Name: Rasterelektronenmikroskopie von Mazerierte Gewebe zu visualisieren die extrazelluläre Matrix (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Lernen Sie die Rasterelektronenmikroskopie von mazeriertem Herzgewebe zur Visualisierung der extrazellulären Matrix. Diese Methode ermöglicht qualitative Einblicke in Matrixstrukturen bei Fibroseforschung.

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Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (NIH), des Heart, Lung, and Blood Institute (NIHLB) finanziert: K01-HL-121045, K08-HL-094703, 5T32HL007411-35, P20 HL101425, U01 HL100398. 
Bildgebung und Gewebeverarbeitung (nach NaOH-Mazeration) wurden unter Verwendung der Cell Imaging Shared Resource (CISR) des Vanderbilt University Medical Center (VUMC) durchgeführt (unterstützt durch NIH-Zuschüsse CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 und EY08126). Wir sind besonders dankbar für die Kerndirektoren des VUMC CISR (Dr. Sam Wells und Dr. W. Gray (Jay) Jerome) für wertvolle technische Ratschläge und auch für die Bereitstellung von Kernraum und Ressourcen für die Zwecke der Aufnahme der in diesem Artikel vorgestellten Technik. 
Wir möchten Dr. Yan Ru Su und Frau Kelsey Tomasek vom Cardiology Core Lab for Translational and Clinical Research an der Vanderbilt University unseren tiefsten Dank für ihre technische Expertise und das Sammeln von menschlichen Gewebeproben aussprechen, die in dieser Studie verwendet wurden.

