 ° C. Lesen optische Dichte der Farbreaktion bei 440 nm mit Sonnenaufgang Tecan Mikroplatten-Reader. Zur Durchführung HPTLC, verwenden Chloroform: Methanol: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) als Lösungsmittel für die neutralen Lipide mit Chloroform-Methanol 1:1 (v / v) behandelt. Verwendung von Isopropanol: Hexan: H 2 O 55:25:20 (v / v / v) alsdas Lösungsmittel für die Säure Lipide (Ganglioside). Die isolierten neutralen GSL wurde in 200 ul Lösungsmittel Chloroform: Methanol 1:1 (v / v) geladen und auf Merck Silicagel Dünnschichtchromatographieplatte von Drummond Microcaps. Die Platten wurden im Lösungsmittel Chloroform ausgeführt: Methanol: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) gewaschen und getrocknet. Die Glykosphingolipide wurden durch Orcinol-Schwefelsäure bei 300 ° C. </li><li> Um die Abscheidung von neutralen Lipiden aus den sauren Lipiden, Fraktion aus den neutralen und sauren Lipiden durch Anionenaustauschchromatographie auf einer kleinen Säule aus DEAE-Sephadex A-25 [der DEAE Sephadex A25 Harz kann durch Einweichen Sephadex A-25-Harz hergestellt werden Pulver in Chloroform: Methanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) über Nacht. Überstand bis die Sephadex A25 Harz wird alles, was übrig ist. Add frischen Chloroform: Methanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v), um das Harz zu waschen. Wiederholen Sie dreimal, um die negativ geladenen Reste aus Sephadex A25 Harz] entfernen. </li><li> Auflösen, Beschallen (nicht länger als 10 min) und resuspendiert die Lipide aus Schritt 2.1 in Chloroform: Methanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v), wenn nötig. </li><li> Bereiten Sie eine kleine DEAE Sephadex A25 (Cl Form) Spalte mit Glaswolle und einen 9 &quot;Pasteurpipette. Packen Sie die Glaswolle sorgfältig, so dass Harzpulver nicht durch die Säule nicht passieren. Hinzufügen DEAE Sephadex A25 (Cl Form) Harz auf die&quot; Hals &quot;des 9&quot; Pasteurpipette, ohne dass die Spalte trocken. Stellen Sie sicher, dass Sie sehen keinen Harz in Eluent. Die Proben in Chloroform: Methanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) gelöst. Die neutrale Lipidfraktion ist die Strömung durch Bruch. </li><li> Eluieren der sauren Lipidfraktion (gebunden an den Harzen) mit 8 ml Natriumacetat in Methanol. Trocknen Sie sowohl die neutrale und saure Fraktionen, entsalzen sie durch Dialyse, trocknen sie durch Speedvac und analysieren sie durch HPTLC. </li></ol> Die saure Fraktion enthält Ganglioside, die für den Schritt 3 Reaktion direkt dialysiert werden können.Die neutrale Fraktion enthält neben neutralen Glycosphingolipiden, sondern auch Phospholipide (Phosphatidylcholin und Sphingomyelin), die durch eine Acetylierungsreaktion entfernt werden müssen. Nach unserer Erfahrung, wobei das Verfahren eines Dialyse-Kassette, ist effizienter und bequemer als ein Dialyserohr oder Umkehrphasen-C18-Säule gereinigt. <ol start="9"><li> Der nächste Schritt ist das Entfernen von Phospholipiden aus neutralen Glycosphingolipiden durch eine Acetylierung und Peracetylierung Reaktion. Trocknen des DEAE Sephadex A-25-Pass-Through-Fraktion in der Speedvac (mit Kühlung) für 4 Stunden. Nachdem die Proben trocken sind, setzen Sie sie zurück in die Speedvac und trocken für weitere 4 Stunden. Stellen Sie sicher, dass diese Proben vollständig trocken sind, wie der restliche Wasser wird die Peracetylierung Reaktion zu verhindern. </li><li> Peracetylate die Proben mit 1 ml Pyridin und 0,5 ml Essigsäureanhydrid in der Dunkelheit bei Raumtemperatur oder 37 ° C über Nacht. Diese Menge an Pyridin und Essigsäureanhydrid für bis ordnungsgemäßebis 200 ug von Glykosphingolipiden. Diese Reaktion kann bei 37 ° C durchgeführt werden, da die GSLs bessere Löslichkeit haben. </li><li> Trocknen des Materials durch peracetylierten Speedvac für 3 Stunden, unter Zusatz von 1 ml Toluol 3x (Koevaporation) nach vollständiger Verdampfung gewährleisten. Wenn die Proben sind noch nicht ganz trocken, Speedvac bis trocken. </li><li> Bereiten Sie eine Florisil (Sigma-Aldrich) Spalte (30-60 mesh, 10 × 80 mm) in einer Pasteurpipette mit Glaswolle, mit Florisil Perlen. Florisil Kügelchen sollten vor Gebrauch vollständig getrocknet werden, durch Inkubation in einem 110 ° C Ofen. Füllen der Kügelchen in die Pasteurpipette bis zum Hals, und äquilibrieren in 1,2-Dichlorethan-Hexan 4:1 (v / v). </li></ol> Elution aus der Florisil Säule ist sehr schnell. Schnelle Volatilität der Lösungsmittel können die Spalte Trocknung führen. Damit sind alle Lösungsmittelgemische sollte vor dem Ausführen der Säule, da es nicht möglich ist, um die Säule