Rasterelektronenmikroskopie von Mazerierte Gewebe zu visualisieren die extrazelluläre Matrix

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Struktur der Herzmatrix in Abwesenheit von Zellen oder anderen Nicht-Matrix-Materialien sichtbar zu machen. Diese Methode kann Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Fibrose beantworten, insbesondere wie sich Unterschiede im Inhalt der Matrix auf die Organisation der Matrix auswirken können und wie sich diese Veränderungen auf verschiedene Kardiomyopathien oder andere fibrotische Erkrankungen auswirken können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine qualitative Sicht auf die Matrix bietet, die zur Erweiterung quantitativer Messungen verwendet werden kann.

Dr. Galindo und Dr. Sawyer hatten erstmals die Idee, diese Technik zu verwenden, nachdem sie festgestellt hatten, dass die regelmäßige Behandlung von Schweinen nach einem Infarkt Veränderungen in der Genexpression aufwies, die den Veränderungen des Matrixgehalts nach der Behandlung ähnelten. Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, können aufgrund der erforderlichen Feinmotorik Schwierigkeiten haben, wenn sie noch keine Erfahrung mit der Vorbereitung von REM-Proben haben. Die Gewebeprobe sollte groß genug sein, um gut sichtbar zu sein, und in einer vierprozentigen Glutaraldehydlösung bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Nehmen Sie das Tuch aus dem Kühlhaus und spülen Sie es mit destilliertem Wasser ab. Tauchen Sie dann das Gewebe in eine Lösung aus 10 Prozent Natriumhydroxid, die frisch aus Pellets in Wasser hergestellt wird. Achten Sie darauf, die richtigen Vorsichtsmaßnahmen zu treffen.

Bewahren Sie das Gewebe sechs bis 10 Tage bei Raumtemperatur in der Natronlauge auf. Fahren Sie fort, wenn die Farbe des Gewebes cremefarben oder weiß wird. Spülen Sie dann das Tuch mit destilliertem Wasser ab, bis es transparent wird.

Ziehen Sie anschließend Handschuhe an und tauchen Sie das Gewebe vier Stunden lang bei Raumtemperatur in einprozentige Gerbsäure. Spülen Sie das Tuch nach dem Gerbsäurebad über Nacht in destilliertem Wasser aus. Zur Vorbereitung wird in einem Abzug mit Handschuhen eine 0,2 molare Stammlösung aus Natriumcacodylatpuffer und eine zweiprozentige wässrige Stammlösung aus Osmiumtetroxid hergestellt.

Verwenden Sie einen Spritzschutz, da Osmiumtetroxid eine starke Gefahr für das Einatmen darstellt. Nehmen Sie nun eine 0,1-molare Verdünnung des Natriumcacodylatpuffers vor und inkubieren Sie das Gewebe darin fünf Minuten lang unter leichtem Rühren. Wechseln Sie den Puffer zweimal, um das Tuch insgesamt dreimal mit Natriumcacodylat zu waschen.

Stellen Sie als Nächstes eine Eins-zu-Eins-Mischung aus dem Stamm-Natriumcacodylat und dem Stamm-Osmiumtetroxid her. Inkubieren Sie das Gewebe in der neuen Mischung eine Stunde lang auf einem Rotator. Später wird das Gewebe wieder auf 0,1 molare Natriumcacodylat zurückgeführt und unter leichtem Rühren fünf Minuten lang inkubiert.

Wechseln Sie diese Badelösung zweimal innerhalb von 15 Minuten. Dehydrieren Sie dann das Gewebe mit einer Reihe von Ethanolbädern mit zunehmender Konzentration. Lassen Sie das Taschentuch in jedem Bad 15 Minuten unter leichtem Rühren einweichen.

Übertragen Sie anschließend das Gewebe und die Lösung in eine flache Petrischale, die mit 100 Prozent Ethanol gefüllt ist. Halten Sie dann vorsichtig zwei sehr scharfe Rasierklingen so, dass die Abflachungen der Seiten miteinander in Kontakt sind und sich die Schneidkanten kreuzen, um zwei Seiten eines gleichseitigen Dreiecks über der Probe zu bilden. Platzieren Sie nun mit Ihrer dominanten Hand die zweite Klinge ganz links auf der Probe und schneiden Sie nach rechts.

Schieben Sie die Klingen also aus entgegengesetzten Richtungen gegeneinander, um einen einzigen glatten Schnitt mit minimalem Verzug oder Reißkraft zu erzielen. Ziel ist es, eine möglichst große Oberfläche freizulegen, ohne die Probe zu beschädigen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis genügend zufriedenstellende Querschnitte für die Untersuchung durch das REM vorbereitet sind.

Übertragen Sie das Gewebe mit einem Spatel oder einer Pinzette in den Probenhalter des CPD, während Sie das Gewebe in 100 Prozent Ethanol getaucht halten. Das Gewebe darf nicht länger als ein paar Sekunden der Luft ausgesetzt werden. Verwenden Sie den CPD, um das Ethanol durch flüssiges Kohlendioxid zu ersetzen, und führen Sie den Trocknungszyklus wie vom Hersteller angegeben durch.

Bereiten Sie dann für jede Probe einen REM-Probenstummel vor. Kleben Sie eine Carbon-Klebelasche auf die Oberseite des Aluminiumstumpfes. Unter einem Stereoskop wird die Probe vorsichtig mit der interessierenden Querschnittsfläche nach oben, von der Lasche weg und maximal planar mit der Stummeloberfläche auf die Klebelasche geklebt.

