Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie zur Untersuchung Microglial Wechselwirkungen mit β-Amyloid-Plaques

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Beta-Amyloid-Plaques in Gehirnschnitten aus Alzheimer-Mausmodellen zu identifizieren, bevor die Immunfärbung und Gewebeverarbeitung für die Elektronenmikroskopie voreingebettet wird. Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfragen im Bereich der Neuroimmunologie zu beantworten, wie z.B. die Interaktion von Mikrogliazellen mit der Synapse in der Nähe von Amyloid-Beta-Plots. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, Hirngewebeschnitte, die Amyloid-Beta-Plots enthalten, in den interessierenden Regionen und Schichten vorzuscreenen.

Obwohl diese Methode auf die Alzheimer-Krankheit angewendet werden kann, kann sie auch auf alle anderen Krankheiten oder Gewebe angewendet werden, bei denen Amyloidose vorliegt. Bereiten Sie zunächst eine Lösung von fünf Milligramm pro Milliliter der Methoxy-X04-Verbindung vor. Wiegen Sie mit einer Mikrowaage fünf Milligramm des Methoxys X04

Unter einem Abzug das Methoxy X04 in 100 Mikrolitern DMSO auflösen und rühren, bis eine klare, grünliche Lösung entsteht. Fügen Sie nacheinander 450 Mikroliter Propylenglykol und 450 Mikroliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung unter Rühren hinzu. Lassen Sie die Lösung über Nacht bei vier Grad Celsius mischen.

Am nächsten Tag sollte eine gelblich-grüne Emulsion zu sehen sein. Nach der Injektion von Methoxy X04 fügen Sie eine Dosis von 10 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht hinzu und opfern Sie das Tier zum gewünschten Zeitpunkt gemäß den zugelassenen Methoden, waschen Sie das para-ormaldehyd-fixierte Gehirn dreimal mit gekühltem PBS. Entfernen Sie dann mit einer scharfen Rasierklinge den Riechkolben und schneiden Sie das Gehirn koronal in zwei bis drei Stücke von ungefähr gleicher Höhe, die alle gleichzeitig geschnitten werden können, um den Eingriff zu beschleunigen.

Kleben Sie die Hirngewebestücke auf die Probenplatte, die in der Schale befestigt ist. Achten Sie darauf, dass die glatte Schnittfläche fest auf der Probenplatte haftet. Geben Sie PBS-Lösung in das Tablett, bis die gesamte Gehirnoberfläche vollständig untergetaucht ist.

Platzieren Sie das Tablett in das Vibratom und passen Sie die Einstellungen des Vibratoms so an, dass Sie 50 Mikrometer dicke Schnitte erhalten. Beginnen Sie mit dem Schneiden und übertragen Sie die Schnitte bei Siebung sofort mit einem feinen Pinsel in PBS. Alternativ können die Abschnitte in Glasfläschchen mit kryogeschützter Lösung für die Lagerung bei 20 Grad Celsius eingelegt werden.

Mit Hilfe eines stereotaktischen Maushirnatlas werden Gehirnabschnitte ausgewählt, die die interessierende Region enthalten, und jeder Abschnitt in ein Kryoprotektivum in einer Vertiefung einer 24-Well-Kulturplatte gelegt. Verwenden Sie dann eine Einwegpipette, um ein Tröpfchen PBS auf einen Objektträger zu geben, und legen Sie dann den Schnitt auf den Tröpfchen. Untersuchen Sie den Schnitt unter einem Fluoreszenzmikroskop, um Bereiche zu identifizieren, die Methoxy X04-markierte a-beta-Plaques enthalten.

Ohne den Mikroskoptisch zu bewegen, können Sie Bilder der interessierenden Bereiche sowohl im Hellfeld- als auch im Fluoreszenzmodus aufnehmen. Jedes Bild muss in beiden Feldern die gleiche Region zeigen, um die Plaque mit der strukturellen Region des Gewebeschnitts zu korrelieren. Speichern und benennen Sie die aufgenommenen Bilder nach der Tiernummer.

Notieren Sie auch die Well-Nummer in der Platte und das Feld der aufgenommenen Bilder. Setzen Sie den Schnitt nach Abschluss der Bildgebung wieder in die dafür vorgesehene Vertiefung ein. Untersuchen Sie den nächsten Abschnitt in der Sequenz mit dem gleichen Verfahren, um ein Austrocknen der Abschnitte zu vermeiden.

Um die Bilder auszurichten, öffnen Sie die Hellfeld- und UV-Feldbilder für denselben ROI in ImageJ. Verwenden Sie dann das MosaicJ-Plug-in, um die Kanten der beiden Bilder auszurichten. Speichern Sie das ausgerichtete und kombinierte Bild entsprechend der Vertiefungsnummer in einem Ordner mit der Nummer des jeweiligen Tieres.