während der Elution stoppen hergestellt werden. <ol start="13"><li> Übernehmen Sie die Peracetylated Probe in 1 ml 1,2-Dichlorethan-Hexan 4:1 (V / V), und die Säule mit 6 ml des gleichen Lösungsmittels, gefolgt von 10 ml 1,2-Dichlorethan, gefolgt. Eluieren neutralen peracetylierten GSLs mit 6 ml 1,2-Dichlorethan-Aceton 1:1 (v / v). Dieser Schritt entfernt die peracetylierten Phospholipide aus Glykosphingolipide, weil die peracetylierten Glykosphingolipide der Florisil Säule binden, während peracetylierten Phospholipide nicht tun. </li><li> Trocknen der Fraktionen durch Speedvac für 2 Stunden und desacetylieren mit 2 ml 0,5 M Natriummethylat [Sigma-Aldrich, 403.067] in 2 ml Methanol für 3 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Neutralisieren die Mischung mit 3 ml methanolischer Essigsäure [Essigsäure / Methanol 15/85 v / v], trocken Speedvac, desalt durch Dialyse [Lösen Sie die getrockneten Produkte in 3 ml Wasser und spritzen in die Slide-A-Lyzer Dialyse Cassette, gegen Wasser dialysiert für 24 Std. Wechseln Sie das Wasser mindestens zweimal]. Trocknen Sie die dialysierten GSLs (in wässriger Lösung) durch Speedvac, bis die Proben vollständig trocken sind. </li&gt; </ol> 3. Chemische Modifizierung (Permethylierung) von Glykosphingolipiden 13 <ol><li> Einführen GSLs (1-20 ug) in ein Glasröhrchen mit einem Schraubdeckel und Teflonseele und fügen Dimethylsulfoxid (150 ul) ohne Verwendung von speziellen Trocknungsbedingungen oder Inertgasatmosphäre. </li><li> Planen pulverförmiges Natriumhydroxid (40-60 mg) aus Natriumhydroxid Teilchen durch Mahlen in einer chemischen Mörser mit einem Pistill. Achten Sie darauf, die Pulver in einer sehr trockenen Umgebung lagern und darauf achten, dass die Schleifen in der chemischen Haube tun, um das Einatmen der Pulver. </li><li> Weiter fügen Natriumhydroxidpulver zu der Probenlösung mit einem Spatel. Hinzufügen Iodmethan (80 ul) mit 100 Mikroliter Halmilton Spritze, [oder einer 100-Mikroliter-Pipette VWR kalibrierten Verbindung mit einer Spritze durch Gummischlauch verwendet werden kann], und schüttelt das Gemisch bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Quench die Methylierungsreaktion mit Wasser (2 ml). Entpacken Sie die permethylierte Produkte 3 mal durchdie Zugabe von Dichlormethan (2 ml) [Glykolipide sind in der Dichlormethan-Phase, die die untere Phase, so dass die obere Phase kann auf eine neue Glasröhrchen transferiert werden, und extrahiert nochmals mit Dichlormethan ist]. </li><li> Die vereinigten Dichlormethan extrahiert 3 mal mit 2 ml Wasser [die obere Phase, die das Wasser ist, kann anschließend entsorgt werden]. Nach dem letzten Waschen übertragen die Proben in ein neues Röhrchen, und unter Verwendung der Speedvac trocknen. </li><li> Proben können dann in 100 bis 200 ul Methanol ESI-MS-Analyse gelöst werden. </li></ol> 4. MALDI-TOF-Analyse der permethylierten Gycosphingolipids <ol><li> Führen MALDI-TOF-MS und MALDI-TOF/TOF-MS/MS Experimente auf einem MALDI-TOF-TOF-Massenspektrometer (Applied Biosystems 4700, Foster City, CA). Bereiten Sie die Matrix durch Mischen von 50% Volumen von 10 mg / ml Dihydroxybenzoesäure (DHB) in Acetonitril und 50% Volumen von 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser. </li><li> Der DHB-Matrix kann auf der MALDI targe entdeckt werdent (1 ul), durch eine 1 ul (enthaltend 100 ng GSL) Spot der Probe in Methanol gelöst gefolgt. Übernehmen langsam und lassen Sie es vor der Analyse zu trocknen. </li></ol> 5. Ion Trap MS-Analyse von permethylierten Glycosphingolipide <ol><li> Führen Sie Massenspektrometrie auf einem linearen Ionenfallen-Massenspektrometer (LTQ, ThermoScientific, San Jose, CA) mit einem Nanoelektrospray Quelle, 0,30 ul / min bei 230 ° C Kapillartemperatur in positive Ionen-Modus mit 30-50% Kollisionsenergie. Set Kollisionsenergien eine minimal residual Fülle von Vorläufer-Ion verlassen. Erkennen alle Ionen wie Natrium-Addukte. </li><li> Identifizieren Sie die iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) in einer isobaren Mischung aus Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) und iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) Standards durch den Vergleich der unterschiedlichen Muster der MS 4 Produkt-Ionen aus dem sodiated Molekülion über die Glykan-Fragment m / z 667 und dem Terminal Disaccharid 1 - ene Ionen m / z 445 (dhX → 667 → 445 →, X bedeutet die Molekülion bei MS 1) aus reinem permethylierten iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) Standards über ESI-LIT-MS nachgewiesen mit denen der permethylierten Gb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer). </li></ol>