Ethik - Erklärung: Die Protokolle für die Behandlung der Tiere durch die Vanderbilt Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC genehmigt wurden, Protokolle Nummer M / 10/117 (Schweine) und M / 10/219 (Mäuse) und führte nach AAALAC-International - Standards. die Verwendung von überhöhten menschlichen Herzgewebe wurde von der Vanderbilt University Medical Center IRB (Protokollnummer 100887) genehmigt. 1. Probenentnahme und Lagerung <ol><li> Machen Sie frisch 4% Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) Lösung. ACHTUNG: Glutaraldehyd ist giftig, Handschuhe tragen und die Arbeit in einem Abzug. <ol><li> Machen Sie eine 0,2 M Stammlösung von PB, pH 7,4 , unter Verwendung von 21,8 g Na 2 HPO 4 und 6,4 g NaH 2 PO 4. Quantum satis (Qs) bis 1000 ml dH 2 O. </li><li> In 400 ul 50% Glutaraldehyd zu 2,5 ml PB - Stammlösung und 2,1 ml dH 2 O. </li></ol></li><li> Tauchen Sie ein Stück (nicht größer als 2 cm 2) von Gewebe in 4% Glutaraldehyd - Lösung. Hinweis: Kleinere Stücke können auch verwendet werden , aber von ausreichender Größe (nicht kleiner als 5 mm 2) sein sollte , leicht mit dem Auge , um sichtbar gemacht zu werden , um spätere Schritte des Protokolls erleichtern. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde, dann speichern Sie auf unbestimmte Zeit bei 4 ° C. </li></ol> 2. Dezellularisierung von Herzgewebe <ol><li> Machen Sie frische 10% ige wässrige NaOH - Lösung unter Verwendung von 10 g NaOH - Pellets / 100 ml dH 2 O. ACHTUNG: NaOH-Lösungen sind korrosiv und kann Alkali-Verbrennungen verursachen, tragen Handschuhe. </li><li> Spülen Sie Gewebe in dH 2 O. </li><li> Inkubieren in 10% NaOH-Lösung bei Raumtemperatur für 6 bis 10 Tage (bis Gewebsveränderungen von rötlich-braun bis weißliche oder weiß). </li><li> Spülen Sie in dH 2 O bis Gewebe transparent wird. </li><li> Tauchen Gewebe in 1% Gerbsäure 4 h bei Raumtemperatur. Verwenden Sie 1 ml 5% Stammlösung pro 4 ml dH 2 O. ACHTUNG: Gerbsäurereizend ist eine starke, Handschuhe zu tragen. </li><li> Spülen Sie in dH 2 O über Nacht. </li></ol> 3. Osmication und Dehydration von Herzgewebe (in Dampf-Haube für Sicherheit) <ol><li> Machen Sie eine 0,2 M Stammlösung von Natriumcacodylatpuffer mit 21,4 g Natriumcacodylat, 10,0 g Calciumchlorid und 450 ml dH 2 O. Mix, dann Salzsäure nach Bedarf hinzufügen pH auf 7,4 einzustellen. Qs auf 500 ml mit dH 2 O. ACHTUNG: Natriumcacodylat und Salzsäure sind giftig, Handschuhe tragen und die Arbeit in einem Abzug. </li><li> Machen Sie 2% igen wässrigen Stammlösung von Osmiumtetroxid in Abzug , der für die Sicherheit durch Lösen von 1 g Osmiumtetroxid Kristall in 50 ml dH 2 O. ACHTUNG: Osmiumtetroxid ist eine schwere Gefahr beim Einatmen; Dampf Fixierung von Schleimhäuten oder Augäpfel ist möglich, also nur mit Handschuhen im Abzug handhaben. Ein Spritzschutz wird empfohlen. </li><li> Spülen Sie Gewebe in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (Mischungslösung Lager 1: 1 mit dH <sub&gt; 2 O) für 5 min auf Rotator (oder leichtem Schütteln). </li><li> Zweimal wiederholen vorherigen Schritt, für insgesamt drei Puffer Spülungen. </li><li> Tauchen Gewebe in 1% Osmiumtetroxid in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (Lager Natriumcacodylat und Lager Osmiumtetroxid 1 mischen: 1) auf Rotator für 1 Stunde. </li><li> Spülen Gewebe in 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer 3 mal für jeweils 5 min auf Rotator. </li><li> Spülen Gewebe unter Verwendung zunehmender Konzentrationen von Ethanol (30%, 50%, 75%, 85%, 95% und schließlich 100%) für 15 min auf jedem Rotator. </li></ol> 4. Querschnitt Oberflächenvorbereitung für SEM <ol><li> Übertragen Gewebe in 100% Ethanol auf eine flache Petrischale auch 100% Ethanol enthält. </li><li> Halten Sie zwei sehr scharfe Rasierklingen, so dass die Wohnungen der Seiten in Kontakt miteinander stehen und die Schneidkanten Quer zwei Seiten eines gleichseitigen Dreiecks oberhalb der Probe zu bilden. Um dies zu erreichen, verwenden Sie die linke Hand ein Blatt auf der rechten Seite der Probe zu platzieren undSchnitt nach links. Zugleich mit der rechten Hand, um die zweite Klinge auf dem ganz links in der Probe und Scheibe nach rechts zu platzieren. Somit werden die Blätter aus entgegengesetzten Richtungen gegeneinander verschoben werden, um einen einzelnen glatten Schnitt. </li><li> Schieben Sie die flache Klinge Seiten gegeneinander einen sehr sauberen Schnitt der Probe mit minimaler Verzerrung zu machen oder Reißkraft, vorzugsweise eine möglichst große Oberfläche wie möglich auszusetzen, ohne die Probe zu beschädigen. </li><li> Wiederholen Sie für jede Probe die sauberste mögliche Querschnittsflächen für die Prüfung im SEM auszusetzen. </li></ol> 5. Trocknen am kritischen Punkt (CPD) von Herzgewebe <ol><li> Verwenden eines Spatels oder einer Pinzette Gewebe an den Probenhalter des kritischen Punktes Trockners (CPD) zu übertragen, um sicherzustellen, dass Gewebe zu jeder Zeit in 100% Ethanol bleibt. Stellen Sie sicher, dass der Halter in Ethanol eingetaucht wird, und dass die Übertragung mit dem Gewebe für nicht mehr als einige Sekunden an