Name: Die Kombination von Doppel-Fluoreszenz In Situ Die Hybridisierung mit Immunmarkierung für Nachweis der Expression von drei Gene in Mäusehirnschnitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Lernen Sie die doppelte Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung mit Immunmarkierung zur gleichzeitigen Detektion von drei Genen in Mäusehirnschnitten. Diese Methode ermöglicht die präzise Lokalisierung von Genexpression in spezifischen Zelltypen.

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Die Arbeit in den Laboratorien der Autoren wurde vom UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 und BB/L003236/1), dem Wellcome Trust (WT100269MA) und dem Europäischen Forschungsrat (ERC, "Ideas" Programme 293544) unterstützt. SJ wurde durch ein EMBO-Langzeitstipendium unterstützt. Die Autoren danken Stephen Grant für seine technische Unterstützung.

Ethik-Statement: Maushaltung und Handhabung sind in Übereinstimmung mit dem britischen Home Office Vorschriften und UCL Ethikkommission Leitlinien, die Einhaltung der Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 des Vereinigten Königreichs und der Änderung der Verordnungen 2012. HINWEIS: Alle Lösungen sollten mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) hergestellt werden - behandelte Wasser restliche RNase zu zerstören. Für DEPC Behandlung, fügen DEPC (1 ml pro Liter), kräftig schütteln, bis alle DEPC Globuli verschwunden sind dann im Autoklaven die DEPC abzubauen. 1. RNA-Sondensynthese <ol><li> ACHTUNG: Bei der Formamid Handhabung Persönliche Schutzausrüstung (PSA) und ein Sicherheitsgehäuse. Bereiten Hybridisierungspuffer: DEPC-behandeltem deionisiertes Wasser mit 50% (v / v) entionisiertes Formamid, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH 2 PO 4, 5 mM Na 2 HPO 4, 0,01 mg / ml Hefe-tRNA, 1 × Denhardt-solution und 10% w / v Dextran-Sulfat. </li><li> Wählen Sie eine DNA-Klon, der die cDNA-Sequenz des Gens von Interesse in einem Plasmid mit RNA Polymerase-Promotoren enthält. Für dieses Beispiel verwenden , um ein pCMV-SPORT6 Klon, IRAVp968C0654D (Genbank accessionBC024934), mit T7 und SP6 - RNA - Polymerase - Promotoren für Aspa (Supplementary Abbildung 1). </li><li> Bereiten linearisierte Plasmid-DNA als Matrize. <ol><li> Wachsen, um die DNA-Klons, extrahieren, die das Plasmid mit einem Plasmid Purification Kit kleinräumige gemäß dem Protokoll des Herstellers und die Sequenz mit dem T7 und Sp6 universellen Primer. </li><li> Digest 1.020 ug Plasmid-DNA mit einem Restriktionsenzym, das am 5&#39;-Ende des Sense-Strangs der cDNA schneidet. Für dieses Beispiel verwenden 100 Einheiten Sal I das pCMV-SPORT6- Aspa Plasmid zu verdauen. Inkubieren für 1,5 Stunden bei 37 ° C </li><li> Führen Sie einen kleinen aliquoten auf einem Agarose-Gel zu überprüfen, dass das Plasmid vollständig linearisiert. </li></ol></li><li> Reinige dielinearisierten Plasmids mit Phenol-Chloroform verwendet. <ol><li> Hinzufügen 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat, ein Volumen von 10 mM Tris HCl (pH 8,0) - äquilibriert Phenol und einem Volumen Chloroform / Isoamylalkohol (IAA) (24: 1). </li><li> Zentrifuge bei 16.000 × g für 1 min bei RT (20 - 25 ° C, RT) und Extrahieren obere wässrige Phase. </li><li> Hinzufügen einem Volumen Chloroform / IAA, Zentrifuge bei 16.000 × g für 1 min und die obere wässrige Phase zu extrahieren. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.4.3. </li><li> Fügen Sie 2 Volumen Ethanol und lassen bei -20 o C für 1 h oder O / N. </li><li> Zentrifuge bei 16.000 × g bei 4 ° C für 10 min. Überstand verwerfen. </li><li> Waschen des Pellets mit 70% kaltem Ethanol und resuspendieren in approximativ 1 ug cDNA pro 2,5 &amp; mgr; l in TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5). </li></ol></li><li> Synthesize die beiden Sonden ein, markiert mit Digoxigenin (DIG) und die andere mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC). <ol><li> Wählen Sie die entsprechende RNA-Polymerase die anti-se zu machennse Sonde (komplementär zu der Ziel-mRNA). In diesem Beispiel verwenden T7 RNA Polymerase Aspa Sonde zu machen. </li><li> Bereiten Sie in vitro Transkriptionsreaktion: add 1 ug linearisierter DNA, 4,0 ul 5 x Transkriptionspuffer, 6,0 ul 100 mM DTT, 2,0 ul 10x DIG oder FITC RNA Markierungsmischung enthält dNTPs, 1 ul RNase - Inhibitor und 