<ol><li>Schnaar, R. L., Suzuki, A., Stanley, P. Chapter 10 Glycosphingolipids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchnaar%2C+RL+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. , 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2009).</li>
<li>Bendelac, A. Chapter 17 NKT cells and other Innate-like T and B lineages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBendelac%2C+A+%22Fundamental+Immunology%22">Fundamental Immunology</a>. Paul, W. E. , 6th edition, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).</li>
<li>Jacewicz, M., Clausen, H., Nudelman, E., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+shigella+diarrhea.+XI.+Isolation+of+a+shigella+toxin-binding+glycolipid+from+rabbit+jejunum+and+HeLa+cells+and+its+identification+as+globotriaosylceramide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of shigella diarrhea. XI. Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLa cells and its identification as globotriaosylceramide.</a> J. Exp. Med. 163 (6), 1391-1404 (1986).</li>
<li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+function+of+iGb3%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protein+Pept.+Sci%22%5BJournal%5D)">The immunological function of iGb3.</a> Curr. Protein Pept. Sci. 7 (4), 325-333 (2006).</li>
<li>Miyamoto, K., Miyake, S., Yamamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+glycolipid+prevents+autoimmune+encephalomyelitis+by+inducing+TH2+bias+of+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells.</a> Nature. 413 (6855), 531-534 (2001).</li>
<li>Zhou, D., Levery, S. B., Hsu, F. F., Wang, P. G., Teneberg, S., Almeida, I. C., Li, Y., Xu, H., Wang, L. X., Xia, C., Ibrahim, N. K., Michael, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+mapping+of+glycomes%3A+implications+for+cancer+diagnosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Immunologic mapping of glycomes: implications for cancer diagnosis and therapy.</a> Frontiers in Bioscience. S3, 1520-1532 (2011).</li>
<li>Li, Y., Thapa, P., Hawke, D., Kondo, Y., Furukawa, K., Furukawa, K., Hsu, F. F., Adlercreutz, D., Weadge, J., Palcic, M. M., Wang, P. G., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+glycosphingolipidomics+and+NKT+cell+development+in+mouse+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus.</a> J. Proteome Res. 8 (6), 2740-2751 (2009).</li>
<li>Li, Y., Zhou, D., Xia, C., Wang, P. G., Levery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+quantitation+of+isoglobotriaosylceramide+in+the+presence+of+isobaric+components+using+electrospray+ionization-ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Sensitive quantitation of isoglobotriaosylceramide in the presence of isobaric components using electrospray ionization-ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 166-176 (2008).</li>
<li>Li, Y., Teneberg, S., Thapa, P., Bendelac, A., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+isoglobo+and+globo+series+tetraglycosylceramides+in+human+thymus+by+ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of isoglobo and globo series tetraglycosylceramides in human thymus by ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 158-165 (2008).</li>
<li>Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+permethylation+of+glycolipid%2C+and+polysaccharide+catalyzed+by+methylsulfonyl+carbanion+in+dimethyl+sulfoxide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfonyl carbanion in dimethyl sulfoxide.</a> J. Biochem. (Tokyo). 55, 205(1964).</li>
<li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simultaneous+methylation+of+fatty+and+hydroxy+fatty+acids+for+gas-liquid+chromatographic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid and simultaneous methylation of fatty and hydroxy fatty acids for gas-liquid chromatographic analysis.</a> Carbohydr. Res. 131, 209(1984).</li>
<li>Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (23), 3421-3428 (2005).</li>
<li>Levery, S. B., Hakomori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+methylation+analysis+of+glycolipids+using+capillary+gas+chromatography-chemical+ionization+mass+fragmentography+with+selected+ion+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Microscale methylation analysis of glycolipids using capillary gas chromatography-chemical ionization mass fragmentography with selected ion monitoring.</a> Methods Enzymol. 138, 13-25 (1987).</li>
<li>Spooncer, E., Fukuda, M., Klock, J. C., Oates, J. E., Dell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+polyfucosylated+lactosaminoglycan+from+human+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of polyfucosylated lactosaminoglycan from human granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 259 (8), 4792-4801 (1984).</li>
<li>Ciucanu, I., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+oxidative+degradation+during+the+per-O-methylation+of+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Elimination of oxidative degradation during the per-O-methylation of carbohydrates.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 16213(2003).</li>
<li>Platt, F. M., Neises, G. R., Karlsson, G. B., Dwek, R. A., Butters, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-butyldeoxygalactonojirimycin+inhibits+glycolipid+biosynthesis+but+does+not+affect+N-linked+oligosaccharide+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">N-butyldeoxygalactonojirimycin inhibits glycolipid biosynthesis but does not affect N-linked oligosaccharide processing.</a> J. Biol. Chem. 269 (43), 27108-27114 (1994).</li>
<li>Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Chapter 47 Structural Analysis of Glycans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMulloy%2C+B+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. , 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2009).</li>
<li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li>
<li>Zhang, H., Singh, S., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+2.+FragLib%3A+an+MSn+spectral+library%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 2. FragLib: an MSn spectral library.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6263-6270 (2005).</li>
</ol>