der Luft erreicht wird. </li><li> Betreiben Sie CPD pro unser Anleitung zu vervollständigen 3 Purge-and-Fill-Zyklen Ethanol mit flüssigem Kohlendioxid zu ersetzen. </li><li> Betreiben Sie CPD pro Bedienungsanleitung Trocknen am kritischen Punkt der Proben zu erreichen und bringt sie auf Atmosphärendruck mit kontrolliertes Ablassen von CO 2. </li></ol> 6. Montage von Herzgewebeproben für SEM <ol><li> Bereiten Sie eine SEM-Probe Stub für jede Probe, um eine Kohlenstofffolie auf der Oberfläche des Aluminium-Stub haften. </li><li> Mit Hilfe eines Stereomikroskops, sich sorgfältig um die Probe auf die Klebelasche mit der Querschnittsfläche von Interesse nach oben (weg von der Registerkarte sichtbar), und so nah wie möglich mit der Ebene der Probe Stummel Oberfläche parallel. Sie nicht die Oberfläche von Interesse Sonde oder berühren. </li><li> Brechen Sie einen hölzernen Applikatorstäbchen eine verjüngte Bürste, ideal für Farbauftrag zu erzielen. Bewerben Silber oder Kohlenstoff Farbe an der Basis und an den Seiten der Probe, die Einhaltung der Stummel zu verbessern. </li><li> Erweitern Sie eine sehr dünne Linie von Silber oder Kohlenstoff, an einer Kante der Oberfläche von Interesse bemalen, einen Ladepfad von der Oberfläche von Interesse zu Boden zu schaffen. </li><li> Übernehmen 2 oder 3 kleine dabs von Silber oder Kohlenstofffarbe um den Umfang der Kohlenstofflasche, einen leitenden Pfad von der Kohlenstofflaschenoberfläche an dem Metall stub zu bieten und somit zur Masse. </li><li> Erlauben leitfähigen Farbe für zwei Stunden trocknen. </li><li> Betreiben Sie Zerstäubungsbeschichter pro Bedienungsanleitung eine relativ schwere Beschichtung (Zielbereich von 30 - 40 nm) aufzubringen Gold-Palladium-Legierung oder Gold. Pumpe Probenkammer auf etwa 0,1 mbar; Zeitschaltuhr auf 40 sec. Offene Stellen Ventil in die Position 08.00 Uhr (moderate Argon Gasstrom). Drücken Sie auf Start Sputterbeschichtung bei 30 mA zu initiieren. Lila Glimmentladung sollte in der Probenkammer sichtbar sein. </li></ol> 7. REM-Untersuchung der Herzgewebeproben <ol><li> Führen Rasterelektronenmikroskopie bei relativ niedriger Beschleunigungsspannung Abbildungs ​​p zu minimierenrobleme mit Verlust schlechten Ladung in der Probe zugeordnet ist (Laden). Empfohlene anfängliche Abbildungsbedingung sind: 5 kV Beschleunigungsspannung, 10 mm Arbeitsabstand. </li><li> Mit Hilfe eines erfahrenen Bediener, erhöht beschäftigen Abstand Arbeitstiefe von Feldbedingungen in der Bildgebung Fokus der Fasern erstrecken sich in mehreren Fokusebenen erfordern, oder Fasern für beträchtliche Länge in z-Richtung erstrecken. <ol><li> Für das Mikroskop hier (siehe Tabelle der Materialien), in der Benutzeroberfläche Zugriff die Registerkarte Navigation oben rechts verwendet. </li><li> Besuchen Sie das Register Koordinaten von der Bühne Menü. Zur Erhöhung der Arbeitsabstand, geben Sie einen größeren Wert in Millimetern für die Z-Koordinate dann, um auf die Registerkarte Gehen Sie auf die Probenbühne auf den eingegebenen Arbeitsabstand zu bewegen. </li></ol></li><li> Mit Hilfe eines erfahrenen Bediener, beschäftigen Probe Neigung und Drehung der Oberfläche von Interesse orthogonal zu dem Elektronenstrahl zu positionieren. Zusätzliche Neigung von 10 bis 30 degrees von dieser Position kann die Beobachtung und Dokumentation der Matrixstruktur zu verbessern. <ol><li> Für das Mikroskop hier (siehe Tabelle der Materialien), in der Benutzeroberfläche verwendet wird , klicken Sie mit der rechten Maustaste gedrückt halten, schieben Sie dann nach links oder rechts , um die Probe in der Nähe der Peripherie der vorbereiteten Oberfläche Ebene von Interesse zu konzentrieren, um den fokussierten Arbeitsabstand der Feststellung , . </li><li> Navigieren Sie mit dem Handbuch Benutzeroberfläche Joystick in der Nähe der gegenüberliegenden Kante der Oberfläche und wiederholen Sie Fokus zu bewegen. Wenn der Abstand arbeiten in die erste Position nicht annähernd gleich ist, Neigung Probe an beiden Standorten ungefähre Vereinbarung zu erreichen, um die Register Koordinaten des Stage-Menü (siehe 7.2) und einem Neigungswert in der T-Koordinate eingeben. </li><li> Drehen Probe neunzig Grad (Wert in R-Koordinatenfeld) und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Positionen bei etwa der gleichen Arbeitsabstand fokussiert sind. Hinweis: Variable Druck SEM verwendet werden kann Ladungsdissipation zu verbessernwenn verfügbar. Hochvakuum ist der Standard-Betriebsmodus für die Rasterelektronenmikroskopie. </li></ol></li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Querschnitt Oberflächenvorbereitung ist der kritischste Schritt während des Protokolls. Zur Erhaltung Feinstruktur, dehydriert Proben müssen zu jeder Zeit in 100% Ethanol bleiben bis zum kritischen Punkt Trocknungsprozess eingeführt. Deshalb ist die Slicing der Proben Flächen für EM Prüfung zu erreichen, müssen durchgeführt werden, während Proben in Ethanol in einer flachen Schale getaucht werden. Es ist auch wichtig, dass die freiliegende Oberfläche während der nachfolgenden Handhabung nicht berührt oder sondiert wird....