20 bis 40 Einheiten der RNA-Polymerase; machen das endgültige Volumen von bis zu 20 &amp; mgr; l mit DEPC-behandeltem Wasser. </li><li> Inkubieren bei 37 o C für 1,5 Std. </li></ol></li><li> Run1 ul der Transkriptionsreaktion auf einem 1,0% igen Agarose-Gel zu überprüfen, ob die Reaktion gearbeitet hat. Das Gel sollte die lineare Vorlage und eine helle Band der Sonde zeigen. </li><li> Machen Sie das Volumen bis zu 100 &amp; mgr; l mit Hybridisierungspuffer und Speichern von 10 ul Aliquots bei -80 ° C. </li></ol> 2. Perfusions, Fixierung und Gewebeentnahme <ol><li> ACHTUNG: Beim Umgang mit Paraformaldehyd (PFA), sowohl feste als auchwässrige, tragen PPE und ein Sicherheitsgehäuse. Bereiten Formaldehydlösung durch Lösen von 4% (w / v) PFA in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) -Lösung unter Verwendung von Wärme (55 ° C). Filtern Sie die Formaldehydlösung mit Filterpapier. </li><li> Bereiten Saccharoselösung durch Auflösen von 20% (w / v) Saccharose in destilliertem Wasser und mit 0,1% (v / v) DEPC-Lösung. Lassen Sie O / N bei RT mit einem losen Deckel und dann Autoklaven. </li><li> Unheilbar betäuben eine Maus durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (50 mg / kg). Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch Zehe Prise und das Fehlen von Entzugs Reflex zeigt tiefe Narkose. </li><li> Sobald die Maus unter tiefer Narkose ist, machen einen Schnitt unterhalb des Brustkorbs und durch den Brustkorb auf beiden Seiten abgeschnitten, sie heben das Herz aussetzen. </li><li> Legen Sie eine 25-G-Nadel in den linken Ventrikel des Herzens. Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof des Herzens. </li><li> Perfuse das Tier mit 20 ml PBS und dann 40 ml Formaldehydlösung. Für P30 und älterMäuse, verwenden Sie eine Perfusions-Rate von 12 ml / min, aber für jüngere Tiere verwenden, um eine niedrigere Rate (7 bis 10 ml / min). </li><li> Präparieren Sie das Gehirn. <ol><li> Sever mit der Maus den Kopf mit einer chirurgischen Schere durch einen Schnitt posterior von den Ohren zu machen. Machen Sie einen Schwanzmittelschnitt in der Haut und arbeiten rostral die Haut von Schädel zu entfernen. </li><li> Ausgehend von der Schwanzteil, schneiden durch die Oberseite des Schädels entlang der Mittellinie und zwischen den Augen mit Iris Schere. Entfernen Sie die parietalen und frontalen Knochenplatten von einer Seite einer Knochenplatte Kippen jedes Mal, und schnappen sie mit einer Pinzette aus. </li><li> Kippen Sie vorsichtig das Gehirn nach oben von dem vorderen Teil mit einer Pinzette und schneiden Sie die Sehnerven und andere Hirnnerven. Heben Sie das Gehirn aus dem Schädel. </li></ol></li><li> Legen Sie das Gehirn in eine Maus koronalen Hirn Matrix. Schneiden Sie das Gehirn in 3 etwa 4 mm Stücke mit einer Feder Rasierklinge. </li><li> Übertragen Sie die Scheiben in 4% PFA-Lösung und Inkubation O / N bei 4 ° C. </li><li> Transfer GehirnScheiben bis 20% Saccharoselösung DEPC-behandeltem und O / N bei 4 ° C inkubieren </li><li> Legen Sie jedes Gehirn Scheibe in einem trockenen cryomould, umgeben mit optimale Schnitttemperatur (OAT) Medium und frieren auf Trockeneis. Bei -80 ° C. </li></ol> 3. Kryoschneiden <ol><li> Cut 15 &amp; mgr; m Abschnitte von gefrorenem Gewebe in einem Kryostaten und sammeln die Schnitte auf Objektträger. Bei Bedarf benetzen die Abschnitte mit DEPC-PBS und glätten sie mit einem feinen Pinsel. </li><li> Lassen Sie die Folien für etwa 1 Stunde trocknen, um sicherzustellen, dass das Gewebe auf dem Objektträger anhaftet. </li></ol> 4. Die Hybridisierung <ol><li> Vorbereitung 65 ° C Waschpuffer: 150 mM NaCl, 15 mM Na 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= 1x saline Natriumcitrat), 50% (v / v) Formamid und 0,1% (v / v) Tween- 20. </li><li> Bereiten MABT Puffer: 100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, 0,1% (v / v) Tween-20, pH 7,5. </li><li> Verdünnen Sie die beiden Sonden (DIG-markierten und FITC-labelled) 1 / 1.000 in Hybridisierungspuffer vorgewärmt auf 65 ° C und gut mischen. </li><li> Bewerben um 300 ul Hybridisierungsmischung auf jeder Folie, coverslipwith Ofen gebacken (200 ° C) Deck und Inkubation O / N bei 65 ° C in einer befeuchteten Kammer. </li><li> Die Objektträger in eine Coplin-Gefäß vorgewärmten Waschpuffer enthält. Waschen der Objektträger 30 min zweimal bei 65 ° C mit