DZ ist ein Berater für Biotex, Houston, TX, und einem Erfinder in Patenten im Zusammenhang mit Technologien in diesem Artikel erwähnt, ausgegeben oder in Anwendung eingebunden.

Die Glykoms, ein Begriff in Analogie zu dem Genom und Proteom geprägt, bezieht sich auf alle Saccharid-Strukturen eines Organismus. Um vollständig zu verstehen, die vielfältigen Funktionen der Glykosylierung ist ein integrierter Ansatz, der sowohl funktionelle und strukturelle Glykomik Studien. Beide werden von der nicht-angetriebenen Schablone Art Glycan-Biosynthese, die resultierende Komplexität und Vielfalt der Glycanstrukturen, die häufige Beteiligung Aglykon Struktur in Modulieren Glycan Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen auf molekularer Ebene, und die funktionelle Bedeutung von geringer Häufigkeit Liganden kompliziert. Es ist allgemein anerkannt, dass Massenspektrometrie (MS) ein unverzichtbares Verfahren zur strukturellen Glykomik Studien, insbesondere zur Identifizierung und Charakterisierung niedriger Häufigkeit Liganden ist. Um Glycane oder Glycokonjugate als molekulare Spezies beobachten, wir verwenden häufig eine hocheffiziente, niedrige Energie Ionisation Methode, genannt Elektrospray-Ionisation (ESI). Für weitere detfehlte Charakterisierung Glykanstruktur, ist es wichtig, einzelne molekulare Spezies auszuwählen und brechen die Glykane in kleinere Stücke. Dies wird normalerweise durch Kollision-induzierte Dissoziation, die Aktivierung der Glycane durch Kollision mit inerten Gasmolekülen beinhaltet getan. Die erhöhte Energie induziert Bindungsbruch und systematische Analyse der resultierenden Fragmente liefert Informationen über die molekulare Struktur des Glycan. Oft können &quot;Signatur&quot;-Fragmente erzeugt werden, die für bestimmte Glykan strukturelle Merkmale diagnostischen werden. Zusammen mit der Molekularmasse können diese Fragmente manchmal ausreichend zum Identifizieren Glycane, aber in der Vergangenheit viel mehr Informationen verlangt worden, um sie vollständig zu charakterisieren, besonders wenn die Struktur neu ist. Diese Verfahren umfassen Zuckerzusammensetzung Analyse, Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Analyse von teilweise methylierten Alditolacetate für Kopplungsanalyse und spezifischen Glykosidase Verdauung 17. 18-19 gezeigt, mehrere Runden von Niedrigenergiehäusern Fragmentierung, die effektiv durchgeführt werden kann in einem Ionenfallen-Massenspektrometer (IT-MS), verbessert die Informationen Ausbeute von Glykan massenspektrometrische Analyse . Mit vier oder fünf Runden der Fragmentierung (das kann nicht mit anderen MS-Geräten durchgeführt werden), ist es möglich, isomeren Glykane, die die gleichen Zucker-Komponenten in verschiedenen Zucker-Verknüpfungen angeordnet enthalten unterscheiden, selbst wenn diese vorhanden sind zusammen in Mischungen von Komponenten mit der gleichen Molmasse (Isobaren). Für diese Analyse wurden die Glykane derivatisiert, ersetzt alle freien Hydroxylgruppen mit Methylgruppen mit Permethylierung. Während strukturelle Zuordnung der Glykane ohne Permethylierung möglich, erhöht sich die Permethylierung Empfindlichkeit 17. Levery und Zhou, haben alle potenziellen Vorteile von IT-MS Methodik, einschließlich der Ermittlung der isomeren stru kombiniertctures Verwendung Signatur diagnostische Ionen, 4 nur im MS und MS-Spektren 5 beobachtbar ist, zum hochempfindlichen Identifizierung und Quantifizierung von Glycosphingolipiden in Form mehrerer isobaren Mischungen 7-9. In der Theorie können wir in der Lage sein, jeden bestehenden Glykolipid Struktur zu identifizieren, bis die Verfügbarkeit von Standard-Glykolipide, die chemisch synthetisiert werden können. Die kritischen Schritte dieser Analyse sind die Recovery Rate von GSL aus biologischen Proben. Typischerweise 80 ug GSL kann von 100 Millionen Tumorzellen wie RBL zurückgewonnen werden. Um eine ausreichende molekulare Ionen für mehrere Runden der Fragmentierung in Ionenfallen-Massenspektrometer zu erzeugen, werden mindestens 10 Mikrogramm des Tumors GSLs erforderlich. Geringe Ausbeute von GSL während der Reinigung wird auf niedriger Häufigkeit von Ionen, die nicht zu einer weiteren Fragmentierung unterworfen werden könnten. Der Erfolg der Analyse ist abhängig von der Menge von GSL welche wiedergewonnen werden. Typischerweise Endkonz.entration der permethylierten GSLs erreichen sollte 1 mg / ml, in Methanol gelöst, bevor sie auf einem Nano-Elektrospray-Quelle analysiert. Der Grenzwert für eine gründliche Analyse MS n ist abhängig von der Häufigkeit des spezifischen Ions in MS 1 Profil. Eine typische e 7 Ionenhäufigkeit ist für eine gründliche MS 5 Analyse erforderlich. Die geringe Ausbeute von GSL während der Reinigung kann durch den Verlust von GSL während Peracetylierung Schritt (die entfernt die Phospholipide), wenn die pro-acetylierten GSLs um Florisil Harz Chromatographiesäule muss gebunden werden, gewaschen und anschließend eluiert verursacht werden. Um die Bindung von Pro-acetylierten GSLs an Silicagel zu gewährleisten, sollten die Proben zweimal in die Chromatographiesäule geladen werden nach Durchströmen.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dichlor&amp;#8211;ethan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34872</td><td>Karzinogen</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>VMR</td><td>JT9524-0</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäureanhydrid</td><td>Fluka</td><td>45830</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fischer</td><td>A18P-4</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fischer</td><td>C606-1</td><td>Karzinogen</td></tr><tr><td>DEAE Sephadex A25 (Cl-Form)</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>AB 17&amp;#8212;170-01</td><td>100 Gramm</td></tr><tr><td>Decan (wasserfrei)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>457116</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Dichloressigsäure</td><td>Sigma</td><td>D54702</td><td>Karzinogen</td></tr><tr><td>Dialyseschlauch</td><td>Fischer (Pierce)</td><td>66110</td><td>Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3–12 ml</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>20684</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäureethylester</td><td>Fischer</td><td>UN1173</td><td></td></tr><tr><td>Florisil</td><td>Fluka</td><td>46384</td><td>zur Befüllung von Chromatographiesäulen</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>EMD</td><td>HX0290-6</td><td></td></tr><tr><td>Jodmethan</td><td>Riedel de Haen, Deutschland</td><td>03810</td><td>mit Silberfolie stabilisiert, karzinogen</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR/EMD</td><td>MXO475-1</td><td></td></tr><tr><td>Neutraler Glycosphingolipid-Qualmix</td><td>Matreya</td><td>1505</td><td></td></tr><tr><td>Monosialgangliosid-Mischung</td><td>Matreya</td><td>1508</td><td></td></tr><tr><td>Disialogangliosid-Mischung</td><td>Matreya</td><td>1509</td><td></td></tr><tr><td>Lactosylceramid und sialylierte Derivate</td><td>Matreya</td><td>1510</td><td></td></tr><tr><td>Gangliotetraosylceramid und sialylierte Derivate</td><td>Matreya</td><td>1511</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur-Pipetten</td><td>Fischer</td><td>13-678-6A</td><td>9"''</td></tr><tr><td>Pyridin</td><td>Sigma</td><td>270407</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>BDH</td><td>0292</td><td>500 Gramm</td></tr><tr><td>Natriummethanolat</td><td>Sigma</td><td>404367</td><td>0,5-M-Lösung in Methanol</td></tr><tr><td>Toluol</td><td>J.T. Baker</td><td>9351-03</td><td>4 L</td></tr><tr><td>Pasteur-Pipetten</td><td>Fischer</td><td>13-678-6A</td><td>9"''</td></tr><tr><td>Glasfaser (Glaswolle)</td><td>Corning Incorporated</td><td>3950</td><td>Pyrex 9989 Glas</td></tr><tr><td>12x75 mm Glasröhrchen</td><td>Fischer</td><td>14-962-10B</td><td></td></tr><tr><td>Kalibrierte Pipetten (100 Mikroliter)</td><td>VMR</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>16x100 mm Einweg-Borosilikatgläschen x1.000</td><td>Fischer</td><td>14-961-29</td><td>Mit Schraubverschlüssen</td></tr><tr><td>Verschlüsse für Glasröhrchen</td><td>Kimble</td><td>40566C</td><td>Größe/13-415</td></tr><tr><td>Merck Dünnschichtchromatographie-Platten</td><td>Sigma</td><td>Z 29,301-6</td><td></td></tr><tr><td>Glastank für Dünnschichtchromatographie</td><td>Sigma</td><td>Z 12,619-5</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Microcaps</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>1-000-0100</td><td>10 &amp;mu;l, zum Beladen von Dünnschichtchromatographie-Proben</td></tr><tr><td>Sunrise Mikroplatten-Absorptionsmessgerät</td><td>Tecan</td><td>A-5082</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Chromatographiepapier</td><td>Fischer</td><td>05-716-3E</td><td>18 cm x 34 cm für Dünnschichtchromatographie-Tank</td></tr><tr><td>Orcinol-Eisen(III)-chlorid-Spray-Reagenz</td><td>Sigma</td><td>O7875</td><td>Zum Nachweis von Glycosphingolipiden auf Dünnschichtchromatographie-Platten</td></tr><tr><td>Prevel-Spraygerät</td><td>Sigma</td><td>Z 36,555-6</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator</td><td>Fischer</td><td>FS20</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Speedvac</td><td>Savant</td><td>AS160</td><td>Mit chemischer Falle für organische Lösungsmittel</td></tr><tr><td>MALDI-TOF-TOF-Massenspektrometer</td><td>Applied Biosystems</td><td>Proteomics 4700</td><td></td></tr><tr><td>Ionentraps-Massenspektrometer</td><td>Thermo</td><td>LTQ</td><td></td></tr></tbody></table>