Fibrose stört das normale myokardiale Kollagennetzwerk, das für die normalen mechanistischen Funktionen der Kardiomyozyten entscheidend ist 1,2 sowie für die interzelluläre Kommunikation, die intrazelluläre Signalübertragung und das Überleben der Zellen 3. Die Entwicklung von Fibrose ist eine wichtige Determinante der Herzfunktion, und der fibrotische Umbau des kardialen Interstitiums, der sich aus einer Vielzahl von Ätiologien ergibt, führt zu einer erhöhten linksventrikulären Steifigkeit und diastolischen Dysfunktion 4. Myokardfibrose kann auch zu Herzrhythmusstörungen führen, und unabhängig davon, ob es sich bei dem Fortschreiten des fibrotischen Umbaus um ein allgemeines oder lokales Phänomen handelt, ist es in hohem Maße mit einer schlechten Prognose bei Patienten mit ischämischer und nicht-ischämischer Kardiomyopathie verbunden 5. Ebenso ist das Fehlen einer Myokardfibrose ein starker Prädiktor für die Wiederherstellung der ventrikulären Funktion und das Langzeitüberleben 6. 
Das Kennzeichen der Fibrose ist die Ablagerung von überschüssigem Kollagen, das die Zugfestigkeit von Stahl 7 hat und die Kardiomyozytenfunktion auf mehreren Ebenen nachteilig beeinflussen kann. Mechanische Kräfte, die sich aus einer übermäßig kollagenen Matrix ergeben, können zu Kardiomyozytenatrophie 8,9, passiver Gewebesteifigkeit 10, tonischer kontraktionsinduzierter Myokardsteifigkeit 11-13 und verminderter Sauerstoffzufuhr an die verbleibende Population von Kardiomyozyten führen. Die Gap-Junction-Kopplung von Kardiomyozyten und myoFbs kann auch die elektrischen Eigenschaften des Herzens beeinträchtigen, was ein höheres Risiko für die Entwicklung von Herzrhythmusstörungen darstellt 14-16. Die perivaskuläre Fibrose verändert die vasomotorische Reaktivität der intramuralen Koronararterien und Arteriolen 17 und trägt zur luminalen Verengung bei, die die Sauerstoffversorgung und damit das Überleben der Kardiomyozyten verringert 17-22. Pathogener fibrotischer und elektrischer Umbau, der von einer anfänglichen ischämischen Verletzung oder einem Energieungleichgewicht ausgeht, schreitet unweigerlich bis zur Herzinsuffizienz fort. 
Kardiomyozytennekrose initiiert die fibrotische Reaktion, und nachfolgende nachteilige fibrotische Remodellierung kann unabhängig von der Ätiologie auftreten. Die Suche nach einem Weg zur Kontrolle der Herzfibrose wäre klinisch vorteilhaft für die Behandlung von ischämischen und idiopathischen Kardiomyopathien, hypertensiven Herzkrankheiten, hypertrophen Kardiomyopathien, Herzklappenerkrankungen und Dystrophinopathien 23-42. Unabhängig davon, wie der fibrotische Krankheitsprozess beginnt, können lösliche, profibrotische Faktoren den interstitiellen Raum durchqueren und die Aktivierung von interstitiellen und adventitiellen Fibroblasten an Stellen provozieren, die von der anfänglichen fibrotischen Narbe entfernt sind, wodurch ein Kaskadeneffekt entsteht, der schließlich zu Herzinsuffizienz führt. Das optimale Szenario wäre, den fibrillogenen Prozess mit einem gezielten Therapeutikum auszunutzen, das während des kompensativen hypertrophen Stadiums der Kardiomyopathie angewendet werden kann, bevor es zu einem systolischen Pumpenversagen, einer diastolischen Herzinsuffizienz oder anderen Ergebnissen im Endstadium kommt. Das ultimative Ziel wäre es, die Fibrose rückgängig zu machen, so dass tote Kardiomyozyten ersetzt und die Herzfunktion vollständig wiederhergestellt werden kann. 
Die Bedeutung der Matrix ist weithin bekannt, doch Methoden zur Untersuchung der Matrix beschränken sich hauptsächlich auf quantitative Messungen der wichtigsten Strukturkomponenten, insbesondere Kollagen, und relative Konzentrationen verschiedener Matrix- und matrizellulärer Proteine. Dieses Protokoll hebt eine selten verwendete Technik hervor, die zur Beurteilung qualitativer Unterschiede in der Herzmatrix nützlich ist. Diese Technik wurde kürzlich verwendet, um grundlegende Unterschiede in Herzmatrizen aus verschiedenen Ätiologien von Herzerkrankungen (in menschlichen Explantaten) zu vergleichen und gegenüberzustellen, um Herzen von Schweinen nach einem Infarkt zu untersuchen, die mit der Isoform des glialen Wachstumsfaktors (GGF) von Neuregulin-1β behandelt wurden, im Vergleich zu unbehandelten Tieren 43, und um auf Unterschiede in den Matrizen von Herzgeweben aus mdx zu untersuchen Mäuse (ein häufig verwendetes Tiermodell der Duchenne-Muskeldystrophie) in unterschiedlichem Alter und im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen. Diese Technik wurde erstmals 1979 von Dr. Caulfield und Dr. Borg eingeführt 44, aber nur wenige Studien haben seitdem diese leistungsstarke Technik 45-47 verwendet, die hier mit nur geringfügigen Modifikationen wieder eingeführt wurde. Diese Methodik ist ein wertvolles Forschungsinstrument, da sie qualitative Informationen über die Ultrastruktur der extrazellulären Matrix liefert, die sonst bei der einfachen Messung des Gehalts an Matrixkomponenten und/oder des Grades der Fibrose übersehen werden könnten.

