Die Erzeugung von ESC-derived Maus Airway epithelialen Zellen unter Verwendung von Dezellularisierte Lung Scaffolds

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in reife Epithelzellen der Atemwege zu lenken, wobei eine 3D-Kultur mit dezellularisierten Lungengerüsten verwendet wird. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Lungenentwicklung zu beantworten, wie z.B. die Rolle von Zellmatrixkontraktionen und Wachstumsfaktor-Signalwegen bei der Differenzierung der Lungenlinie. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein 3D-Kultursystem in einer definierten serumfreien Umgebung verwendet und eine robuste Epitheldifferenzierung der Atemwege mit begrenzter Kontamination durch andere Endodermlinien erreicht. Nach der Einschläferung einer erwachsenen Wistar-Ratte befestigen Sie das Tier gemäß dem Textprotokoll an einer Präparierfläche, indem Sie Vorderpfoten und Hinterbeine fixieren, und verwenden Sie 70%iges Ethanol, um Brust und Bauch zu besprühen. Erstelle einen Schnitt direkt unter dem Brustkorb. Schneide durch die Haut und lege das Zwerchfell frei. Machen Sie dann kleine Schnitte durch das Zwerchfell, um die Lunge zurückzuziehen und die Wahrscheinlichkeit einer Punktion in der Lunge zu verringern. Erstellen Sie als Nächstes einen vertikalen Schnitt entlang des Brustbeins und öffnen Sie die Brusthöhle, um Zugang zu Herz und Lunge zu erhalten. Ligatieren Sie dann mit einer Naht die untere Hohlvene und setzen Sie mit einer kleinen Präparierschere einen kleinen Schnitt in den linken Vorhof. Starten Sie mit einer vorbereiteten 10-ml-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel, die mit heparinisierter Hank's Balance-Salzlösung gefüllt ist, die Lungenperfusion, indem Sie die Nadel in den rechten Ventrikel einführen und den Puffer durch den Lungenkreislauf drücken. Setzen Sie die Perfusion fort, bis die Lungen weiß werden und die Flüssigkeit, die aus dem linken Vorhof fließt, klar wird. Nach der Perfusion legen Sie die Luftröhre frei und machen Sie einen kleinen Schnitt in der Nähe des Schilddrüsenknorpels für die Kanulation. Dann können Sie die Luftröhre mit einem Kunststoffkatheter kanülieren und mit einer Naht an Ort und Stelle fixieren. Richten Sie nun ein Schwerkraftperfusionssystem ein, indem Sie eine 10-ml-Spritze an einem Retortenständer und einer Klemme befestigen. Entfernen Sie dann den Spritzenkolben und entsorgen Sie ihn. Befestigen Sie den maximalen Füllpunkt auf dem Spritzenzylinder in 20 cm Höhe über der Lunge und befestigen Sie dann einen Zwei-Wege-Absperrhahn am Ende der Spritze und einen langen Kunststoffschlauch am anderen Ende des Absperrhahns. Ziehen Sie den Katheter vorsichtig aus der Luftröhre heraus und befestigen Sie ihn am Ende des Kunststoffschlauchs. Gießen Sie dann die Dezellularisierungslösung in die Spritze und lassen Sie die Lösung den beigefügten Kunststoffschlauch und den Katheter vollständig füllen. Legen Sie den mit Lösung gefüllten Katheter wieder in die Luftröhre und spülen Sie die Lunge, indem Sie ihn eine Minute lang bis zur vollständigen Lungenkapazität füllen. Entfernen Sie dann den Katheter aus der Luftröhre, damit die Flüssigkeit aus der Lunge fließen kann. Wiederholen Sie die Spülung der Lunge achtmal mit Dezellularisierungslösung, gefolgt von zehn Spülungen mit PBS. Die Lunge erscheint weiß, wenn die Spülschritte abgeschlossen sind. Präparieren Sie dann die Luftröhre und die Lunge aus dem Hals und der Brusthöhle. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe aus der präparierten Lunge, einschließlich der Speiseröhre und des Herzens, und übertragen Sie die Lunge dann in kaltes PBS, bis sie für den Vibratomschnitt vorbereitet ist. Um dicke Schnitte herzustellen, stellen Sie etwa 15 ml Agarose mit einem niedrigen Schmelzpunkt von 2 % und 4 % in PBS her und genug 6 % Agarose, um alle Lappen in kleine rechteckige Blöcke einzubetten. Nachdem Sie die Agarose in 15-ml-Röhrchen umgefüllt haben, legen Sie die Röhrchen auf einen Wärmeblock und halten Sie die Temperatur über 40 Grad Celsius, um ein Gelieren zu vermeiden. Präparieren Sie mit einer kleinen Schere die dezellularisierte Lunge am Ende jedes Lappenbronchus und lösen Sie jeden Lappen. Verwenden Sie dann saugfähige Blätter, um überschüssiges PBS zu entfernen, und übertragen Sie die Lappen fünf Minuten lang auf 2%Agarose auf den Heizblock, um das Gewebe zu beschichten. Nachdem Sie jeden Lappen in eine Petrischale gegeben haben, stellen Sie die Schale auf eine kalte Platte und lassen Sie die Oberfläche eine Minute lang gelieren. Legen Sie die Lappen vorsichtig in 4%Agarose und wiederholen Sie nach fünfminütiger Inkubation und Abkühlung die Beschichtung mit 6%Agarose. Verwenden Sie nach der Beschichtung Metallbasisformen, um jeden Lappen separat in 6%ige Agarose einzubetten, wobei mindestens 3 ml Agarose das Gewebe von den Rändern aus umgeben. Richten Sie dann mit einer Pinzette jeden Lappen aus, indem Sie die größte flache Kante des Gewebes an der Oberfläche der Metallform positionieren, die dem Experimentator zugewandt ist, und schließen Sie die Einbettung mit Kunststoffkassetten ab. Lassen Sie die Blöcke mindestens 30 Minuten lang auf einer kalten Platte gelieren, bevor Sie sie mit Vibrationen durchschneiden. Alternativ können Sie die Blöcke bis zu 12 Stunden in einer befeuchteten Kammer bei vier Grad Celsius lagern, bevor Sie sie mit dem Vibratom durchschneiden. Um Schnitte vorzubereiten, richten Sie das Vibratom ein, indem Sie die Trennkammer mit kaltem PBS füllen. Richten Sie ein umliegendes Eisbad ein, um während des gesamten Schnitts eine kalte Temperatur aufrechtzuerhalten. Entfernen Sie nun die Blöcke aus den Metallformen und schneiden Sie mit einer Rasierklinge die überschüssige Agarose, die die Lappen umgibt, ab, während Sie etwa drei Millimeter vom Rand des Gewebes entfernt bleiben. Befestigen Sie das Gewebe mit Klebstoff in der Mitte der Probenplatte und tauchen Sie die Platte in die PBS-gefüllte Schnittkammer. Laden Sie die Trennklinge auf das Vibratom. Legen Sie die Schnittbegrenzungen für das Schwingwerk fest, indem Sie die folgenden Werte für Geschwindigkeit, Amplitude und Dicke auswählen. Schneiden Sie jeden Lappen vollständig ab, und wenn sich die Abschnitte nicht vollständig voneinander trennen, schneiden Sie die Abschnitte mit einer kleinen Schere manuell frei. Sammeln Sie dann vorsichtig die Gerüstabschnitte und geben Sie sie in kaltes PBS. Befreien Sie jeden Abschnitt mit einer Pinzette vorsichtig von der umgebenden Agarose. Um Gerüstabschnitte zu dekontaminieren, fügen Sie nach dem Transfer von PBS in Mikrozentrifugenröhrchen 90 Einheiten pro Milliliter Nuklease in PBS hinzu und inkubieren Sie auf einem Rotator bei Raumtemperatur für 12 bis 24 Stunden. Nach dem Transfer in neue Mikrozentrifugenröhrchen gemäß dem Textprotokoll wird unter sterilen Bedingungen eine antimikrobielle Lösung hinzugefügt und auf einem Rotator bei Raumtemperatur sechs Stunden lang inkubiert. Verwenden Sie dann unter sterilen Bedingungen PBS, um die Gerüste zweimal zu spülen und sie vor der Aussaat mit Zellen in serumfreies Medium (SFDM) zu überführen. Um eine Grenzflächenkultur für Luftflüssigkeiten einzurichten, verwenden Sie eine sterile Pinzette, um hydrophobe Membranen auf einer Petrischale zu platzieren. Übertragen Sie dann jeden dezellularisierten Gerüstabschnitt von SFDM auf eine Membran und stellen Sie sicher, dass die Abschnitte gleichmäßig auf der Membran verteilt sind. Bereiten Sie sechs oder zwölf Well-Platten vor, indem Sie die Wells mit 1 ml bzw. 0,5 ml SFDM füllen. Platzieren Sie dann die Membranen vorsichtig in den Vertiefungen, so dass die Membran auf dem Medium schwimmt und eine Luftflüssigkeitskultur entsteht. Um 3D-Gerüste nach der Präparation der endodermalen Zellen und der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung zu säen und für ein endgültiges Endoderm anzureichern, verwenden Sie ein Hämozytometer, um die sortierten Zellen zu zählen. Dann schleudern Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 400 g herunter. Mit SFDM resuspendieren Sie die pelletierten Zellen auf ca. 100.000 Zellen in 10