massenspektrometrische analyse glycosphingolipid antigene

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glykosphingolipide (GSL die) gehören zur Klasse der Biomakromoleküle Glycokonjugat, das strukturelle Informationen für signifikante biologische Prozesse wie bei der Embryonalentwicklung, Signaltransduktion, und Immun Rezeptorerkennung 1-2 ertragen. Sie enthalten komplexe Zuckerreste in Form von Isomeren, und Lipidgruppierungen mit Variationen einschließlich Fettacyl Kettenlänge, Ungesättigtheit und Hydroxylierung. Beide Kohlenhydrat-und Ceramid Abschnitte können aufgrund der biologischen Bedeutung sein. Zum Beispiel schließen Tri-hexosylceramides Globotriaosylceramid (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) und isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), die gleich, aber unterschiedliche Molmassen Zucker-Verknüpfungen der Kohlenhydratanteil, verantwortlich für völlig unterschiedliche biologische Funktionen haben 3-4. In einem anderen Beispiel wurde gezeigt, dass eine Modifikation des Ceramid Teil alpha-Galactosylceramid, ein potenter Ligand-Agonist für Invariantenant NKT-Zellen, Änderungen ihrer Zytokinsekretion Profilen und Funktion in Tiermodellen von Krebs und Autoimmunerkrankungen 5. Die Schwierigkeit bei der Durchführung einer Strukturanalyse von Isomeren in Immun Organen und Zellen dienen als Barriere zur Bestimmung viele biologische Funktionen 6. Hier präsentieren wir eine visualisierte Version einer Methode für relativ einfache, schnelle und sensitive Analyse von Glykosphingolipid Profile in Immunzellen 7-9. Dieses Verfahren basiert auf Extraktion und chemischen Modifikation (Permethylierung, siehe unten 5A, alle OH-Gruppen der Hexose wurden durch MeO nach Permethylierung Reaktion ersetzt) ​​von Glycosphingolipiden 10-15, durch anschließende Analyse mittels Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation Time-Basis verfolgt of-Flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF/MS) und Ionenfallenmassenspektrometer. Diese Methode erfordert 50 Millionen Immunzellen für eine vollständige Analyse. Die Experimente können innerhalb einer Woche abgeschlossen sein. Die relative Häufigkeit der verschiedenen Glycosphingolipiden kann durch Vergleich mit synthetischen Standards abgegrenzt werden. Diese Methode hat eine Empfindlichkeit der Messung 1% iGb3 unter Gb3 Isomere, wenn 2 fmol des gesamten iGb3/Gb3 Gemisch vorhanden ist 9. Ionenfallenmassenspektrometer Isomeren kann verwendet werden, um zu analysieren. Zum Beispiel, um das Vorhandensein von Globotriaosylceramid und isoglobtriaosylceramide in der gleichen Probe zu analysieren, kann man die Fragmentierung der Glykosphingolipid Moleküle strukturell zwischen den beiden (siehe unten Abbildung 5) zu unterscheiden. Weiterhin verbessert die chemische Modifikation der Zuckergruppierungen (durch eine Permethylierung Reaktion) die Ionisierung und Fragmentierung Wirkungsgrade für höhere Empfindlichkeit und Spezifität, und erhöht die Stabilität der Sialinsäurereste. Die Extraktion und chemische Modifikation von Glykosphingolipiden kann in einem klassischen chemischen zertifizierten Abzug durchgeführt werden, und das kann durch Massenspektrometrie Kern durchgeführt werdenEinrichtungen mit Ionenfalle MS Instrumente.

Ein Beispiel für eine MALDI-MS-Analyse der Glycosphingolipide aus Ratten-Leukämie-Zelllinie RBL (ein Antigen präsentierenden Zelle Typ, Glycosphingolipid Antigene präsentiert NKT-Zellen), ist in 3 gezeigt. Die Ionen können bestimmten Glycosphingolipid Strukturen (3A) zugeordnet werden. In RBL-Zellen durch NB-DGJ 16, ein Medikament, das Glycosphingolipid Synthese signifikante Reduktion aller Glycosphingolipiden wurde beobachtet (Abbildung 3B) hemmt behandelt. Strukturisomeren kann nicht unterschieden werden. Die MS / MS-Kapazität des Applied Biosystems 4700 ermöglicht Fragmentierung von Ionen MS1, MS 2-Fragmente, die eine begrenzte strukturelle Information generiert. Jedoch ist MS2 Analyse oft nicht ausreicht, um Oligosaccharid Isomeren diskriminieren. Das Ionenfallen-MS-Analyse Glycosphingolipide ermöglicht die Untersuchung Isomere, wie iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) und Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer), die als die trihexosylceramide Ionen in 3A detektiert existieren können. Um solche Isomere nachzuweisen, wurden Standard iGb3 und Gb3 durch mehrere Runden von Fragmentierung analysiert, bis Unterschiede gefunden wurden (4A und 4B). In dem hier vorgestellten Beispiel (Abbildung 5C) iGb3 und Gb3 konnte durch Vergleich mit Standard-iGb3 und Gb3 diskriminiert werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig1.jpg" /> Abbildung 1. Flußdiagramm des Glycosphingolipid Extraktionsverfahren und chemische Modifikation von Glykosphingolipiden (Permethylierung). Glycosphingolipide wurden aus Zellen, die durch organische Lösungsmittel extrahiert. Um nicht Glykosphingolipide entfernen, können Lipide peracetylierten und deacetyliert. Zweitens Glycosphingolipiden chemisch wurden durch eine Permethylierung Reaktion modifiziert, verbessert die Empfindlichkeit und Spezifität der MS detection. Schließlich wurden die Glykosphingolipid Profile ermittelt mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie und Ionenfallenmassenspektrometer. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig2.jpg" /> Abbildung 2. Glycosphingolipid Quantifizierung durch Orcinol Schwefelsäure-Verfahren: Quantifizierung von Glykosphingolipiden mittels eines 0,2% Orcinol in 50% igen Schwefelsäure und einem Glukose-Eichkurve. <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3.jpg" /> Abbildung 3. Glycosphingolipidomics von Ratten-Leukämiezellen A. Repräsentative MALDI Massenspektrum;. Jedes Ion repräsentiert eine bestimmte Glycosphingolipid Struktur kann Strukturisomeren nicht unterschieden werden B. NB-DGJ, ein Medikament, das Glycosphingolipid Synthese, s hemmt.ignificantly reduziert alle Glykosphingolipide in RBL-Zellen produziert. <img alt="Abbildung 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4.jpg" /> Abbildung 4. Tandem-Massenspektrometrie von Isomeren Glycosphingolipide. A. Charakteristische Abbauwege für positive mode Ionenfallenmassenspektrometer der permethylierte GSLs Gb 3 Cer und IGB 3 Cer. Gb 3 und IGB 3 sind eindeutig durch ihre Fragmentierungsmuster getrennt. Die Unterschiede in der Verknüpfung in den MS 4 Produkt-Ionen, die mit den isobaren m / z 445 Vorläufern wider. B. Repräsentative Ergebnisse zeigt iGb3 kann in einer Mischung aus Isomeren iGb3/Gb3 gemessen werden. Sterne bedeuten diagnostischen Ionen für iGb3 nur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um</a>eine größere Abbildung. <img alt="Abbildung 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5.jpg" /> Abbildung 5. Ion Trap MS ermöglicht die Analyse von Isomeren Glykosphingolipide. A. Standard iGb3 und Gb3 Show Differenz von Fragmentierung Profil nach 4 Runden Fragmentierung in einer Ionenfalle LTQ Massenspektrometer. B. Charakteristisch MS 4 Profil von Ionen aus iGb3 oder Gb3. C. abgeleitet Trihexosyleramides sind Mischungen aus iGb3 und Gb3 Isomere, die durch die Ionenfalle MS-Methode (Abbildung von Dapeng Zhou) identifiziert werden können. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

Eine spezifische und sensitive Methode, um Einblick in die Expression von Glykosphingolipid Antigene Immunsystem Organe und Zellen zu gewinnen beschrieben. Das Verfahren nutzt die Ionenfallenmassenspektrometer ermöglicht stufenweise Fragmentierung Glycosphingolipid Moleküle zur Strukturanalyse gegenüber chemisch synthetisierten Standard.