<table><tbody><tr><td>Calciumchlorid-Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences</td><td>12340</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Kohlenstoff-Klebe-Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences</td><td>12664</td><td>30 g</td></tr><tr><td>Kohlenstoff-Klebelaschen</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>77825</td><td>Reihenfolge der Montage von Stummeln</td></tr><tr><td>Doppelschneidige Rasierklingen Edelstahl</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td>250/Packung</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Elektron Microscopy Sciences</td><td>15055</td><td>450 ml</td></tr><tr><td>Gluteraldehyd, 50% Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>16310</td><td>EM-Qualität, destillationsgereinigte</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>16760 oder 16770</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Mononatriumphosphat NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9251-250G</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Osmium Tetroxid</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>19100</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Silber Leitfähiger Klebstoff</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>12686-15</td><td>15 g</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Gerbsäure, 5% Wässrig&nbsp;</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>21702-5</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Trihydrat Natrium-Cacodylat</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>12300</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Gold-Palladium-Legierung oder Gold</td><td>Refining Systems, Inc.&nbsp;</td><td>variiert</td><td>spezifisch für die Marke und das Modell des Sputter-Coaters</td></tr><tr><td>Critical Point Dryer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>850</td><td></td></tr><tr><td>Plain Wooden Applicators</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-102</td><td></td></tr><tr><td>Quanta 250 Environmental REM</td><td>FEI</td><td>Q250 REM</td><td></td></tr><tr><td>Sputter Coater</td><td>Cressington Scientific Instruments Ltd.</td><td>Modell 108</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium-REM-Probenstiche</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>75220-12</td><td>spezifisch für das Mikroskop</td></tr></tbody></table>