Waschpuffer. </li><li> Waschen Sie die Objektträger für 10 Minuten dreimal mit MABT bei RT. </li></ol> 5. Visualisierung des FITC-Sonde <ol><li> Vorbereitung ISH Blockierungspuffer: MABT mit 2% Blockierungsreagenz und 10% Hitze-inaktiviertes Schafserum. </li><li> Optional: eine hydrophobe Stift Kreise um die Gewebeabschnitte auf der Folie zeichnen das Volumen der Antikörperlösungen zu reduzieren. </li><li> Inkubieren der Objektträger für 1 h bei RT mit ISH-Puffer in einer befeuchteten Kammer blockiert. </li><li> Inkubieren Sie die Dias O / N bei 4 ° C mit einem Meerrettich-Peroxidase (POD) - Konjugatd anti-FITC-Antikörper Blockierungspuffer 1/500 (v / v) in ISH verdünnt. </li><li> Legen Sie die Folien in eine Coplin Gefäß mit PBS mit 0,1% (v / v) Tween-20 (PBST). 3 x waschen für 10 min in PBST und ersetzen mit frischem PBST jedes Mal. </li><li> Unmittelbar vor dem Gebrauch bereiten die fluoreszierende Tyramidesters durch 100-mal in die Amplification Verdünnungsmittel verdünnt wird. Für dieses Beispiel verwenden FITC-Tyramidesters. </li><li> Fügen Sie diese auf den Schlitten und lassen für 10 min bei RT. </li><li> Legen Sie die Folien in eine Glasküvette und waschen 3 Mal in PBST 10 min. </li></ol> 6. Visualisierung der DIG-Sonde <ol><li> Bereiten 0,1 M Tris- HCl pH-Wert 8,2. </li><li> Inkubieren der Objektträger mit ISH Blockierungspuffer für 1 Stunde bei RT. </li><li> Inkubieren der Objektträger O / N bei 4 ° C mit einer alkalischen Phosphatase (AP) -konjugiertem anti-DIG-Antikörper, verdünnt 1 / 1.500 (v / v) in ISH Blockierungspuffer. </li><li> Waschen Sie mit MABT für 10 Minuten dreimal. </li><li> Wasche zweimal mit 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 für 5 min bei RT. </li><li>Unmittelbar vor der Verwendung vorbereitet Fast Red-Lösung, indem die Tabletten in 0,1 M Tris pH 8,2 gelöst wird. Filtern der Lösung durch einen 0,22 um-Filter. </li><li> Inkubieren der Objektträger bei 37 ° C mit Fast Red-Lösung in einer befeuchteten Kammer. Da die Zeit für eine optimale Entwicklung variiert, überprüfen Sie die Dias regelmäßig mit einem Fluoreszenzmikroskop die Bildung von Niederschlag zu überwachen. Für dieses Beispiel Die Reaktion nach 2 - 3 Stunden. </li><li> Waschen mit PBST 10 min dreimal. </li></ol> 7. Immunhistochemie <ol><li> Bereiten IHC Blockierungspuffer: 10% (v / v) Serum (von einer anderen Spezies zu primärem Antikörper Host) in PBST. </li><li> Inkubiere Objektträger mit IHC-Puffer für 1 Stunde bei RT in einer feuchten Kammer blockiert. </li><li> Bereiten primäre Antikörper: den primären Antikörper bei einer geeigneten Verdünnung in PBST mit 5% Serum verdünnt (von einer anderen Spezies zu primärem Antikörper Host). Für dieses Beispiel verwenden, um ein Kaninchen-Anti-Olig2 Antikörper bei 1/400 (v / v) Verdünnung. </li><li>Inkubieren in der primären Antikörperlösung bei 4 ° CO / N. </li><li> Waschen mit PBST 10 min dreimal. </li><li> Bereiten sekundären Antikörper: Verdünnen ein Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper bei einer geeigneten Verdünnung in PBST mit 5% (v / v) Serum (von einer anderen Spezies zu primärem Antikörper host) und 0,1% (v / v) Hoechst 33258. Für dieses Beispiel Gebrauch ein Esel-anti-Kaninchen-Alexa647 sekundären Antikörper bei 1 / 1,000 (v / v) Verdünnung. </li><li> Inkubieren in der sekundären Antikörperlösung bei RT für 1 Std. </li><li> Waschen mit PBST 10 min dreimal. </li></ol> 8. Montage <ol><li> Trocknen teilweise die Folien bei RT und Halterung mit einem Fluoreszenz-Eindeckmedium. Lassen Sie die Folien Bild, um zu trocknen und dann in einem konfokalen Mikroskop unter 10X, 20X und 63X Ziele unter Verwendung von 4 verschiedenen Kanälen mit den folgenden Anregungswellenlängen: 570 nm für Fast Rot, 488 nm für FITC, 647 nm für Olig2 Immunmarkierung und 350 nm für Hoechst . </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Dieses Protokoll stellt eine Schritt- für -Schritt - Verfahren für ein Doppel RNA in situ Hybridisierung von Immunfärbung gefolgt. Wir haben dieses Protokoll verwendet , um zu bestätigen , dass Aspa in reifen Oligodendrozyten in mehreren Bereichen des Gehirns exprimiert wird . Diese mehrstufigen Verfahren hat viele potenzielle Gefahren, die Empfindlichkeit beeinflussen können und sollten vermieden werden. Zuerst werden alle Lösungen und Speicherpuffer für die Transkriptions...

