Die Erzeugung von ESC-derived Maus Airway epithelialen Zellen unter Verwendung von Dezellularisierte Lung Scaffolds

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in reife Atemwegsepithelzellen mithilfe eines 3D-Kultursystems mit entzellten Lungen-Scaffolds zu steuern. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Lungenentwicklung zu beantworten, beispielsweise die Rolle von Zell-Matrix-Kontraktionen und Wachstumsfaktor-Signalwegen während der Differenzierung entlang der Lungen-Linie. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein 3D-Kultursystem unter definierten, serumfreien Bedingungen verwendet und eine robuste Differenzierung in Atemwegsepithelzellen mit geringer Kontamination durch andere Endoderm-Linien ermöglicht. Nach der Tötung einer erwachsenen Wistar-Ratte gemäß dem Textprotokoll fixieren Sie das Tier auf einer Präparationsfläche, indem Sie Vorder- und Hinterbeine befestigen, und besprühen Brust und Bauch mit 70 %igem Ethanol. Führen Sie einen Schnitt direkt unterhalb des Rippenbogens durch. Schneiden Sie durch die Haut und legen Sie das Zwerchfell frei. Anschließend führen Sie kleine Einschnitte im Zwerchfell durch, um eine Rückziehung der Lungen zu bewirken und die Wahrscheinlichkeit eines Lungenstichs zu verringern. Danach führen Sie einen vertikalen Schnitt entlang des Brustbeins durch und öffnen die Brusthöhle, um Herz und Lungen freizulegen. Legen Sie dann mit einer Naht die untere Hohlvene ab und setzen Sie mit kleinen Präzisionsscheren einen kleinen Einschnitt in den linken Vorhof. Beginnen Sie die Lungenperfusion mit einer vorbereiteten 10-ml-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel, die mit heparinisiertem Hank’s Balanced Salt Solution gefüllt ist, indem Sie die Nadel in den rechten Ventrikel einführen und den Puffer durch den Lungenkreislauf drücken. Setzen Sie die Perfusion fort, bis die Lungen weiß erscheinen und die aus dem linken Vorhof abfließende Flüssigkeit klar ist. Nach der Perfusion legen Sie die Luftröhre frei und führen nahe am Schilddrüsenknorpel einen kleinen Einschnitt für die Kanülierung durch. Kanülieren Sie anschließend die Luftröhre mit einer Kunststoffkanüle und sichern Sie diese mit einer Naht. Richten Sie nun ein Schwerkraft-Perfusionssystem ein, indem Sie eine 10-ml-Spritze an einem Stativ mit Klemme befestigen. Entfernen und entsorgen Sie den Spritzenkolben. Markieren Sie die maximale Füllhöhe am Spritzenzylinder 20 cm über den Lungen, befestigen Sie einen 2-Wege-Hahn am Ende der Spritze und schließen Sie ein langes Kunststoffrohr an das andere Ende des Hahns an. Ziehen Sie die Kanüle vorsichtig aus der Luftröhre heraus und verbinden Sie sie mit dem Ende des Kunststoffrohrs. Gießen Sie die Entzellerungslösung in die Spritze und lassen Sie die Lösung das angeschlossene Kunststoffrohr und die Kanüle vollständig füllen. Setzen Sie die mit Lösung gefüllte Kanüle erneut in die Luftröhre ein und spülen Sie die Lungen, indem Sie sie für eine Minute bis zur Gesamtlungenkapazität füllen. Entfernen Sie dann die Kanüle aus der Luftröhre, um den Abfluss der Flüssigkeit aus den Lungen zu ermöglichen. Wiederholen Sie das Spülen der Lungen acht Mal mit der Entzellerungslösung, gefolgt von zehn Spülgängen mit PBS. Nach Abschluss der Spülschritte erscheinen die Lungen weiß. Präparieren Sie anschließend die Luftröhre und die Lungen aus Hals- und Brusthöhle. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe von den präparierten Lungen, einschließlich Speiseröhre und Herz, und überführen Sie die Lungen in kaltes PBS, bis sie für den Schnitt am Vibratom vorbereitet werden. Um dicke Schnitte herzustellen, bereiten Sie etwa 15 ml 2 %ige und 4 %ige Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in PBS sowie ausreichend 6 %ige Agarose vor, um alle Lappen in kleine rechteckige Blöcke einzubetten. Nachdem Sie die Agarose in 15-ml-Röhrchen überführt haben, stellen Sie die Röhrchen auf ein Heizblock und halten Sie die Temperatur über 40 Grad Celsius, um eine Gelierung