Die Kombination von Doppel-Fluoreszenz In Situ Die Hybridisierung mit Immunmarkierung für Nachweis der Expression von drei Gene in Mäusehirnschnitten

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Expression von drei verschiedenen Genen in Gehirnschnitten gleichzeitig zu detektieren, wobei eine Doppelfluoreszenz-in-situ-Hybridisierung gefolgt von Immunfärbung verwendet wird. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. welcher Zelltyp mein interessierendes Gen exprimiert? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie keinen guten Antikörper für Ihr interessierendes Gen benötigen, um seine Expression auf einen bestimmten Zelltyp beschränken zu können.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass am ersten Tag fixierte Gewebeschnitte geschnitten und über Nacht mit zwei unterschiedlich markierten RNA-Sonden hybridisiert werden. Am zweiten Tag werden die Schnitte über Nacht mit einem Antikörper inkubiert, der auf die FITC-markierte Sonde abzielt. Dieser Antikörper ist mit Meerrettichperoxidase konjugiert, die die Zugabe eines fluoreszierenden Tyramids am dritten Tag katalysiert.

Dann wird ein alkalischer Phosphatase-konjugierter Antikörper verwendet, um auf die DIG-markierte Sonde zu zielen. Am vierten Tag katalysiert dieses Enzym die Bildung von fluoreszierenden Ausfällungen, wenn es mit Fast Red-Lösung inkubiert wird. Dann werden die Abschnitte über Nacht mit einem primären Antikörper inkubiert, der auf ein Protein von Interesse abzielt.

Am fünften Tag wird dieses Protein schließlich mit einem Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper visualisiert. Um dieses Verfahren zu starten, wählen Sie einen DNA-Klon aus, der die cDNA-Sequenz des interessierenden Gens in einem Plasmid mit RNA-Polymerase-Promotoren enthält. Als nächstes züchten Sie den DNA-Klon, extrahieren Sie das Plasmid mit einem kleinen Plasmid-Aufreinigungskit und sequenzieren Sie es mit einem T7- und SP6-Universalprimer

Verdauen Sie 10 bis 20 Mikrogramm Plasmid-DNA mit einem Restriktionsenzym, das an den fünf Primzahlen des Sinnesstrangs der cDNA schneidet. Inkubieren Sie es 1,5 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Führen Sie dann ein kleines Aliquot auf einem Agarosegel aus, um zu überprüfen, ob das Plasmid vollständig linearisiert ist.

Um das linearisierte Plasmid zu reinigen, fügen Sie 1/10 des Volumens von drei molaren Natriumacetaten, ein Volumen von 10 millimolar Tris-HCl-äquilabisiertem Phenol und ein Volumen Chloroform-Isoamylalkohol hinzu. Eine Minute lang bei Raumtemperatur bei 16.000 g zentrifugieren und die obere wässrige Phase extrahieren. Geben Sie dann ein Volumen Chloroform IAA hinzu.

Zentrifugieren Sie es eine Minute lang bei 16.000 g und extrahieren Sie die obere wässrige Phase. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Fügen Sie dann zwei Volumen Ethanol hinzu und halten Sie es eine Stunde lang oder über Nacht bei minus 20 Grad Celsius.

Danach zentrifugieren Sie bei 16.000 g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 70 % kaltem Ethanol. Dann resuspendieren Sie es in TE in einer Konzentration von einem Mikrogramm cDNA pro 2,5 Mikroliter.

Um die beiden Sonden zu synthetisieren, wählen Sie zunächst die passende RNA-Polymerase aus. Bereiten Sie dann die In-vitro-Transkriptionsreaktion vor und erhöhen Sie das endgültige Volumen mit DEPC-behandeltem Wasser auf 20 Mikroliter. Inkubieren Sie 1,5 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Sie anschließend einen Mikroliter der Transkriptionsreaktion auf einem 1%igen Agarosegel durch, um zu überprüfen, ob die Reaktion funktioniert hat. Das Gel sollte die lineare Schablone und ein helles Band der Sonde zeigen. Bei diesem Verfahren werden 15 Mikrometer dicke Schnitte von gefrorenem Gewebe in einem Kryostaten geschnitten.