Gliazellen, die die am häufigsten vorkommenden Zellen im zentralen Nervensystem (ZNS) sind, umfassen Oligodendrozyten (die myelinisierenden Zellen von ZNS), Oligodendrozyten Vorläufern (OPs, die auch als &quot;NG2 cells&quot; bekannt), Astrozyten und Mikroglia. Es gibt in den Funktionen von Gliazellen und ihre mögliche Rolle bei neurologischen Krankheiten 1 wachsendes Interesse. Zum Beispiel Canavan - Krankheit (CD) ist eine erbliche früh in der Kindheit beginnen neurodegenerative Erkrankung mit spongiformen Leukodystrophie und einem fortschreitenden Verlust von Nervenzellen, die zum Tode führen in der Regel vor 10 Jahren 2,3. Mutationen im Aspartoacyclase (ASPA) Gen , das drastisch führen zu einer verminderten Aktivität ASPA 4 in CD identifiziert worden. ASPA ist ein Enzym , das Deacetylierung von N-Acetylaspartat (NAA) Katalysieren, ein Molekül stark in Gehirn konzentriert, Erzeugen Acetat und Aspartat 5-7. Viele CD-Patienten zeigen eine höhere NAA wegen des Mangels an ASPA acvität. Einige Studien spekulieren , dass NAA abgeleitete Acetat eine wichtige Quelle von Fettsäuren / Lipiden im Gehirn während der Entwicklung sein könnte und CD können sich aus Myelinsynthese vermindert während durch den Ausfall von NAA verursacht Entwicklung 3,5,6 abgebaut werden. ASPA wird vorwiegend in der Niere, der Leber und der weißen Substanz des Gehirns und die wichtige Rolle der ASPA in CD gegeben, die zelluläre Expression dieses Enzyms im Gehirn wurde von mehreren Labors untersucht worden. Mit Blick auf ASPA enzymatische Aktivität im Gehirn gefunden früheren Studien , dass die Zunahme in ASPA Aktivität während der Entwicklung des Gehirns verläuft parallel den zeitlichen Verlauf der Myelinisierung 8-10. Auf zellulärer Ebene, Assays für enzymatische Aktivität sowie in situ - Hybridisierung (ISH) und Immunhistochemie (IHC) Analysen legen nahe , dass ASPA hauptsächlich in Oligodendrozyten im Gehirn exprimiert wird , aber nicht in Neuronen oder Astrozyten 11-16. Einige Studien fanden heraus, dass ASPA könnte auchwerden in Mikroglia im ZNS 12,14 ausgedrückt. Bisher Daten über ASPA Ausdruck in OPs sind begrenzt. Nach einer aktuellen Studie , in Transkriptomen verschiedener Zelltypen in der Maus Hirnrinde einschließlich Neuronen, Astrozyten, OPs, neugebildeten Oligodendrozyten, myelinisierenden Oligodendrozyten, Mikroglia, Endothelzellen und Perizyten durch RNA - Sequenzierung analysiert wurden 17 wird ASPA ausschließlich in Oligodendrozyten exprimierten insbesondere Oligodendrozyten in myelinisierende (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Trotz dieser Studien über ASPA Expressionsmuster im Gehirn, noch eine Reihe von Unsicherheiten. Verschiedene Techniken können zum Studium von Genexpressionsmustern verwendet werden. IHC ist ein häufig verwendetes Verfahren zur Bestimmung der Funktionsprodukt Erfassen (dh Protein) einer Genexpression in Gewebeschnitten. Trotz seiner großen Nutzen, diese Technik hat seine Grenzen, deren Anwendung und Spezifität Thema t sindo der Verfügbarkeit und Spezifität des Antikörpers erforderlich. Im Vergleich dazu hat ISH den Vorteil, dass sie die Expression eines beliebigen Gens auf mRNA-Ebene zu offenbaren. mehrere Sonden kann es jedoch technisch schwierig zu verwenden, die gleichzeitig um eine Gen-Expression zu speziellen Zelltypen zu lokalisieren. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll RNA Doppel Fluoreszenz in situ - Hybridisierung mit Fluoreszenzimmunmarkierung eines Proteins verbinden. Wir haben diese Reihe von Techniken verwendet , um die Expressionsmuster von Aspa in Maushirn zu untersuchen. Dieses Verfahren ermöglicht die genaue Untersuchung der Genexpression unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie.