Massenspektrometrische Analyse Glycosphingolipid Antigene

Glykosphingolipide (GSLs) gehören zur Klasse der Glykokonjugate der Biomakromoleküle, welche Strukturinformationen für bedeutende biologische Prozesse tragen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine spezifische und empfindliche Methode zu entwickeln, um Einblicke in das Expressionsprofil von Glykolipid-Fett-Antigenen in Immunorganen und -zellen zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst die Glykolipide aus den Zellen extrahiert werden. Im zweiten Schritt erfolgt die Trennung neutraler Glykolipide von sauren Glykolipiden.Nachdem die Phospholipide von den neutralen Lipiden entfernt wurden, werden die extrahierten Glykolipide chemisch modifiziert, indem eine Perm-Methylierungsreaktion durchgeführt wird, bei der alle Hydroxylgruppen der Hexosen durch Methoxygruppen ersetzt werden. Schließlich werden die extrahierten Glyko-Finger-Lipide mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorptions-Ionisation, Time-of-Flight-Massenspektrometrie, abgekürzt MALDI-TOF-MS, und Ionentrapspektrometrie analysiert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie analytischer HPLC und Antikörperfärbung besteht darin, dass die Massenspektrometrie empfindlicher ist und genaue Molekülmassen misst.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Immunologie beantworten, beispielsweise die Messung geringer Mengen glykolipidischer Antigene. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Therapie oder Diagnose von Krebserkrankungen, da viele glykolipidische Antigene wie GD2 und globales H als Krebsbiomarker exprimiert werden. Ich werde die Durchführung des Verfahrens als Bachelorstudent aus dem Labor von Professor DA pen Zoe demonstrieren.Dr. David Hawk wird Eingriffe an den Massenspektrometrie-Instrumenten durchführen. Bevor Sie dieses Verfahren beginnen, bereiten Sie Ratten-Basophilie-Leukämiezellen vor, indem Sie die Zellen mit einem Hämozytometer zählen. Nach der Anfärbung mit Trypanblau sollte die Zellviabilität höher als 95 % betragen. Extrahieren Sie die Lipide, indem Sie zunächst sechs Milliliter eines 1:1-Volumenverhältnisses aus Chloroform und Methanol zu den Zellen hinzufügen.Verwenden Sie eine intensive Beschallung für ein bis zwei Stunden mit dem Gemisch aus polaren und unpolaren Lösungsmitteln. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal mit einem volumetrischen Verhältnis von 55 zu 25 zu 20 aus Isopropanol, Hexan und Wasser, das wie in der schriftlichen Anleitung beschrieben hergestellt wurde, als endgültige Extraktion. Geben Sie sechs Milliliter Chloroform und Methanol hinzu und führen Sie anschließend eine Beschallung durch.Im Anschluss an die Beschallung erfolgt eine Zentrifugation, um das unlösliche Material bei 4.000 U/min fünf Minuten lang zu pelletieren. Ziehen Sie die Senna ab, bevor Sie sie vier Stunden im Speed-Vac trocknen. Um neutrale von sauren Lipiden zu trennen, verwenden Sie eine Anionenaustauschchromatographie an einer kleinen Säule mit de A e sedex A 20.Nach der Vorbereitung des DEAE SEDEX A 25 gemäß der schriftlichen Anleitung, die diesem Video beiliegt, bereiten Sie die Säule unter Verwendung einer Glaswand und einer neun Zoll langen Pasteur-Pipette vor. Befüllen Sie die Glaswand vorsichtig, damit kein Harzpulver durch die Säule gelangt. Geben Sie DEAE SEDEX A 25-Harz in den Hals der neun Zoll langen Pasteur-Pipette, ohne dass die Säule austrocknet.Stellen Sie sicher, dass sich kein Harz im Eent befindet. L&ouml;sen Sie die Lipide durch Beschallen auf und resuspendieren Sie sie in einem volumetrischen Verh&auml;ltnis von 30 zu 60 zu 8 aus Chloroform, Methanol und Wasser. Geben Sie die gel&ouml;sten Proben auf die S&auml;ule. Die neutralen Lipide laufen durch die S&auml;ule, w&auml;hrend die geladenen Lipide in der S&auml;ule zur&uuml;ckbleiben. Eluieren Sie den sauren Lipidanteil mit acht Milliliter Natriumacetat in Methanol.Hier gezeigt ist die getrocknete negativ geladene Fraktion nach Behandlung mit Natriumacetat. Entsalzen Sie die Fraktionen durch Dialyse unter Verwendung der Slide-Eliza-Dialysekassette. Trocknen Sie die Fraktionen im Vakuumtrockner (Speed-Vak) vor der vorläufigen Analyse der Lipide mittels Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie oder HPTLC. Um HPTLC durchzuführen, lösen Sie die isolierten neutralen Glykoglycerolipide oder GSL in 200 Mikroliter eines chloroform-methanolischen Lösungsmittels im volumetrischen Verhältnis 1:1.Tragen Sie die Probe auf eine Dünnschichtchromatographie-Platte aus Kieselgel auf. Führen Sie die Platten nach dem Trocknen in einem volumetrischen Verhältnis von 60 zu 35 zu 8 aus Chloroform, Methanol und Wasser. Visualisieren Sie die Glykolipide mit Arsalsäure-Schwefelsäure bei 300 Grad Celsius für saure Lipide oder Ganglioside.Verwenden Sie ein Volumenverhältnis von 55 zu 25 zu 20 aus Isopropanol, Hexan und Wasser als Lösungsmittel und führen Sie die H-P-T-L-C auf die gleiche Weise durch. Zu diesem Zeitpunkt enthält die neutrale Fraktion nicht nur neutrale Glyko-Finger-Lipide, sondern auch Phospholipide, die durch eine Acetylierung und para-Acetylierungsreaktion entfernt werden müssen. Trocknen Sie zunächst die DEAE-Sedex-A-25-Durchlauf-Fraktion vier Stunden lang im Speed-Vac unter Kühlung. Nachdem die Proben trocken sind, stellen Sie sie erneut in den Speed-Vakuumtrockner und trocknen sie weitere vier Stunden. Stellen Sie sicher, dass diese Proben vollständig trocken sind, da jegliches Restwasser die p-Acetylierungsreaktion verhindern würde. Geben Sie ein Milliliter Pyridin und 0,5 Milliliter Essigsäureanhydrid zu den Proben hinzu, um die p-Acetylierungsreaktion von bis zu 200 Mikrogramm Glykolipiden durchzuführen, die über Nacht bei 37 Grad Celsius im Dunkeln inkubiert werden.Eine Temperatur, bei der die GSL besser sind, um ein Milliliter Toluol hinzuzufügen, um die vollständige Verdampfung sicherzustellen, und das parazitierte Material drei Stunden im Speed-Vac trocknen. Falls die Proben noch nicht vollständig trocken sind, das Speed-Vac so lange fortsetzen, bis sie trocken sind; hier ist die getrocknete paracetische Probe dargestellt. Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine Florisil-Säule vor, indem Sie die Florisil-Kügelchen zunächst vollständig trocknen, indem Sie sie in einem Ofen bei 110 Grad Celsius inkubieren.Danach die Säule in einer Pasteurpipette mit Glaswolle vorbereiten, indem die Kügelchen bis zum Ansatz in die Pasteurpipette gefüllt und in einem volumetrischen Verhältnis von vier zu eins mit Dichloräthan/Hexan equilibriert werden. Die Elution aus der Säule erfolgt sehr schnell. Aufgrund der hohen Flüchtigkeit der Lösungsmittel kann es zum Austrocknen der Säule kommen. Daher sollten alle Lösungsmittelgemische vor dem Durchlaufen der Säule vorbereitet werden.Da es nicht möglich ist, die Säule während der Elution anzuhalten, wird die Probenmenge in einem Milliliter auf ein volumetrisches Verhältnis von vier zu eins aus Dichloräthan und Hexan aufgetragen. Die Säule wird mit sechs Millilitern des gleichen Lösungsmittels, gefolgt von zehn Millilitern Dichloräthan, ausgewaschen.Das neutrale Percet-GSL mit sechs Millilitern eines Volumenverhältnisses von eins zu eins aus 1,2-Dichloraceton entfetten. Dieser Schritt entfernt die Percet-Phospholipide von den Glyko-Finger-Lipiden, da die Percet-Glyko-Finger-Lipide an die Fluorol-Säule binden, während Percet-Phospholipide dies nicht tun. Nach dem Eindampfen der Fraktionen im Speed-Vakuum für zwei Stunden erfolgt die Deacetylierung mit zwei Millilitern 0,5-molarer Natriummethoxid-Lösung und zwei Millilitern Methanol für drei Stunden bei Raumtemperatur.Nach der Inkubation das Gemisch mit drei Millilitern Methanol neutralisieren, Essigsäure hinzufügen und durch Eindampfen im Vakuum trocknen. Dialysieren Sie das Produkt, indem Sie die getrockneten Produkte in drei Milliliter Wasser lösen und in die Slide-A-Lyzer-Dialysekassette injizieren, gefolgt von einer Dialyse gegen Wasser für 24 Stunden, wobei das Wasser mindestens zweimal gewechselt wird. Trocknen Sie das dialysierte GSL durch Vakuumtrocknung, bis die Proben vollständig trocken sind. Für die Perm-Methylierung geben Sie zunächst GSL in ein Glasröhrchen mit Schraubverschluss und Teflon-Einlage und fügen 150 Mikroliter Dimethylsulfoxid hinzu, ohne spezielle Trockenbedingungen oder eine Inertgasatmosphäre im Abzug zu verwenden. Bereiten Sie pulverisiertes Natriumhydroxid aus Natriumhydroxid-Partikeln vor, indem Sie diese in einem Mörser mit einem Pistill zerkleinern. Geben Sie anschließend das Natriumhydroxid-Pulver mit einem Spatel zur Probenlösung hinzu.Anschließend 80 µL IO-Methan mit einer 100-µL-Hamilton-Spritze zugeben. Nach dem Abbrechen der Methylierungsreaktion durch Zugabe von zwei Millilitern Wasser die Mischung eine Stunde bei Raumtemperatur schütteln und die permethylierten Produkte durch Zugabe von zwei Millilitern Dichlormethan extrahieren. Glykolipide befinden sich in der Dichlormethan-Phase, die die untere Phase darstellt, sodass die obere Phase in ein neues Glasröhrchen überführt werden kann.Die permethylierten Produkte können anschließend insgesamt dreimal mit Chloromethan erneut extrahiert werden. Waschen Sie die vereinigten Dichlormethan-Extrakte dreimal mit je zwei Milliliter Wasser, wobei nach jedem Waschschritt die obere wässrige Phase verworfen wird. Nach dem letzten Waschgang überführen Sie die Proben in ein neues Gefäß und trocknen sie. Mithilfe eines Speed-Vac können die Proben danach in 100 bis 200 Mikroliter Methanol gelöst und einer Massenspektrometrie-Analyse unterzogen werden. Wie im schriftlichen Verfahren beschrieben, wurden die Proben der Proteomik-Einrichtung des University of Texas MD Anderson Cancer Center übermittelt und mittels MALDI-MS/MS-Massenspektrometer sowie einem Ionentrap-LTQ-Massenspektrometer analysiert.Hier ist ein Beispiel der MALDI-MS-Analyse der Glyko-Finger-Lipide aus der Ratten-Leukämiezelllinie RBL gezeigt, einem Typ von antigenpräsentierenden Zellen, der Glyko-Finger-Lipid-Antigene an NKT-Zellen präsentiert. Die Ionen können spezifischen Glyko-Finger-Lipid-Strukturen in RBL-Zellen zugeordnet werden, die mit einem Wirkstoff behandelt wurden, der die Synthese von Glyko-Finger-Lipiden hemmt. Eine signifikante Abnahme aller Glyko-Finger-Lipide wurde beobachtet.Strukturelle Isomere können nicht unterschieden werden. Die MS/MS-Kapazität des verwendeten Biosystems 4700 ermöglicht die Fragmentierung von MS1-Ionen zu MS2-Fragmenten, wodurch begrenzte strukturelle Informationen gewonnen werden können. Die MS2-Analyse reicht jedoch oft nicht aus, um Oligosaccharid-Isomere zu unterscheiden, während die Ionentrapping-MS-Analyse von Glykofingerlipiden die Untersuchung von Oligosaccharid-Isomeren ermöglicht, um solche Isomere nachzuweisen.Standard-IGB3 und GB3 wurden durch mehrere Fragmentierungsrunden analysiert, bis Unterschiede wie in dieser charakteristischen Darstellung gezeigt gefunden wurden. MS4-Profile von Ionen, die aus IGB3 oder GB3 stammen, wenn verschiedene Verhältnisse von IGB3 und GB3 gemischt werden. Eine Standardkurve kann basierend auf der Ionenintensität charakteristischer Ionen, die von jedem Isomer stammen, erstellt werden. In dem hier dargestellten Beispiel konnten IGB3 und GB3 durch Vergleich mit den Referenzstandards unterschieden werden.Dieses Spektrum stellt die MS4-Analyse von 1 3 2 5 dar, wobei das molekulare Eisen IMRs der GB drei- und IGB drei-Signaturionen für IGB drei sowie Signaturionen für GB drei repräsentiert, was auf das Vorhandensein eines Gemischs der beiden Isomere hindeutet. Das Verhältnis von IGB drei zu GB drei wurde durch Vergleich mit einer Standardkurve berechnet. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Glykolipide während der Chromatographie vollständig zurückzugewinnen, bevor die Pro-Methylierung der Glykolipide erfolgt.Stellen Sie sicher, dass mindestens 80 Mikrogramm Glykolipide während der Reinigung zurückgewonnen werden. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Glykolipide mittels einer halbquantitativen Massenspektrometrie-Methode analysiert werden können. Sie werden die wichtigsten Schritte der Glykolipid-Extraktion, Trennung in neutrale und saure Fraktionen, Modifikation durch die Perm-Methylierungsreaktion sowie die Einreichung der modifizierten Glykolipide an Ihre Massenspektrometrie-Einrichtung beherrschen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Dichlorethan, Chloroform, Chloressigsäure und Iodmethan äußerst gefährlich sein kann, da diese Stoffe karzinogen sind. Es sollten stets Schutzmaßnahmen wie Handschuhe und Laborkittel getroffen werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird. Beachten Sie die Sicherheitsregeln und genießen Sie Ihre Entdeckung.