rasterelektronenmikroskopie von mazerierte gewebe zu visualisieren die extrazelluläre matrix

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrose ist ein Bestandteil aller Formen von Herzerkrankungen, unabhängig von der Ätiologie, und obwohl auf dem Gebiet der kardiologischen Matrixbiologie große Fortschritte gemacht wurden, gibt es immer noch große Lücken in Bezug darauf, wie die Matrix gebildet wird, wie sich physiologische und pathologische Umgestaltung unterscheiden und vor allem, wie die Matrixdynamik manipuliert werden könnte, um die Heilung zu fördern und die Fibrose zu hemmen. Es gibt derzeit keine Behandlungsmöglichkeit, um Herzfibrose zu kontrollieren, zu verhindern oder umzukehren. Ein Teil des Grundes ist wahrscheinlich die schiere Komplexität der kardialen Narbenbildung, wie sie nach einem Myokardinfarkt auftritt, um tote oder sterbende Kardiomyozyten sofort zu ersetzen. Die extrazelluläre Matrix selbst ist am Umbau beteiligt, indem sie ansässige Zellen aktiviert und auch dabei hilft, infiltrierende Zellen zur erloschenen Läsion zu führen. Die Matrix ist auch eine Art Speicherschrank für matrizelluläre Proteine, die für den normalen Matrixumsatz sowie für die fibrotische Signalübertragung entscheidend sind. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Matrix eine elektromechanische Rolle im Herzgewebe spielt. Die meisten Techniken zur Beurteilung der Fibrose sind nicht qualitativer Natur, sondern liefern quantitative Ergebnisse, die für den Vergleich zweier Gruppen nützlich sind, aber keine Informationen über die zugrunde liegende Matrixstruktur liefern. Hervorgehoben wird hier eine Technik zur Visualisierung der Ultrastruktur der Herzmatrix. Die Rasterelektronenmikroskopie von dezellularisiertem Herzgewebe zeigt auffällige Unterschiede in der Struktur, die mit herkömmlichen quantitativen Forschungsmethoden sonst übersehen würden.

Der markierte Technik wurde zu Herzgewebe von einem nicht verwendeten menschlichen Herztransplantation Spender (Abbildung 1), explantiert Gewebe von Transplantatempfängern, Herzen von Wildtyp und dystrophischen Mäuse (Abbildung 3) aufgebracht wird , und in der Post-Myokardinfarkt Herzproben von einem Schwein Modell der Herzverletzung (Abbildung 2). Wie in 1 gezeigt ist , ist der menschliche Herz Matrix ein kompliziertes ...

Hier ist eine Methode zur Visualisierung der extrazellulären Matrix-Ultrastruktur in dezellularisiertem Herzgewebe dargestellt.