<table><tbody><tr><td>QIAprep Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Deionisiertes Formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>für ISH-Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>VWR International</td><td>20252.290</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch wasserfrei</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisches Dihydrat</td><td>Sigma</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>Hefe tRNA</td><td>Roche</td><td>10109495001</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhardt's Lösung</td><td>Life Technologies</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>Dextransulfat</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Aspa cDNA-Klon</td><td>Quelle Bioscience</td><td>IRAVp968C0654D</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Äquilibriertes Phenol</td><td></td><td>Sigma P4557</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Isoamylalkohol</td><td>Aldrich</td><td>496200</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR International</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA Polymerase</td><td>Promega</td><td>P4074</td><td></td></tr><tr><td>Transkriptionspuffer</td><td>Promega</td><td>P118B</td><td></td></tr><tr><td>100 mM DTT</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>UTP-DIG NTP Mix</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Fisher wissenschaftliche</td><td>005479470</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>59378</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl Pyrocarbonat</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbiton</td><td>Animalcare Ltd</td><td>BN43054</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>25 Gauge Nadel</td><td>Terumo</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltische Pumpe</td><td>Cole-Parmer Instrument Co., Ltd</td><td>WZ-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>Irisschere</td><td>Weiss</td><td>103227</td><td></td></tr><tr><td>Nr.2 Pinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>500230</td><td></td></tr><tr><td>Koronales Gehirn Matrix</td><td>World Precision Instruments</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>Personna Medical</td><td>PERS60-0138</td><td></td></tr><tr><td>OCT medium</td><td>Tissue tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat/Mikrotom</td><td>Bright</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus Objektträger</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>für 65 > C Waschpuffer</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>VWR International</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Smith Scientific Ltd</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>Blockierungsreagenz</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes Schafserum</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophober</td><td>Pen Cosmo Bio</td><td>DAI-PAP-S</td><td>1:500</td></tr><tr><td>&alpha;-FITC POD-konjugierter Antikörper</td><td>Roche</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>TSA&trade; Plus Fluorescein System</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>1:1.500</td></tr><tr><td>&alpha;-DIG AP-konjugierte</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Fast rote Tabletten</td><td>Roche</td><td>11496549001,22</td><td></td></tr> <tr><td>&micro; M Filter</td><td>Millex</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Olig2 Kaninchen Ameisenkörper</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 647-konjugierter &alpha;-Kaninchen Antikörper</td><td>Life technologies</td><td>A-31573</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>bisBenzimid H 33258</td><td>sigma</td><td>B2883</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 konfokal Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

