Exogene Verabreichung von Alpha-Synuclein Microsomen verbundenen Aggregate zur primären Neuronen als eine mächtige Zellmodell der Fibrillen Bildung

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Alpha-Synuclein zu beantworten, wie z. B. die Aufklärung des Mechanismus der Aggregationsausbreitung und der Toxizität von Alpha-Synuclein in vivo. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie keine zeitaufwändige Reinigung von Alpha-Synuclein-vorgeformten Fibrillen erfordert. Das Verfahren wird von Lucia Rota, einer Doktorandin des COLA-Labors, demonstriert.

Bereiten Sie zu Beginn des Verfahrens den Homogenisierungspuffer vor und legen Sie ihn auf Eis. Homogenisieren Sie anschließend das frische oder gefrorene Gewebe in einem eiskalten Homogenisierungspuffer von einem bis 10 Volumen mit einem Teflon-Stößel-Homogenisator mit 10 bis 15 Hüben. Übertragen Sie anschließend das gesamte Ausgangshomogenat in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 1.000 Mal G, um Kerne und ungebrochene Zellen im resultierenden Pellet zu entfernen.

Entsorgen Sie anschließend das Ergebnispellet. Als nächstes wird der Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen überführt und mit einer gekühlten Zentrifuge 20 Minuten lang bei 10.000 mal G bei vier Grad Celsius zentrifugiert, um den zweiten Überstand und das Pellet zu erhalten. Dann wird dieser Überstand in eine Polycarbonatflasche umgefüllt und eine Stunde lang bei 100.000 G bei vier Grad Celsius mit einer Ultrazentrifuge und einem Festwinkelrotor zentrifugiert.

Resuspendieren Sie das P100-Rohpellet mit 500 Mikrolitern des Homogenisierungspuffers. Übertragen Sie das P100-Rohpellet in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es 20 Minuten lang bei 10.000 mal G bei vier Grad Celsius in einer gekühlten Zentrifuge. Nach 20 Minuten wird der Überstand verworfen und P100 mit 100 Mikrolitern Homogenisierungspuffer resuspendiert.

Dann beschallen Sie die Probe zwei Sekunden lang auf Eis und lagern sie bei minus 80 Grad Celsius. Um Western Blot durchzuführen, gießen Sie ein Gradient von vier bis 20 % Tris-Glycin-Polyacrylamid-Gel auf ein vertikales Elektrophoresegerät. Lösen Sie ein Mikrogramm mikrosomenassoziierter Alpha-Synuclein-Fraktionen in dem denaturierenden Probenpuffer auf und laden Sie es auf das Gel.

Laden Sie in eine andere Vertiefung fünf Mikroliter Protein-Standard-Marker. Lassen Sie das Gel bei 100 Volt in einem Tris-Glycin-SDS-Laufpuffer laufen, bis der Proteinmarker das Ende des Gels erreicht. Dann übertragen Sie die Proteine unter Verwendung eines basischen Karbonatpuffers auf eine Nitrozellulosemembran.

Bewahren Sie die Probe über Nacht im Kühlraum mit einer konstanten Leistung von 200 Milliampere auf. Am nächsten Tag verstopfen Sie die Membran mit PBS-T mit 5 % fettfreier Trockenmilch auf einem Orbitalschüttler für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Membran anschließend kurz mit PBS-T aus.

Inkubieren Sie die Membran mit SIN-1 bei einer Dosis von 1 bis 5.000 oder einem P-Ser129-Alpha-Synuclein-Antikörper bei einer Dosis von 1 bis 5.000 in 2,5 % fettfreier Trockenmilch in PBS-T über Nacht im Kühlraum oder Kühlschrank bei vier Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler. Waschen Sie die Membran am nächsten Tag 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit PBS-T auf einem Orbitalschüttler. Inkubieren Sie die Membran mit Anti-Maus- oder Anti-Kaninchen-HRP-konjugierten Sekundärantikörpern bei einer Dosis von 1 bis 3.000 in 2,5 % fettfreier Trockenmilch in PBS-T für eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler.

