Ein High-Throughput-Screen für Biomining Cellulase Aktivität von Metagenombanken

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Cellulase-exprimierende Klone aus einer metagenomischen Bibliothek zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine zuvor erstellte metagenomische Bibliothek mit einem Roboter repliziert wird, nachdem die replizierte Bibliothek 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert wurde. Das Wachstum der E-Coli-Klone wird gemessen, Lyse, Puffer und Substrat werden dann zur replizierten Bibliothek hinzugefügt.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Zellulaseaktivität durch farbmetrische Absorptionsmessungen mit einem Plattenleser zeigen. Hallo, ich bin Keith aus dem Labor von Steven Hallam in der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie an der University of British Columbia. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für das funktionelle Hochdurchsatz-Screening von metagenomischen Bibliotheken.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Aktivität von Biomin-Cellulase aus metagenomischen Bibliotheken zu untersuchen. Also lasst uns loslegen. Bevor Sie mit diesem Protokoll beginnen, bereiten Sie eine metagenomische Bibliothek vor, die in einem 384-Well-Plattenformat gespeichert ist.

In dieser Studie wurde der PCC-Ein-Kopie-Kontroll-SMID-Vektor in Kombination mit Farge T one resistenten TRANSFECT max EPI 300 T one resistenten E-Coli-Zellen als Bibliothekshost verwendet, um dieses Verfahren zu starten, die Platten mit der Bibliothek von minus 80 Grad Celsius zu entfernen und bei 37 Grad Celsius für etwa 20 Minuten aufzutauen. Verwenden Sie in der Zwischenzeit die UV-Licht-Sterilisationsfunktion des QIX two, um den Roboter 15 Minuten lang zu sterilisieren. Richten Sie den Q fill three gemäß den Anweisungen des Herstellers ein, wobei die Medienflasche über das sterile Schlauchprogramm am Verteiler befestigt ist.

Der Q füllt drei für die entsprechende Medienmenge und stellt ihn so ein, dass er ein Volumen von 45 Mikrolitern füllt. Spülen Sie in jedem Fall die Luft mit der Spülfunktion des Roboters gut aus den Schläuchen und dem Verteiler, bis das Medium sichtbar ist. Füllen Sie an jedem Stift des Verteilers die gewünschte Anzahl von Platten mit LB-Medien mit der Q-Füllung drei.

Das Befüllen jeder Platte dauert ca. 20 Sekunden. Legen Sie als Nächstes die Bibliotheksplatten und die frischen Platten in die entsprechenden Bereiche der Q-Picks ein. Um die Reinigungsbäder mit den entsprechenden Reagenzien zu befüllen.

2 % Micro 90 im hinteren Bad, destilliertes Wasser im Autoklaven im mittleren Bad und 80 % Ethanol im vorderen Bad. Wählen Sie mit dem Replikationsprogramm des qix two den passenden Kopf sowie die Anzahl und Typen der Quell- und Zielplatten aus. Richten Sie den Kopf auch so ein, dass er zwischen den Replikationen bereinigt wird.

In der Regel reichen sechs Zyklen in jedem Bad aus. Die Kapazität der Maschine beträgt 10 Platten gleichzeitig. Stellen Sie die Maschine auf Betrieb ein.

Es dauert ungefähr 15 Minuten, um es zu replizieren. Volle Kapazität mit einem 384-poligen Kopf. Sobald die Platten repliziert sind, züchten Sie die Platten 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer Feuchtigkeitsbox.

Die lange Inkubationszeit ist notwendig, da mit der Zugabe von Arabinose eine hohe Kopienzahl von Smid induziert wird. Reinigen Sie in der Zwischenzeit den Q fill three-Roboter, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Nehmen Sie nach der Inkubation die Platten aus dem 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Legen Sie die Deckel beiseite und legen Sie die Platten auf die mit dem Schnellstapel vorgesehene Magazinladeplattform. Achten Sie darauf, die Reihenfolge der Platten im Auge zu behalten, da die Software dies nicht tut. Die Platten am unteren Rand des Stapels werden gelesen.

Entfernen Sie zunächst ein Magazin aus dem Schnellstapel. Stellen Sie sicher, dass es leer ist, und schieben Sie es auf den Stapel von Platten, die abgelesen werden sollen. Fassen Sie das Magazin am Griff und die Platte sollte in das Magazin geladen werden.

Laden Sie das Magazin in der richtigen Ausrichtung in den Schnellstapel. Öffnen Sie das Programm zum erneuten Scannen auf dem angeschlossenen Computer. Wählen Sie Neue Sitzung aus, und benennen Sie sie entsprechend.

Wählen Sie als Platte die Bezeichnung 384-Well-Platte mit flachem Boden. Geben Sie in den Plattenlayoutbereich ein. Wählen Sie die Schaltfläche Assistent aus, und wählen Sie sie aus, um der Platte 384 Unbekannte hinzuzufügen.

Wählen Sie im Protokollbereich die Option Well-Schleife und geben Sie für 384 Wells ein. Ein Well-Schleifensymbol wird in der Flow-Struktur auf der linken Seite des Bildschirms angezeigt. Wählen Sie das Symbol aus und klicken Sie, um eine photometrische Messung hinzuzufügen.

Stellen Sie es auf einen Messwert von 600 Nanometern ein. Speichern Sie das Protokoll mit einem eindeutigen Namen und schließen Sie das Scan-Programm. Öffnen Sie dann das Polara RS Programm.