die kombination von doppel-fluoreszenz<em&gt; in situ</em&gt; die hybridisierung mit immunmarkierung für nachweis der expression von drei gene in mäusehirnschnitten

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Nachweis der Genexpression in verschiedenen Arten von Gehirnzellen , beispielsweise Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia - Vorläufern kann durch das Fehlen von spezifischen primären oder sekundären Antikörper für Immunfärbungs behindert werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll , die Expression von drei verschiedenen Genen im gleichen Hirnschnitt mit doppelseitigem Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit zwei genspezifischen Sonden durch Immunfärbung mit einem Antikörper , der eine hohe Spezifität gegenüber dem durch ein drittes Gen kodierte Protein gerichtet ist, gefolgt zu detektieren. Die Aspartoacyclase (ASPA) Gen, Mutationen , von denen einer seltenen menschlichen Erkrankung der weißen Substanz führen kann - Canavan Krankheit - Es wird angenommen , in Oligodendrozyten und Mikroglia exprimiert werden , aber nicht in Astrozyten und Neuronen. Allerdings hat die genaue Expressionsmuster von ASPA im Gehirn noch etabliert werden. Dieses Protokoll hat uns erlaubt, zu bestimmen, dass ASPA in einer Untergruppe von reifen Oligodendrozyten a ausgedrückt wirdnd sie kann allgemein auf einen weiten Bereich von Genexpressionsmuster Studien angewendet werden.