Sammeln Sie die Schnitte auf den Objektträgern und lassen Sie die Objektträger eine Stunde lang trocknen, um sicherzustellen, dass das Gewebe an den Objektträgern haftet. Der wichtigste Faktor, damit dieses Verfahren gut funktioniert, ist die Qualität der Schnitte. Dies hängt zum Teil von gut durchblutetem und fixiertem Gewebe und zum Teil von der Schnitttechnik ab, um flache Schnitte zu erhalten, die frei von RNase-Kontamination sind.

Verdünnen Sie dann die beiden Sonden in einem auf 65 Grad Celsius vorgewärmten Hybridisierungspuffer und mischen Sie sie gut. Tragen Sie 300 Mikroliter Hybridisierungsmischung auf jeden Objektträger auf und bedecken Sie sie mit einem im Ofen gebackenen Deckglas. Anschließend werden die Objektträger über Nacht bei 65 Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer inkubiert.

Am nächsten Tag geben Sie die Objektträger in ein Coplin-Glas mit vorgewärmtem Waschpuffer und waschen Sie die Objektträger 30 Minuten lang zweimal bei 65 Grad Celsius. Waschen Sie die Objektträger danach dreimal 10 Minuten lang mit MABT Waschlösung bei Raumtemperatur. Zeichnen Sie in diesem Schritt mit einem hydrophoben Stift Kreise um die Gewebeschnitte.

Anschließend werden die Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit ISH-Blockierungspuffer in einer befeuchteten Kammer inkubiert. Als nächstes inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei 4 Grad Celsius mit einem Meerrettich-peroxidierten konjugierten Anti-Fitc-Antikörper. Legen Sie dann die Objektträger in ein Coplin-Glas, das PBST enthält.

Waschen Sie sie dreimal für jeweils 10 Minuten in PBST und ersetzen Sie sie jedes Mal durch frisches PBST. Geben Sie anschließend fluoreszierendes Tiromid zu den Objektträgern und lassen Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie die Objektträger in einen Coplin-Tiegel und waschen Sie sie dreimal 10 Minuten lang in PBST.

Anschließend werden die Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit ISH-Blockierungspuffer inkubiert. Inkubieren Sie die Objektträger dann über Nacht bei vier Grad Celsius mit einem alkalischen Phosphatase-konjugierten Anti-Dig-Antikörper. Danach waschen Sie sie dreimal für jeweils 10 Minuten mit MABT.

Waschen Sie die Objektträger anschließend zweimal mit 0,1 molaren Tris HCL bei pH 8,2 für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Filtrieren Sie die schnelle rote Lösung und inkubieren Sie die Objektträger bei 37 Grad Celsius mit schneller roter Lösung in einer befeuchteten Kammer. Da die Zeit für eine optimale Entwicklung variiert, sollten Sie die Objektträger regelmäßig mit einem Fluoreszenzmikroskop überprüfen, um die Bildung von Niederschlag zu überwachen.

Waschen Sie sie dann dreimal jeweils 10 Minuten lang mit PBST. Um eine Immunhistochemie durchzuführen, inkubieren Sie die Objektträger mit IHC-Blockierungspuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer. Inkubieren Sie anschließend die Objektträger über Nacht in der primären Antikörperlösung bei vier Grad Celsius.

Waschen Sie die Objektträger am nächsten Tag dreimal 10 Minuten lang mit PBST. Inkubieren Sie sie in der Sekundärantikörperlösung bei Raumtemperatur für eine Stunde. Waschen Sie sie dann dreimal für jeweils 10 Minuten mit PBST.

Anschließend die Objektträger bei Raumtemperatur teilweise trocknen und mit einem Fluoreszenzeindeckmedium einbetten. Lassen Sie die Objektträger trocknen, bevor Sie sie in einem Konfokalmikroskop abbilden. Hier sind die repräsentativen Bilder von ISH für Aspa und Mbp zu sehen, gefolgt von der Immunfärbung für OLIG2 in Kombination mit der Hakenfärbung.

Aspa wurde in einigen MBP-positiven OLIG2-positiven Zellen im Kortex und im Corpus callosum exprimiert. Einige Mbp-positive OLIG2-positive Zellen exprimieren kein Aspa. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Scheiben und alle Lösungen frei von RNase-Verunreinigungen zu halten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Genexpressionsmuster durch N-Citrin-Hemmung und Immunhistochemie untersucht. Diese Technik kann an eine Vielzahl von Geweben unterschiedlicher Herkunft und Entwicklungsstadien angepasst werden.