Waschen Sie die Membran dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit PBS-T auf einem Orbitalschüttler dreimal. Beziehen Sie das Signal über das reguläre Chemilumineszenz-Kit. Um die Neuronen zu behandeln, ziehen Sie die Mikrosomen-assoziierten Alpha-Synuclein-Aggregate, die aus dem Rückenmark von drei verschiedenen erkrankten transgenen Mäusen gewonnen wurden, um eine Lösung von einem Mikrogramm pro Mikroliter zu erhalten, die mit dem ursprünglichen Homogenisierungspuffer verdünnt ist.

Entfernen Sie als Nächstes ein Drittel des Mediums und ersetzen Sie es vorsichtig durch frisches Neuronenmedium. Geben Sie ein Mikrogramm gepoolte Mikrosomen-assoziierte alpha-s-Aggregate in das Zellmedium. Bringen Sie die Neuronen bei 37 Grad Celsius in den Inkubator zurück.

Geben Sie eine Woche lang ein Drittel frisches Medium in die Probe, ohne das Medium alle drei Tage auszutauschen. Entfernen Sie nach einer Woche Behandlung ein Drittel des Mediums und ersetzen Sie es vorsichtig durch frisches Medium, das 2 % B27, 10 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin und zwei Millimolare Glutamin enthält. Wiederholen Sie dies eine Woche lang alle drei Tage, bevor Sie die Zellen fixieren.

Um eine Immunfluoreszenz durchzuführen, fixieren Sie die Neuronen in einem chemischen Abzug mit 2%Paraformaldehyd und PBS in 5%iger Saccharoselösung für 15 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln. Entfernen Sie nach 15 Minuten die Fixierlösung und waschen Sie die Neuronen dreimal kurz mit PBS. Als nächstes permeabilisieren Sie die Neuronen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,3 % nichtionischem Surfactin in PBS.

Waschen Sie dann die Neuronen dreimal kurz mit PBS. Inkubieren Sie die Neuronen mit 3%FBS und PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem orbitalen Shaker, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Inkubieren Sie anschließend die Neuronen mit geeigneten Primärantikörpern, die in 3 %FBS und PBS gelöst sind, über Nacht im Kühlraum oder Kühlschrank bei vier Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler.

Entfernen Sie am nächsten Tag die Antikörperlösung und waschen Sie die Zellen dreimal kurz mit PBS. Inkubieren Sie dann die Neuronen mit dem entsprechenden fluoreszierenden Sekundärantikörper, der in 3%FBS und PBS gelöst ist, eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln auf einem Orbitalschüttler. Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie sie dreimal kurz mit PBS.

Anschließend färben Sie die Neuronen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln auf einem Orbitalschüttler mit DAPI-Lösung. Entfernen Sie nach 15 Minuten die Antikörperlösung und waschen Sie sie dreimal kurz mit PBS. Befestigen Sie die Deckgläser mit einem lichtbeständigen Eindeckmedium auf der Folie.

In dieser Studie induziert die Verabreichung von einem Mikrogramm gepoolter Mikrosomen-assoziierter alpha-Synuclein-Aggregate von erkrankten A53T-transgenen Mäusen auf das Kulturmedium kortikaler oder hippokampaler Neuronen eine zeitabhängige Bildung von alpha-Synuclein-Einschlüssen, die positiv für aggregatspezifische alpha-Synuclein-Antikörper sind. Nach zweitägiger Behandlung erscheinen diese Aggregate als kleine verstreute Punkte, die zu späteren Zeitpunkten häufiger auftreten werden. Nach zwei Wochen ähneln die Alpha-Synuclein-Einschlüsse langen und reifen kügelchenartigen Strukturen, die stark über die neuronalen Kulturen verteilt sind, einem Neuritenmuster folgen und teilweise mit präsynaptischen und neuritischen Markern kolokalisieren.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Verhältnis von Mikrogramm von Mikrosom-assoziierten Alpha-Synuclein-Aggregaten zur Dichte der plattierten Neuronen anzupassen und Mikrosom-assoziierte Alpha-Synuclein-Aggregate aus Gewebe zu isolieren, das reich an Alpha-Synuclein-Einschlüssen ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Mikrosom-assoziierte Alpha-Synuclein-Aggregate von erkrankten transgenen Mäusen gereinigt werden können, um sie zur Behandlung von primären Neuronen zu verwenden, um die Bildung von Alpha-Synuclein-Einschlüssen zu induzieren.