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren für eine ISH Doppelfluoreszenz gefolgt von Immunmarkierung in Mausgehirnschnitte. Eine kurze Beschreibung dieses Protokolls ist in Abbildung 1. Der erste Schritt gezeigt Sonden synthetisieren war spezifisch für Aspa und MBP (myelin basic protein). Um zu überprüfen, dass die Sonden synthetisiert worden war, ein kleines Aliquot jeder Reaktion wurde auf einem Agarosegel laufen gelassen. Das schwache lineare Template ...

Die Lokalisierung der Genexpression auf bestimmte Zelltypen kann aufgrund des Mangels an spezifischen Antikörpern eine Herausforderung darstellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen dreifachen Detektion der Genexpression durch Kombination von Doppelfluoreszenz-RNA-in-situ-Hybridisierung mit Immunfärbung.

Die Kombination von Doppel-Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung mit Immunmarkierung für Nachweis der Expression von drei Gene in Mäusehirnschnitten

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Expression von drei verschiedenen Genen in Gehirnschnitten gleichzeitig nachzuweisen, und zwar mittels doppelter Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, gefolgt von Immunfärbung. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise welche Zelltypen mein Gen von Interesse exprimieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass kein hochwertiger Antikörper gegen das Gen von Interesse erforderlich ist, um die Lokalisation seiner Expression in einem bestimmten Zelltyp zu bestimmen.Zusammenfassend wird bei diesem Verfahren am ersten Tag festgelegtes Gewebe geschnitten und die Schnitte über Nacht mit zwei unterschiedlich markierten RNA-Sonden hybridisiert. Am zweiten Tag erfolgt eine Übernachtinkubation der Schnitte mit einem Antikörper, der auf die FITC-markierte Sonde zielt. Dieser Antikörper ist mit Meerrettichperoxidase konjugiert, die am dritten Tag die Anlagerung eines fluoreszierenden Tyramids katalysiert.Anschließend wird ein mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Antik&ouml;rper verwendet, um die mit DIG markierte Sonde zu detektieren. Am vierten Tag katalysiert dieses Enzym die Bildung eines fluoreszierenden Niederschlags, wenn es mit Fast Red-L&ouml;sung inkubiert wird. Danach werden die Schnitte &uuml;ber Nacht mit einem prim&auml;ren Antik&ouml;rper, der gegen ein Protein der Interesse gerichtet ist, inkubiert.Schließlich wird dieses Protein am fünften Tag mit einem mit einem Fluorophor konjugierten sekundären Antikörper sichtbar gemacht. Um dieses Verfahren zu beginnen, wählen Sie einen DNA-Klon aus, der die cDNA-Sequenz des Gens der Interesse in einem Plasmid mit RNA-Polymerase-Promotoren enthält. Züchten Sie anschließend den DNA-Klon, isolieren Sie das Plasmid mit einem Kleinmengen-Plasmidreinigungs-Kit und sequenzieren Sie es mit universellen T7- und SP6-Primern.Verdauen Sie 10 bis 20 Mikrogramm Plasmid-DNA mit einem Restriktionsenzym, das am Fünf-Prim-Ende des Sinnstrangs der cDNA schneidet. Inkubieren Sie die Probe 1,5 Stunden bei 37 Grad Celsius. Führen Sie anschließend eine kleine Aliquotprobe auf einem Agarosegel durch, um zu überprüfen, ob das Plasmid vollständig linearisiert ist.Um das linearisierte Plasmid zu reinigen, geben Sie 1/10 des Volumens einer dreimolaren Natriumacetatlösung, ein Volumen einer mit 10 Millimolar Tris-HCl gepufferten Phenollösung und ein Volumen Chloroform-Isoamylalkohol hinzu. Zentrifugieren Sie eine Minute bei Raumtemperatur mit 16.000 × g und gewinnen Sie die obere wässrige Phase. Fügen Sie anschließend ein Volumen Chloroform-IAA hinzu.Zentrifugieren Sie es bei 16.000 Gs für eine Minute und entnehmen Sie die obere wässrige Phase. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Geben Sie dann das Doppelte des Volumens an Ethanol hinzu und lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius für eine Stunde oder über Nacht. Anschließend bei 16.000 G und vier Grad Celsius zehn Minuten zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Pellet mit 70 % kaltem Ethanol waschen. Danach in TE suspendieren, sodass eine Konzentration von einem Mikrogramm cDNA pro 2,5 Mikroliter vorliegt.Um die beiden Sonden zu synthetisieren, wählen Sie zunächst die geeignete RNA-Polymerase aus. Bereiten Sie dann die In-vitro-Transkriptionsreaktion vor und stellen Sie das Endvolumen mit DEPC-behandeltem Wasser auf 20 µL ein. Inkubieren Sie bei 37 °C für 1,5 Stunden.Führen Sie anschließend ein Mikroliter der Transkriptionsreaktion auf einem 1 %igen Agarosegel durch, um zu überprüfen, ob die Reaktion erfolgreich war. Im Gel sollten die lineare Vorlage und ein intensives Band des Probes sichtbar sein. Schneiden Sie in diesem Verfahren 15 Mikrometer dicke Schnitte von gefrorenem Gewebe in einem Kryostaten.Sammeln Sie die Schnitte auf Objektträgern und lassen Sie die Objektträger eine Stunde lang trocknen, um sicherzustellen, dass die Gewebe an den Objektträgern haften. Der wichtigste Faktor für den Erfolg dieses Verfahrens ist die Qualität der Schnitte. Diese hängt teilweise von gut perfundiertem und fixiertem Gewebe ab und teilweise von der Schnitttechnik, um flache Schnitte zu erhalten, die frei von RNase-Kontamination sind.Anschließend verdünnen Sie die beiden Sonden in Hybridisierungspuffer, der auf 65 Grad Celsius vorgewärmt wurde, und mischen Sie gründlich. Geben Sie 300 Mikroliter der Hybridisierungsmischung auf jeden Objektträger und bedecken Sie diesen mit einer im Ofen behandelten Deckglasabdeckung. Inkubieren Sie die Objektträger danach über Nacht bei 65 Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer.Am nächsten Tag die Objektträger in ein Coplin-Gefäß mit vorgewärmtem Waschpuffer überführen und die Objektträger zweimal je 30 Minuten bei 65 Grad Celsius waschen. Anschließend die Objektträger dreimal je 10 Minuten mit MABT-Waschlösung bei Raumtemperatur waschen. In diesem Schritt mit einem hydrophoben Stift Kreise um die Gewebeschnitte zeichnen.Anschließend die Objektträger eine Stunde bei Raumtemperatur in ISH-Blockpuffer in einer befeuchteten Kammer inkubieren. Danach die Objektträger über Nacht bei 4 Grad Celsius mit einem mit HRP konjugierten anti-FITC-Antikörper inkubieren. Anschließend die Objektträger in ein Coplin-Gefäß mit PBST geben.Waschen Sie sie dreimal für jeweils 10 Minuten in PBST und ersetzen Sie das PBST jedes Mal durch frisches. Danach fügen Sie fluoreszierendes Tiromid zu den Objektträgern hinzu und lassen es 10 Minuten bei Raumtemperatur einwirken. Legen Sie die Objektträger in ein Coplin-Gefäß und waschen Sie sie dreimal für jeweils 10 Minuten in PBST.Anschließend die Objektträger eine Stunde bei Raumtemperatur mit ISH-Blockierpuffer inkubieren. Danach die Objektträger über Nacht bei vier Grad Celsius mit einem alkalischen Phosphatase-konjugierten Anti-Dig-Antikörper inkubieren. Danach dreimal für jeweils 10 Minuten mit MABT waschen.Als Nächstes die Objektträger zweimal mit 0,1 molarer Tris-HCl-Pufferlösung bei pH 8,2 fünf Minuten lang bei Raumtemperatur waschen. Die Fast-Red-Lösung filtrieren und die Objektträger in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius mit der Fast-Red-Lösung inkubieren. Da die optimale Entwicklungszeit variieren kann, sollten die Objektträger regelmäßig mit einem Fluoreszenzmikroskop überprüft werden, um die Bildung des Präzipitats zu überwachen.Danach dreimal mit PBST waschen, jedes Mal 10 Minuten lang. Für die Immunhistochemie die Objektträger eine Stunde bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer mit IHC-Blockierpuffer inkubieren. Anschließend die Objektträger über Nacht bei vier Grad Celsius in der Primärantikörperlösung inkubieren.Am nächsten Tag die Objektträger dreimal für jeweils 10 Minuten mit PBST waschen. Anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur in der Lösung mit dem sekundären Antikörper inkubieren. Danach die Objektträger dreimal für jeweils 10 Minuten mit PBST waschen.Trocknen Sie die Objektträger anschließend teilweise bei Raumtemperatur und decken Sie sie mit einem fluoreszenztauglichen Eindeckmedium auf. Lassen Sie die Objektträger vor der Aufnahme an einem konfokalen Mikroskop trocknen. Dargestellt sind hier repräsentative Bilder der ISH für Aspa und Mbp, gefolgt von einer Immunfärbung für OLIG2 in Kombination mit einer Hook-Färbung.Aspa wurde in einigen MBP-positiven OLIG2-positiven Zellen in der Großhirnrinde und im Corpus callosum exprimiert. Einige Mbp-positive OLIG2-positive Zellen exprimieren Aspa nicht. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Schnitte und alle Lösungen frei von RNase-Kontamination zu halten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Genexpressionsmuster mittels N-Citrin-Inhibierung und Immunhistochemie untersucht werden können. Diese Technik kann für eine Vielzahl von Geweben unterschiedlicher Herkunft und Entwicklungsstadien angepasst werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Eine Kombination verschiedener Techniken, um die Datenerfassung von der Maus Gewebe zu maximieren wird vorgestellt.