mass-spectrometric-analysis-of-glycosphingolipid-antigens

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Mit Hilfe spezifischer Glycosidasen um Zucker aus Glykoproteinen, die durch SDS-PAGE gefolgt zu entfernen, ist eine wertvolle Methode, um glycan Modifikationen am Protein-Proben erkannt und ist eine gute Wahl für die erste Glykobiologie Studien. Veränderungen nach Deglykosylierung kann als Verschiebungen in Gel-Mobilität oder durch Färbung mit glycan empfindliche Reagenzien nachgewiesen werden.

Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Glykosylierung mit speziellen Endo-und Exoglycosidasen

Um die Vielfalt von O-verknüpften Glykanen umfassend zu erforschen, wird ein neues Verfahren zur reduktiven In-Gel-β-Eliminierung, kombiniert mit Permethylierung und einer schnellen Phasenteilungsmethode, auf die Analyse von O-verknüpften Glykanen angewendet, die direkt von Glykoproteinen freigesetzt werden, die durch SDS-PAGE aufgelöst wurden und für eine anschließende glykomische Analyse mittels Massenspektrometrie zugänglich sind.

Verbesserte In-Gel-reduktive β-Elimination für umfassende O-gebundene und Sulfo-Glykomik durch Massenspektrometrie

Dieser Artikel stellt eine verbesserte Form einer neuartigen Bottom-up-Glykomics-Technik vor, die entwickelt wurde, um das gepoolte Zusammensetzungsprofil von Glykanen in unfraktionierten Bioflüssigkeiten durch die chemische Zerlegung von Glykanen in ihre konstituierenden bindungsspezifischen Monosaccharide für den Nachweis durch GC-MS zu analysieren. Mögliche Anwendungen sind die Früherkennung von Krebs und anderen glykan-affektiven Störungen.

Glycan Knoten Analyse: Ein Bottom-up-Ansatz Glycomics

Dieses Papier beschreibt eine Methodik kardiovaskuläre Gewebeproben für die MS-Analyse herzustellen, das für (1) die Analyse der Proteinzusammensetzung ECM ermöglicht, (2) die Identifizierung von Glykosylierungsstellen, und (3) der Zusammensetzungs Charakterisierung von Glycan Formen. Diese Methodik kann mit geringfügigen Modifikationen angewandt wird, zum Studium des ECM in anderen Geweben.

Glycoproteomics der extrazellulären Matrix: eine Methode zur Intact Glycopeptidthioestern Analyse unter Verwendung von Massenspektrometrie

Sialinsäure Säure ist eine typische Monosaccharid-Einheit in Glykokonjugate gefunden. Es ist in einer Vielzahl von molekularen und zellulären Interaktionen beteiligt. Hier präsentieren wir eine Methode zur Zelle Oberfläche Sialinsäure Säure Ausdruck mit metabolischen Glykan mit N- Acetylmannosamine Derivate zu ändern.

Metabolische Glykan der Sialinsäure Säure mit N-Acyl-Mannosamines geändert

Ein Sialoglycan-Mikroarray-Assay kann verwendet werden, um Anti-Neu5Gc-Antikörper in menschlichen Seren zu bewerten, was es zu einem potentiellen Hochdurchsatz-Diagnosetest für Krebs und andere chronisch entzündungsvermittelte menschliche Krankheiten macht.

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in menschlichen Seren mit einem Sialoglycan-Microarray-Assay

Dieses Protokoll beschreibt die Glykomics-gesteuerte Glykoproteomics-Methode, eine integrierte Omics-Technologie, die umfassende Einblicke in das heterogene Glykoproteom in komplexen Tumormikroumgebungen bietet, die für ein besseres Verständnis der Glykobiologie von Krebserkrankungen erforderlich sind.

Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik ermöglicht eine umfassende Profilierung des Glykoproteoms in komplexen Tumormikroumgebungen 

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Freisetzung von O-Glykanen aus Muzinen und die anschließende Entsalzung, Permethylierung und Analyse mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie vor.

Profilierung von permethylierten Mucin-O-Glykanen mittels matrixgestützter Laserdesorption/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie

Es wurde ein Protokoll für die Präparation gereinigter Mitochondrien aus Mikrogliazellen, die Isolierung mitochondrialer Proteine für die Freisetzung von N-Glykanen und den schnellen Nachweis subzellulärer, mitochondrialer Glykane mittels Infrarot-Matrix-unterstützter Laserdesorptions-Elektrospray-Ionisation in Verbindung mit hochauflösender präziser Massenanalysator-Massenspektrometrie entwickelt.

Mitochondriales Präparat aus Mikroglia für die Glykananalyse

Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte, um eine rigorose und reproduzierbare Messung sowohl von Glykogen- als auch von N-gebundenen Glykanen mittels Massenspektrometrie-Bildgebung zu ermöglichen.

Räumliche molekulare Bildgebung des Glycomes mittels Massenspektrometrie

Erfahren Sie die massenspektrometrische Analyse von Glycosphingolipid-Antigenen in Immunzellen. Diese Methode ermöglicht die hochsensitive Detektion niedrig konzentrierter Glykolipide für die immunologische Krebsforschung.

Massenspektrometrische Analyse Glycosphingolipid Antigene

Weitere Videos entdecken