Rasterelektronenmikroskopie von Mazerierte Gewebe zu visualisieren die extrazelluläre Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, die Struktur der kardialen Matrix in Abwesenheit von Zellen oder anderen Nicht-Matrix-Materialien sichtbar zu machen. Diese Methode kann zentrale Fragen auf dem Gebiet der Fibrose beantworten, insbesondere wie Unterschiede im Matrixgehalt die Organisation der Matrix beeinflussen können und wie diese Veränderungen verschiedene Kardiomyopathien oder andere fibrotische Erkrankungen beeinträchtigen könnten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine qualitative Darstellung der Matrix liefert, die zur Ergänzung quantitativer Messungen verwendet werden kann.Die Idee, diese Technik anzuwenden, kam Dr. Galindo und Dr. Sawyer erstmals, nachdem sie festgestellt hatten, dass eine regelmäßige Behandlung von Schweinen nach einem Infarkt Veränderungen in der Genexpression hervorrief, die jenen Veränderungen im Matrixgehalt nach der Behandlung ähnelten. Personen, die neu in dieser Methode sind, könnten Schwierigkeiten haben, wenn sie nicht über frühere Erfahrungen in der Probenpräparation für das Rasterelektronenmikroskop verfügen, da feinmotorische Fähigkeiten erforderlich sind. Die Gewebeprobe sollte groß genug sein, um leicht sichtbar zu sein, und in einer vierprozentigen Glutaraldehydlösung bei vier Grad Celsius gelagert werden.Entfernen Sie das Gewebe aus der Kälte und spülen Sie es mit destilliertem Wasser ab. Tauchen Sie das Gewebe anschließend in eine frisch aus Pellets in Wasser hergestellte Lösung mit 10 Prozent Natriumhydroxid. Achten Sie darauf, die erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen zu treffen.Das Gewebe sechs bis zehn Tage lang bei Raumtemperatur in der Natriumhydroxidlösung belassen. Fortfahren, sobald die Farbe des Gewebes cremeweiß oder weiß wird. Anschließend das Gewebe mit destilliertem Wasser abspülen, bis es transparent ist.Als Nächstes Handschuhe anziehen und das Gewebe vier Stunden lang bei Raumtemperatur in einprozentiger Tanninsäure einlegen. Nach dem Tanninsäurebad das Gewebe über Nacht in destilliertem Wasser spülen. Zur Vorbereitung im Abzug unter Tragen von Handschuhen eine 0,2-molare Stammlösung aus Natriumcacodylatpuffer und eine zweiprozentige wässrige Stammlösung aus Osmiumtetroxid herstellen.Verwenden Sie eine Spritzschutzscheibe, da Osmiumtetroxid eine starke Inhalationsgefahr darstellt. Stellen Sie nun eine 0,1-molare Verdünnung des Natriumcacodylatpuffers her und inkubieren Sie das Gewebe unter leichtem Rühren fünf Minuten darin. Wechseln Sie den Puffer zweimal, um das Gewebe insgesamt dreimal mit Natriumcacodylat zu waschen.Anschließend stellen Sie eine Mischung im Verhältnis 1:1 aus der Stammlösung Natriumcacydylat und der Stammlösung Osmiumtetroxid her. Inkubieren Sie das Gewebe eine Stunde lang auf einem Rotator in dieser neuen Mischung. Danach geben Sie das Gewebe zurück in 0,1-molare Natriumcacydylatlösung und inkubieren es unter leichtem Rühren für fünf Minuten.Wechseln Sie diese Bade­lösung zweimal innerhalb von 15 Minuten. Anschließend dehydrieren Sie das Gewebe durch eine Reihe von Ethanolbädern mit zunehmender Konzentration. Lassen Sie das Gewebe jeweils 15 Minuten unter leichtem Schütteln in jedem Bad einwirken.Als Nächstes überführen Sie das Gewebe und die Lösung in eine flache Petrischale, die mit 100 Prozent Ethanol gefüllt ist. Danach halten Sie vorsichtig zwei sehr scharfe Rasierklingen so, dass die flachen Seiten aneinander anliegen und die Schneiden sich kreuzen, sodass sie oberhalb der Probe zwei Seiten eines gleichseitigen Dreiecks bilden. Platzieren Sie nun mit der schreibenden Hand die zweite Klinge am äußersten linken Rand der Probe und schneiden Sie nach rechts.Verschieben Sie daher die Klingen aus entgegengesetzten Richtungen gegeneinander, um einen einzigen glatten Schnitt mit minimaler Verzerrung oder reißender Kraft auszuführen. Ziel ist es, eine möglichst große Oberfläche freizulegen, ohne die Probe zu beschädigen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis genügend zufriedenstellende Querschnitte zur Untersuchung mittels REM vorbereitet wurden.Überführen Sie das Gewebe mit einem Spatel oder einer Pinzette in den Probenträger der CPD, wobei das Gewebe in 100 Prozent Ethanol eingetaucht bleiben muss. Das Gewebe darf nicht länger als einige Sekunden der Luft ausgesetzt sein. Verwenden Sie die CPD, um das Ethanol durch flüssiges Kohlendioxid zu ersetzen, und führen Sie den Trocknungszyklus gemäß den Herstellerangaben durch.Danach bereiten Sie für jede Probe einen REM-Probenhalter vor. Befestigen Sie eine Kohleklebefolie auf der Oberseite des Aluminiumhalters. Befestigen Sie unter dem Stereomikroskop die Probe vorsichtig auf der Klebefolie, sodass die interessierende Querschnittsfläche nach oben, weg von der Folie, zeigt und möglichst plan mit der Oberfläche des Halters abschließt.Untersuchen oder berühren Sie die Oberfläche von Interesse nicht. Bei den kleinsten und schwierigsten Proben brechen Sie den Holzstäbchenapplikator, um ihn als Spatel zu verwenden. Arbeiten Sie außerdem über einem großen Stück Filterpapier, um den Verlust einer heruntergefallenen Probe zu vermeiden.Zur Verbesserung der Haftung verwenden Sie einen gebrochenen Applikatorstab, um einen kegelförmigen Pinsel herzustellen, und tragen Sie Silber- oder Kohlepaste auf die Unterseite und Seiten des Probenstücks auf. Ziehen Sie eine sehr dünne Linie der Paste bis an eine Kante der gewünschten Oberfläche heran. Dadurch entsteht ein Leitungsweg für die Ladung von der gewünschten Oberfläche zur Masse. Tragen Sie anschließend zwei oder drei kleine Tupfen Farbe um den Rand der Kohlenstofflasche auf, um einen leitfähigen Pfad von der Oberfläche der Lasche zur Metallhalterung zu schaffen. Dies dient als Erdung. Stellen Sie die Probe beiseite und lassen Sie die leitfähige Farbe zwei Stunden lang trocknen.Nach dem Trocknen einen Sputter-Beschichter betreiben, um eine relativ dicke Schicht aus Gold-Palladium-Legierung oder Gold auf die Probe aufzubringen. Eine Schichtdicke von 30 bis 40 Nanometern ist anzustreben. Die Rasterelektronenmikroskopie bei einer relativ niedrigen Beschleunigungsspannung durchführen, um Probleme aufgrund schlechter Ladungsableitung in der Probe zu minimieren.Verwenden Sie den variablen Druckmodus, falls verfügbar. Verbessern Sie zunächst den Arbeitsabstand, um eine ausreichende Schärfentiefe zu erzielen, um auf Fasern in der Z-Dimension fokussieren zu können. Öffnen Sie dazu die Registerkarte „Navigation“ oben rechts.Danach über die Bühnenmenü die Registerkarte „Koordinaten“ aufrufen. Dort einen größeren Wert für die Z-Koordinate eingeben, beispielsweise 20 Millimeter. Zum Schluss die Registerkarte „Gehe zu“ drücken, um die Änderung auszuführen.Als Nächstes positionieren Sie die Oberfläche von Interesse senkrecht zum Elektronenstrahl. Klicken und halten Sie die rechte Maustaste gedrückt und bewegen Sie die Maus nach links oder rechts, um die Probe nahe dem Rand der präparierten Oberflächenebene von Interesse zu fokussieren. Notieren Sie sich den fokussierten Arbeitsabstand.Danach mithilfe des manuellen Joysticks der Benutzeroberfläche die Ansicht zur gegenüberliegenden Kante bewegen und die Fokussierungsmethode wiederholen. Falls sich der Arbeitsabstand geändert hat, kippen Sie die Probe, um an beiden Positionen eine annähernde Übereinstimmung zu erreichen. Verwenden Sie die Registerkarte „Coordinates“ im Stage-Menü und geben Sie einen Neigungswert in die T-Koordinate ein.Drehen Sie nun die Probe um 90 Grad, indem Sie diesen Wert in das Koordinatenfeld R eingeben. Wiederholen Sie anschließend den Kippvorgang, bis alle Positionen in etwa dem gleichen Arbeitsabstand fokussiert sind. Die beschriebene Technik wurde auf Herzgewebe aus einer ungenutzten Spenderherztransplantation angewendet.Die humane Herzmatrix ist ein komplexes Geflecht aus vernetzten Proteinen, das im Querschnitt einem wabenförmigen Muster gleicht. Jede Wabenstruktur ist etwa 40 Mikrometer breit und umschließt normalerweise ein einzelnes Kardiomyozyt. Wenn mehrere Kardiomyozyten durch Interkalatediscs verbunden sind, kann man sie sich als einen stabförmigen Strang vorstellen, der längs durch eine tunnelartige Struktur verläuft.Neben der Bereitstellung struktureller Informationen kann ein REM von dezellularisierten Geweben eine aussagekr&auml;ftige qualitative Beurteilung im Hinblick auf Verletzungen oder nicht-verletzende Formen der Kardiomyopathie erm&ouml;glichen, wie beispielsweise infarziertes Herzgewebe von einem Schwein. In einer separaten Studie zeigte sich, dass das GGF2-Isoform von NRG-1 beta eine potenzielle therapeutische Behandlung f&uuml;r Herzinsuffizienz darstellt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man Gewebe, insbesondere Herzgewebe, f&uuml;r das Rasterelektronenmikroskop aufbereitet, einschlie&szlig;lich der Technik zur Freilegung der gew&uuml;nschten Oberfl&auml;che und zur Montage der Probe.Nach diesem Verfahren können andere Techniken wie Massenspektrometrie, RNA-Sequenzierung und verschiedene andere Assays verwendet werden, um Proteine der extrazellulären Matrix sowie andere für Signalgebung und andere organisationsbezogene Beobachtungsphänomene verantwortliche Faktoren zu messen. Beachten Sie außerdem, dass Osmiumtetroxid aufgrund der möglichen Dampffixierung an Schleimhäuten eine gefährliche Chemikalie ist. Arbeiten Sie stets in einer Abzugshaube mit Nitrilhandschuhen und verwenden Sie eine Spritzschutzscheibe oder Abzugsschiebe.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben die prototypische Verfahren zur Herstellung Mikroskop Deckgläser mit fluoreszierenden Gelatine zur Visualisierung invadopodia-vermittelte Matrixabbau beschichtet. Rechenverfahren Verwendung verfügbarer Software für die Quantifizierung der resultierenden Ebenen der Matrix Proteolyse durch einzelne Zellen innerhalb einer Mischpopulation und für Gruppen, die vielzelligen gesamte mikroskopische Felder dargestellt.