Die Kombination lipophiler Farbstoff, In situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie

Quelle: Jolly, S., et.al. Kombination von Doppelfluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit Immunmarkierung zum Nachweis der Expression von drei Genen in Hirnschnitten von Mäusen. J. Vis. Exp. (2016). Dieses Video zeigt die Verwendung von Doppelfluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, um die Expression von zwei RNA-Zielen in Hirnschnitten von Mäusen sichtbar zu machen. Das Protokoll umfasst den sequentiellen Nachweis von RNA mit Sonden, die mit Fluoresceinisothiocyanat und Digoxigenin markiert sind,...

 Durchführung einer Doppelfluoreszenz-In-situ-Hybridisierung zum Nachweis der Genexpression in Gehirnschnitten von Mäusen

Quelle: Baleriola, J., et. al., Nachweis axonal lokalisierter mRNAs in Hirnschnitten mittels hochauflösender In-situ-Hybridisierung.  J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt den Nachweis von mRNA in cholinergen Axonen in fixierten Maus-Hippocampus-Schnitten mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung und Antikörperfärbung. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt die räumliche Lokalisierung von sondenmarkierten mRNAs und Cholinacetyltransferase in cholinergen Neuronen.

Immunfärbung von Neuronen in Hirnschnitten von Mäusen nach Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Dieses Einführungsprotokoll beschreibt die Reagenzien, Geräte und Techniken, die erforderlich sind, um die immunhistochemische Färbung von Nagetiergehirnen durchzuführen, am Beispiel von Markern für Mikroglia und neuronale Elemente.

Primer für die Immunhistochemie auf gefriergeschnitten Rat Brain Tissue: Beispiel Färbung für Mikroglia und Neuronen

Wir beschreiben eine Multi-Target-chromogenen ganze-mount in situ Hybridisierung (MC-WISH) Verfahren in intakten Drosophila-Embryos eine gleichzeitige und spezifischen Nachweis von drei verschiedenen mRNA-Verteilungsmuster durch Kontrastfarbe Niederschläge.

Multi-Target-Chromogenic Whole-mount<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung zum Vergleich Genexpression Domains in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

Dieses Protokoll beschreibt einen schrittweisen Workflow für die immunfluoreszierende Costainierung von IBA1 und TMEM119, zusätzlich zur Analyse der mikrogliaalen Dichte, Verteilung und Morphologie sowie der peripheren myeloischen Zellinfiltration im Gehirngewebe der Maus.

Immunfluoreszenzfärbung mit IBA1 und TMEM119 für Mikroglia-Dichte, Morphologie und periphere Myeloid-Zellinfiltrationsanalyse im Maushirn

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kombination von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Fluoreszenz-Immunhistochemie (IHC) sowohl in frisch gefrorenen als auch in fixierten Maus-Hirnschnitten, mit dem Ziel, Multilabel-FISH und Fluoreszenz-IHC-Signal zu erreichen. IHC zielte auf zytoplasmatische und membrangebundene Proteine ab.

Kombination von Multiplex-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit fluoreszierender Immunhistochemie an frischen, gefrorenen oder fixierten Mäusehirnschnitten

Die Fähigkeit, Stammzellen und ihre Nachkommen mit einem Fluorophor unter Verwendung einer induzierbaren transgenen Linienverfolgungs-Mauslinie dauerhaft zu markieren, ermöglicht eine räumliche und zeitliche Analyse von Aktivierung, Proliferation, Migration und / oder Differenzierung in vivo. Die Abstammungsverfolgung kann neue Informationen über die Verpflichtung der Abstammung, die Reaktion auf Interventionen und die Multipotenz aufdecken.

Abstammungsverfolgung von induzierbaren fluoreszenzmarkierten Stammzellen im erwachsenen Mäusegehirn

Expansion-Assisted Itercence In Situ Hybridization (EASI-FISH) ist eine robuste Technik, die Expansionsmikroskopie mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kombiniert, um die Expression mehrerer Gene in dickem Gewebe nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt die jüngsten Fortschritte in der Methode und ihre Anpassung an die Markierung des intakten Drosophila-Zentralnervensystems.

Multiplex-Detektion der Genexpression im intakten Drosophila-Gehirn mittels expansionsunterstützter iterativer Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Lernen Sie die doppelte Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung mit Immunmarkierung zur gleichzeitigen Detektion von drei Genen in Mäusehirnschnitten. Diese Methode ermöglicht die präzise Lokalisierung von Genexpression in spezifischen Zelltypen.

Die Kombination von Doppel-Fluoreszenz In Situ Die Hybridisierung mit Immunmarkierung für Nachweis der Expression von drei Gene in Mäusehirnschnitten (Video) | JoVE Journal

Die Kombination von Doppel-Fluoreszenz

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