zu verhindern. Präparieren Sie die entzellenen Lungen mit kleinen Scheren an jedem Lappenbronchusende und lösen Sie jeden Lappen ab. Entfernen Sie mit saugfähigen Tüchern überschüssiges PBS und überführen Sie die Lappen für fünf Minuten auf dem Heizblock in 2 %ige Agarose, um das Gewebe zu beschichten. Nachdem Sie jeden Lappen in eine Petrischale überführt haben, stellen Sie die Schale auf eine Kühlplatte und lassen Sie die Oberfläche für eine Minute gelieren. Legen Sie die Lappen vorsichtig in 4 %ige Agarose und wiederholen Sie nach einer fünfminütigen Inkubation und Abkühlung die Beschichtung mit 6 %iger Agarose. Verwenden Sie nach der Beschichtung Metallformen, um jeden Lappen einzeln in 6 %iger Agarose einzubetten, wobei mindestens 3 ml Agarose das Gewebe an den Rändern umgeben. Orientieren Sie anschließend jeden Lappen mit einer Pinzette, indem Sie die größte flache Kante des Gewebes an der Oberfläche der Metallform so positionieren, dass sie dem Experimentator zugewandt ist, und vervollständigen Sie das Einbetten mithilfe von Kunststoffkassetten. Lassen Sie die Blöcke auf einer Kühlplatte mindestens 30 Minuten lang gelieren, bevor Sie sie am Vibratom schneiden. Alternativ können Sie die Blöcke bis zu 12 Stunden bei vier Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer lagern, bevor Sie sie am Vibratom schneiden. Um Schnitte herzustellen, richten Sie das Vibratom ein, indem Sie die Schneidkammer mit kaltem PBS füllen. Richten Sie ein umgebendes Eisbad ein, um während des Schneidens eine niedrige Temperatur aufrechtzuerhalten. Entfernen Sie nun die Blöcke aus den Metallformen und schneiden Sie mit einer Rasierklinge die überschüssige Agarose um die Lappen herum ab, wobei Sie etwa drei Millimeter Abstand zum Geweberand belassen. Befestigen Sie das Gewebe mit Klebstoff in der Mitte der Probenträgerplatte und tauchen Sie die Platte in die mit PBS gefüllte Schneidkammer ein. Montieren Sie die Schneidklinge am Vibratom. Stellen Sie die Schneidbegrenzungen am Vibratom ein, indem Sie jeweils folgende Werte für Geschwindigkeit, Amplitude und Dicke wählen. Schneiden Sie jeden Lappen vollständig durch und trennen Sie die Schnitte bei Bedarf mit kleinen Scheren manuell voneinander ab. Sammeln Sie die Scaffold-Schnitte vorsichtig ein und überführen Sie sie in kaltes PBS. Lösen Sie jeden Schnitt mit einer Pinzette vorsichtig von der umgebenden Agarose. Um die Scaffold-Schnitte zu desinfizieren, geben Sie nach dem Überführen in Mikrozentrifugenröhrchen 90 Einheiten pro Milliliter Nuklease in PBS hinzu und inkubieren Sie die Proben 12 bis 24 Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Überführen Sie die Schnitte gemäß dem Textprotokoll in neue Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie unter sterilen Bedingungen antimikrobielle Lösung hinzu und inkubieren Sie sechs Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Anschließend spülen Sie die Scaffolds unter sterilen Bedingungen zweimal mit PBS, überführen Sie sie in serumfreies Medium (SFDM) und beimpfen Sie sie mit Zellen. Um eine Luft-Flüssig-Grenzflächenkultur einzurichten, platzieren Sie mit sterilen Pinzetten hydrophobe Membranen in eine Petrischale. Überführen Sie anschließend jeden entzellenen Scaffold-Schnitt aus SFDM auf eine Membran und stellen Sie sicher, dass die Schnitte gleichmäßig auf der Membran verteilt sind. Bereiten Sie 6- oder 12-Loch-Platten vor, indem Sie die Vertiefungen jeweils mit 1 ml oder 0,5 ml SFDM füllen. Setzen Sie die Membranen vorsichtig in die Vertiefungen, sodass sie auf dem Medium schwimmen und so eine Luft-Flüssig-Grenzflächenkultur entsteht. Um 3D-Scaffolds zu beimpfen, zählen Sie nach der Vorbereitung der endodermalen Zellen und der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung zur Anreicherung definitiven Endoderms die sortierten Zellen mit einem Hämozytometer. Zentrifugieren Sie die Zellen anschließend fünf Minuten lang mit 400 × g. Lösen Sie die Zellpellets in SFDM erneut auf, sodass etwa 100.000 Zellen in 10