Quantitative Messung der Invadopodia-vermittelte extrazellulären Matrix Proteolyse in Einzel-und Multizelluläre Contexts

Die extrazelluläre Matrix unterliegt erheblichen Umbau während der Wundheilung, Entzündung und Tumorgenese. Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz Intravital-Immunfluoreszenz-Mikroskopie, die Dynamik der Fibrillen sowie netzartige Matrix-Komponenten mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mit Epi-Fluoreszenz-oder Zwei-Photonen-Mikroskopie visualisieren.

Langzeit-Intravitalimmunfluoreszenz-Imaging von Gewebematrix Bestandteile mit Epifluoreszenz und Zwei-Photonen-Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Anreicherung von EZM-Proteinen aus Geweben oder Tumoren und zur Deglykosylierung und Verdauung der mit EZM angereicherten Präparate zu Peptiden, um ihre Proteinzusammensetzung durch Massenspektrometrie zu analysieren.

Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen aus Gewebe und Verdauung in Peptide für Massenspektrometrie-Analyse

Wir stellen eine Protokoll-Zellen abgeleiteten Matrices reich an extrazellulären Matrixproteinen zu erhalten, unter Verwendung von hochmolekularen Crowders (MMC). Darüber hinaus präsentieren wir ein Protokoll, das MMC in 3D organotypischen Haut Co-Kultur-Generation enthält, die Kulturzeit reduziert, während Laufzeit von Konstrukt beibehalten wird.

Die Verbesserung der 2D- und 3D-Haut<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen mithilfe von Macromolecular Crowding

Die extrazelluläre Matrix spielt eine wichtige Rolle bei der Definition der Mikroumgebung von Zellen und bei der Modulation des Zellverhaltens und des Phänotyps. Wir beschreiben eine schnelle Methode zur Isolierung zelleigener extrazellulärer Matrix, die für mikroskopische, biochemische, proteomische oder funktionelle Studien an verschiedene Skalen angepasst werden kann.

Eine schnelle, skalierbare Methode für die Isolierung, Funktionelle Untersuchung und Analyse von Zellen abgeleiteten Extrazellulärmatrix

Makrophagen extrazelluläre fallen sind eine neu beschriebene Einheit. Dieser Artikel konzentriert sich auf Methoden der konfokalen Mikroskopie und wie sie sind visualisiert in Vitro und in Vivo aus Lunge Proben.

Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

Das Ziel dieses Protokolls ist Produktion der gesamten extrazelluläre Matrix Fasern für Wunde Reparatur gezielt die für präklinische Evaluierung im Rahmen eines Implantates, regenerative Gerüst geeignet sind. Diese Fasern hergestellt durch die Kultur der Fibroblasten auf Hohlfaser-Membranen und durch Auflösung der Membranen extrahiert.

Produktion von Fasern der extrazellulären Matrix über Opfer Hohlfaser-Membran Zellkultur

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Dezellularisierung und anschließenden Hydrogelbildung von murinen Brustfettpolstern nach ex vivo Bestrahlung dar.

Untersuchung normaler Gewebestrahlungseffekte mit extrazellulären Matrixhydrogelen

Wir beschreiben die Vorbereitung von Bändern serieller Schnitte und deren Sammlung auf großen Transferträgern für den Einsatz als Array-Tomographie-Proben sowie automatisierte Bildgebungsverfahren in einem Rasterelektronenmikroskop. Das Protokoll ermöglicht das Screening, den Abruf und die gezielte Bildgebung lokaler, seltener Ereignisse und die Erfassung großer Datenmengen.

Array-Tomographie-Workflow zur gezielten Erfassung von Volumeninformationen mittels Rasterelektronenmikroskopie

Das vorliegende Protokoll optimiert die Methoden der  Leber-in-situ-Perfusion/Dezellularisierung und der Zwei-Photonen-Mikroskopie, um eine zuverlässige Plattform zur Visualisierung der Dynamik des Remodells der extrazellulären Matrix (EZM) während der nicht-alkoholischen Steatohepatitis (NASH) zu schaffen.

3D-Bildgebung der extrazellulären Matrix der Leber in einem Mausmodell der nicht-alkoholischen Steatohepatitis

Wir schlagen ein Protokoll zur Bewertung der Knochenregeneration auf verschiedenen hierarchischen Ebenen vor. Dieser multimodale Ansatz ermöglicht Strukturanalysen über verschiedene Längenskalen hinweg und adressiert so effektiv Herausforderungen bei der Probenvorbereitung. Es bietet zudem einen zuverlässigen Arbeitsablauf zur Bewertung der Wirksamkeit von Biomaterialien bei der Förderung der Knochenregeneration.

Multimodaler Ansatz zur Bewertung der Knochenregeneration und der Gerüstleistung

Lernen Sie die Rasterelektronenmikroskopie von mazeriertem Herzgewebe zur Visualisierung der extrazellulären Matrix. Diese Methode ermöglicht qualitative Einblicke in Matrixstrukturen bei Fibroseforschung.

Rasterelektronenmikroskopie von Mazerierte Gewebe zu visualisieren die extrazelluläre Matrix

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