Berühren Sie nicht die zu untersuchende Oberfläche. Bei den kleinsten und schwierigsten Exemplaren brechen Sie den hölzernen Applikatorstab, um ihn als Spachtel zu verwenden. Arbeiten Sie außerdem über ein großes Stück Filterpapier, um zu vermeiden, dass eine heruntergefallene Probe verloren geht.

Um die Haftung zu verbessern, verwenden Sie einen gebrochenen Applikatorstab, um einen konischen Pinsel herzustellen, und tragen Sie Silber- oder Kohlefarbe auf die Basis und die Seiten der Probe auf. Verlängern Sie eine sehr dünne Farblinie bis zu einer Kante der interessierenden Oberfläche. Dadurch wird ein Ladungspfad von der interessierenden Oberfläche zum Boden erstellt.

Trage dann zwei oder drei kleine Farbtupfer um den Umfang der Carbonlasche auf, um einen leitenden Weg von der Oberfläche der Lasche zum Metallstummel zu schaffen. Dieser fungiert als Boden. Legen Sie die Probe beiseite und lassen Sie die leitfähige Farbe zwei Stunden trocknen.

Nach dem Trocknen betätigen Sie einen Sputter-Coater, um eine relativ schwere Schicht aus Gold-Palladium-Legierung oder Gold auf die Probe aufzutragen. Gewünscht ist eine 30 bis 40 Nanometer dicke Beschichtung. Führen Sie die Rasterelektronenmikroskopie bei einer relativ niedrigen Beschleunigungsspannung durch, um Probleme zu minimieren, die mit einer schlechten Ladungsableitung in der Probe verbunden sind.

Verwenden Sie den Modus mit variablem Druck, falls verfügbar. Verbessern Sie zunächst den Arbeitsabstand, um genügend Tiefenschärfe für die Fokussierung auf Fasern in der Z-Dimension zu erzielen. Öffnen Sie dazu oben rechts den Reiter Navigation.

Rufen Sie dann die Registerkarte Koordinaten über das Bühnenmenü auf. Geben Sie darin einen größeren Wert für die Z-Koordinate ein, z. B. 20 Millimeter. Drücken Sie abschließend auf die Registerkarte Gehe zu, um die Änderung auszuführen.

Positionieren Sie als Nächstes die interessierende Oberfläche orthogonal zum Elektronenstrahl. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, halten Sie sie gedrückt und schieben Sie sie dann nach links oder rechts, um die Probe in der Nähe des Umfangs der präparierten Oberflächenebene zu fokussieren. Achten Sie auf den fokussierten Arbeitsabstand.

Verschieben Sie dann mit dem Joystick der manuellen Benutzeroberfläche die Ansicht zur gegenüberliegenden Kante und wiederholen Sie die Fokussierungsmethode. Wenn sich der Arbeitsabstand geändert hat, kippen Sie die Probe, um eine ungefähre Übereinstimmung an beiden Stellen zu erreichen. Verwenden Sie die Registerkarte "Koordinaten" des Menüs "Bühne" und geben Sie einen Neigungswert in die T-Koordinate ein.

Drehen Sie nun die Probe um 90 Grad, indem Sie diesen Wert in das Feld R-Koordinaten eingeben. Wiederholen Sie dann den Kippvorgang, bis alle Positionen in etwa demselben Arbeitsabstand fokussiert sind. Die beschriebene Technik wurde auf Herzgewebe eines ungenutzten menschlichen Herztransplantatspenders angewendet.

Die menschliche Herzmatrix ist ein kompliziertes Geflecht aus vernetzten Proteinen, das im Querschnitt ein wabenartiges Muster aufweist. Jede Wabenstruktur ist etwa 40 Mikrometer breit und umgeht normalerweise einen einzelnen Myozyten. Wenn sie durch interkalierte Scheiben verbunden sind, kann man sich mehrere Kardio-Myozyten als einen Stab vorstellen, der in Längsrichtung durch eine tunnelartige Form verläuft.

Zusätzlich zur Bereitstellung struktureller Informationen kann ein REM von dezellularisiertem Gewebe eine aussagekräftige qualitative Bewertung als Reaktion auf Verletzungen oder nicht verletzende Formen der Kardiomyopathie ermöglichen, wie z. B. infarktes Herzgewebe eines Schweins. In einer separaten Studie wurde gezeigt, dass die GGF2-Isoform von NRG-1 beta eine potenzielle therapeutische Behandlung von Herzinsuffizienz ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man Gewebe, Herzgewebe, für das Rasterelektronenmikroskop verarbeitet, einschließlich der Technik zum Belichten der interessierenden Oberfläche und zum Montieren der Probe.

Nach diesem Verfahren können andere Techniken wie Massenspektrometrie, RNA-Sequenzierung und verschiedene andere Assays verwendet werden, um extrazelluläre Matrixproteine und andere für die Signalübertragung und andere organisatorische Beobachtungsphänomene verantwortliche Proteine zu messen. Vergessen Sie auch nicht, dass Osmiumtetroxid eine gefährliche Chemikalie ist, da es zur Dampffixierung der Schleimhäute kommen kann. Denken Sie immer daran, in einem Abzug mit Nitrilhandschuhen zu arbeiten, einen Spritzschutz oder eine Haubenschärpe zu verwenden.