Kombinieren Sie die Bilder aus verschiedenen Abschnitten desselben Tieres, um die Plaques in der interessierenden Region zu identifizieren und zu lokalisieren. Nach Abschluss des Screening-Prozesses lagern Sie die untersuchten Schnitte bei 20 Grad Celsius in einer 24-Well-Kulturplatte, die das Kryoprotektivum enthält, bis eine Immunfärbung oder weitere Verarbeitung durchgeführt wird. Bereiten Sie zunächst 1%ige Osmiumtetroxidlösung in Phosphatpuffer in einem Glasfläschchen vor.

Da Osmiumtetroxid lichtempfindlich ist, decken Sie das Glasfläschchen mit Aluminiumfolie ab, um die Lösung vor Licht zu schützen. Entfernen Sie nach dem Waschen in Phosphatpuffer den Puffer von den Abschnitten und verteilen Sie sie mit einem feinen Pinsel flach. Achten Sie darauf, die Abschnitte unmittelbar vor der Zugabe von Osmiumtetroxid abzuflachen, da alle Falten in den Abschnitten dauerhaft werden und der Versuch, das Gewebe nach der Osmiumfixierung abzuflachen, die Abschnitte nur zerstört.

Verwenden Sie eine Transferpipette, um Osmiumtetroxid tropfenweise zu den Schnitten hinzuzufügen, bis der Schnitt eingetaucht ist. Decken Sie die Vertiefung mit Alufolie ab, um die Abschnitte vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Bereiten Sie während dieser Inkubation Kunststoffharz in einem Einwegbecherglas vor.

Kombinieren Sie die Komponenten der Reihe nach miteinander und mischen Sie sie mit einer serologischen 10-Liter-Pipette gut, bis eine einheitliche Farbe erhalten ist. Füllen Sie die vorbereitete Mischung in Aluminium-Wiegeschalen. Diese erhalten die Gewebeschnitte, sobald sie dehydriert sind.

Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Abschnitte jeweils zwei Minuten lang in zunehmender Ethanolkonzentration dehydriert. Übertragen Sie die dehydrierten Abschnitte aus der 24-Well-Kulturplatte in 20-Milliliter-Glasfläschchen. Tauchen Sie dann die Abschnitte dreimal für jeweils zwei Minuten in Propylenoxid, um Ethanolreste zu entfernen.

Übertragen Sie anschließend mit einer Pipettenspitze aus gebogenem Glas oder einem feinen Pinsel die Abschnitte aus der Propylenoxidlösung in das Kunststoffharz und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur infiltrieren. Stellen Sie nach der Infiltration die Aluminium-Wiegeschalen mit den Proben für 10 bis 15 Minuten in einen 50 bis 60 Grad Celsius heißen Ofen. Um Abschnitte auf Polychlortrifluorethylen-Folienplatten einzubetten, malen Sie zunächst mit einem feinen Pinsel eine dünne Schicht Harz auf die Sektion.

Bewegen Sie dann jeweils einen Abschnitt des Gewebes von einer Aluminiumwaage auf die PCTFE-Folienfolie. Entfernen Sie überschüssiges Harz aus dem Gewebe und achten Sie darauf, es nicht zu stören. Nachdem Sie alle Abschnitte von einer Wägeschale auf die PCTFE-Folienfolie verschoben haben, legen Sie eine zweite PCTFE-Folie über die erste, so dass ein Sandwich aus Gewebe und Harz zwischen den beiden Blättern entsteht.

Polymerisieren Sie das Harz drei Tage lang in einem Inkubator bei 55 bis 60 Grad Celsius. Anschließend ist das Gewebe bereit für den ultradünnen Schnitt und die ultrastrukturelle Untersuchung. Die folgenden Bilder zeigen die duale Bildgebung eines Hippocampus-Schnitts unter Verwendung des Hellfeld- und des Fluoreszenzmodus.

Die interessierenden Regionen und Schichten werden unter Hellfeld visualisiert. Die a-beta-Plaques werden mit einem UV-Filter in einem Bereich von 340 bis 380 Nanometern erfolgreich lokalisiert. Dieses Bild zeigt einen Hippocampus-Schnitt vor der Prä-Embedding-Immunfärbung für IBA1.

Eine sichtbare Plakette ist durch die gestrichelte Linie zu erkennen. Dieses Bild zeigt den gleichen Schnitt nach der Voreinbettung der Immunfärbung für IBA1 und der Verarbeitung für die Transmissionselektronenmikroskopie. Beachten Sie, dass die von einer gestrichelten Linie umgebene Plaque auch bei der Gewebeaufbereitung für die Elektronenmikroskopie noch sichtbar ist.

Sobald dieses Protokoll gemeistert ist, kann es in einer Woche abgeschlossen werden, wenn es ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass jeder Schritt streng durchgeführt werden muss, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination und anderer struktureller Beeinträchtigungen zu verringern, die die Qualität der Proben beeinträchtigen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Osmium äußerst gefährlich sein kann, und daher sollten Sie bei diesem Verfahren immer Vorsichtsmaßnahmen treffen, wie z. B. das Tragen eines Laborkittels und von Handschuhen.

Achten Sie darauf, dass Sie es nach der Verwendung am Ende Ihres Experiments gemäß den Richtlinien Ihrer Einrichtung entsorgen.