Auf der Hauptseite befindet sich eine Tabelle, in der die an das Rapid-Stack-Gerät angeschlossenen Geräte unter der Überschrift VARI-Scan aufgelistet sind, klicken Sie auf die Option Sitzung ausführen. Das Assay-Fenster sollte dann mit einem Flussdiagramm in der Mitte erscheinen. Wählen Sie das Element "Sitzung ausführen" aus und suchen Sie dann den Namen des gespeicherten Scans.

Es wird im Dropdown-Menü erneut ausgeführt, das auf der rechten Seite des Bildschirms angezeigt wird. Nachdem Sie das Protokoll ausgewählt haben, klicken Sie auf Ausführen. Bei diesem Assay wird ein Feld angezeigt, in dem Sie gefragt werden, welches Magazin als Quelle verwendet werden soll und welches Magazin leer ist.

Das untere Feld auf dem Bildschirm entspricht dem vorderen Magazin-Zine. Stellen Sie sicher, dass sowohl der Rapid Stack als auch der Vario-Scan eingeschaltet sind, und klicken Sie auf Start. Der Rapid Stack lädt die Platten automatisch in den Plattenleser und ermöglicht so eine kontinuierliche Messung der Platten.

Beobachten Sie, wie die erste Platte in den Vario-Scan eingelegt wird, um sicherzustellen, dass die Maschinen richtig abgelesen werden. 25 Platten dauern ca. 50 Minuten. Sobald der Barrios-Scan abgeschlossen ist, entfernen Sie das volle Magazin und legen Sie es auf die Magazinladeplattform.

Hebe das äußere Rechteck der Plattform an und das Magazin sollte abgleiten, so dass die Platten in der Mitte in einem Stapel stehen. Setzen Sie abschließend die Deckel auf den Platten wieder auf, um ein lösungsbasiertes Sieb zu erhalten. Für die Zelluloseaktivität bereiten Sie zuerst die Assay-Mischung mit einer vorgefertigten 10-fachen Lysebrühe vor.

Mischen Sie 50 millimolaren Kaliumacetatpuffer bei einem pH-Wert von 5,5 ein, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Bereiten Sie dann einen Vorrat von bis zu 75 Milligramm pro Milliliter, chromogenes DIPHENYL- oder DNP-Zellbiozidsubstrat in DMSO vor und stellen Sie sicher, dass das Substrat vollständig aufgelöst ist. Geben Sie DNP-Zellbiozid-Stammlösung in den Assay-Mix bis zu einer Endkonzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter.

Denken Sie daran, dass jede Platte etwa 20 Milliliter Lösung verbraucht und zusätzliche 50 Milliliter erforderlich sind, um das Totvolumen zu berücksichtigen. Richten Sie die Q-Füllung drei wie zuvor bei der Assay-Mischung auf jeder Platte ein, indem Sie die Q-Füllung drei verwenden. Das Befüllen jeder Platte dauert ca. 20 Sekunden.

Sobald die Assay-Mischung hinzugefügt wurde, inkubieren Sie die Platten 12 bis 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. In einer Feuchtigkeitsbox nehmen Sie die Platten aus dem 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Legen Sie die Deckel beiseite und legen Sie die Platten wie bisher auf die mit dem Schnellstapel versehene Magazinladeplattform.

Öffnen Sie das Scan-Re-Programm und richten Sie es wie zuvor ein, mit Ausnahme der photometrischen Messung, die auf 400 Nanometer eingestellt sein sollte. Geben Sie dann die Parameter in das POLARA RS Programm ein. Wie bereits gezeigt wurde.

Lassen Sie den Vario-Scan die Platten lesen. Entfernen Sie nach dem Lauf die Platten und entsorgen Sie sie. Um die Absorptionswerte offen zu exportieren, scannen Sie die Software und wählen Sie aus.

Öffnen Sie eine vorhandene Datei. Wählen Sie das Verzeichnis aus, in dem die Sitzung gespeichert wurde, und klicken Sie auf das Plus-Symbol, um die Liste zu erweitern. Unter der Titelüberschrift befinden sich Optionen mit der Bezeichnung Behälter eins bis Behälter N.Wählen Sie je nach Anzahl der Platten in der Menüleiste oben auf der Seite die erste zu analysierende Platte aus und wählen Sie Datenberichtsexport.

Wählen Sie Optionen für den Export aus, z. B. Plattenlayout und fotometrische Daten. Klicken Sie auf Bericht anzeigen und dann auf Datei speichern. Wählen Sie das gewünschte Verzeichnis aus.

Das Ausgabeformat ist eine Microsoft Excel-Tabelle. Hier werden Absorptionswerte von einem einzelnen 384 gemessen. Eine Well-Platte, die einen positiven Klon enthält, wie gezeigt, zeigen positive Klone einen deutlichen Anstieg der Absorption im Vergleich zu Klonen, die keine Celluladeaktivität exprimieren.

Unterschiede in der Untersuchungszeit, der Bohrung, der Position auf der Platte oder der DNP-Konzentration können die absoluten Absorptionswerte beeinflussen. Relative Absorptionswerte, wie z. B. die Differenz der Absorption über dem Plattendurchschnitt oder dem Säulendurchschnitt, sind eine robustere Methode zur Identifizierung von Cellulase-positiven Klonen. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Cellulase-positive Klone aus einer metagenomischen Bibliothek identifizieren können.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Ihre DNP-Zellbioseite in DMSO aufzulösen und Ihre Platten in einer Feuchtigkeitskammer zu inkubieren. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.