Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren
30. Oktober 2016
Vaccinia-Virus (VV) ist in der biomedizinischen Forschung und der Verbesserung der Gesundheit des Menschen weit verbreitet. Dieser Artikel beschreibt eine einfache, hocheffiziente Methode, um die VV-Genom mit Hilfe eines CRISPR-Cas9 System zu bearbeiten.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Effizienz der Erzeugung von mutierten Vaccinia-Viren mithilfe der CRISPR-Cas9-Technologie zu verbessern. Diese Methode kann helfen, neue Vaccinia-Virusvektoren für die biologische und medizinische Forschung zu erzeugen, insbesondere für die Gentherapie und Impfung. Der virale Nachweis mit dieser Methode ist entscheidend, da das Identifizieren und Isolieren positiver Plaques schwierig durchzuführen ist.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Effizienz bei der Herstellung unseres mutierten Vaccinia-Virus erheblich verbessert. Beginnen Sie mit geernteten CV-1-Zellen und stellen Sie deren Konzentration auf 100.000 Zellen pro Milliliter ein. Anschließend geben Sie zwei Milliliter der Suspension in jede Vertiefung einer 6-Loch-Platte zur Transfektion.
Transfizieren Sie die Zellen am folgenden Tag mit 0,5 Nanogramm gRNA-N2-Plasmid und 0,5 Nanogramm pSTCas9-Plasmid. Inkubieren Sie sie anschließend 24 Stunden lang. 24 Stunden später wechseln Sie das Medium.
Bereiten Sie als Nächstes das VVL15-Virus vor. Verdünnen Sie das VVL15-Virus-Backbone mit DMEM auf 200.000 PFU pro Milliliter. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter des verdünnten Virus in jede Vertiefung der transfizierten CV-1-Zellen.
Zwei Stunden später die Zellen mit einem Mikrogramm des Shuttle-Donor-Vektors zur Expression von HR transfectieren und die Zellen 24 Stunden inkubieren. Am folgenden Tag die transfizierten CV-1-Zellen mit einem Zellabstreifer lösen. Anschließend die Zellsuspension in ein Kryoröhrchen sammeln und bei minus 80 Grad Celsius für die spätere Verwendung lagern.
Um die erste Runde der Reinigung des modifizierten VV zu beginnen, säen Sie 15 Sechswell-Platten mit jeweils 300.000 nicht modifizierten CV-1-Zellen pro Mulde aus. Am nächsten Tag tauen Sie die gefrorene Suspension transfizierter CV-1-Zellen bei 37 Grad Celsius drei Minuten lang auf und vortexen die Suspension anschließend kräftig 30 Sekunden lang, um die Zellen zu lysieren. Verdünnen Sie dann ein Mikroliter des Lysats mit drei Millilitern DMEM.
Geben Sie einen halben Milliliter dieser Verdünnung in jedes Plattenwell mit unveränderten CV-1-Zellen. Anschließend kehren Sie die Platten für zwei Tage in den Inkubator zurück. Zwei Tage später identifizieren Sie RFP-positive Plaques mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops.
Sie können mit einem 10X-Objektiv erkannt werden. Sobald sie identifiziert sind, beschriften Sie die Plaques unterhalb der Platte mithilfe eines Markierstifts genau. Bereiten Sie nun ein Kryoröhrchen vor, das für jede positive Plaque, die gewonnen werden soll, 200 Mikroliter serumfreies DMEM enthält.
Danach ist es wichtig, das gesamte Medium aus den Vertiefungen mit markierten Plaques abzusaugen. Anschließend mit einer 200-Mikroliter-Pipette, die auf 30 Mikroliter zum Absaugen eingestellt ist, die Pipette teilweise mit 10 Mikrolitern Medium aus dem Kryoröhrchen beladen und dann den Plaque abkratzen und die Zellen mit dem verbleibenden Absaugvorgang aufnehmen. Dieses Gemisch in das Kryoröhrchen ausstoßen und diesen Vorgang noch zweimal wiederholen, wobei gezielt derselbe RFP-positive Plaque angesprochen wird, um möglichst viele Zellen zu gewinnen.
Lagern Sie die Sammlungen bei minus 80 Grad Celsius. Falls die zweite Reinigungsrunde unmittelbar durchgeführt werden soll, gefrieren Sie die Kryoröhrchen 10 Minuten lang auf Trockeneis ein. Die zweite Reinigungsrunde des modifizierten VV erfolgt analog zur ersten, wobei die aus der ersten Runde stammenden gefrorenen Zellen verwendet werden. Allerdings können für jede RFP-positive Linie mehr als sechs RFP-positive Plaques ausgewählt werden.
Wiederholen Sie den Selektionsprozess, bis alle aus einem positiven Plaque hervorgegangenen Plaques RFP-positiv sind, was darauf hinweist, dass der Plaque rein ist; dies kann zusätzliche drei bis fünf Runden erfordern. Einen Tag im Voraus bereiten Sie eine sechswellige Platte mit einer halben Million CV-1-Zellen pro Vertiefung vor. Am folgenden Tag tauen Sie den gefrorenen, gereinigten Plaque für drei Minuten bei 37 Grad Celsius auf.
Anschließend das Plaque kräftig 30 Sekunden lang verwirbeln, um ein Lysat herzustellen. Das gesamte Lysat einschließlich des Zelldebrises in eine Vertiefung mit CV-1-Zellen geben und die Platte drei Tage lang inkubieren. Die anderen fünf Vertiefungen nicht verwenden.
Überprüfen Sie die Zellen täglich unter dem Mikroskop. Wenn mehr als die Hälfte der Zellen zytopathisch erscheint, gewinnen Sie die infizierten Zellen. Im Idealfall sollten alle Zellen zytopathisch sein.
Verwenden Sie einen Zellabstreifer, um die Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen mit Kulturmedium zu sammeln. Anschließend pelletieren Sie die Zellen bei 300 × g für drei Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und fahren Sie entweder direkt mit der PCR fort, um die Modifikation des mutierten VV zu verifizieren, oder frieren Sie das Zellpellet bei minus 80 Grad Celsius ein, um dies zu einem späteren Zeitpunkt durchzuführen.
Die beschriebene Methode verbessert die Rekombinations-Effizienz um mehr als das 100-Fache im Vergleich zu herkömmlichen Protokollen. Zum Beispiel wurde das VV N1LG für eine Modifikation gezielt angegriffen. Wie beschrieben, wurden Plasmide, die Cas9 und eine N1L-spezifische gRNA exprimieren, gemeinsam in die CV-1-Zellen transfiziert, um deren Effizienz für die homologe Rekombination zu erhöhen.
Ein Tag nach der Transfektion wurde RFP in den CV-1-Zellen exprimiert. Anschließend wurden die CV-1-Zellen mit dem gesamten Lysat aus der homologen Rekombination infiziert. Sowohl RFP-positive als auch negative Plaques wurden in den CV-1-Zellen beobachtet.
Nach dem Reinigungsprotokoll wurde ein reines rekombinantes Protein erhalten. Alle Plaques nach Infektion mit dem Zelllysat, das von einem reinen Plaque mit dem mutierten Vaccinia-Virus stammte, zeigten ein RFP-Signal. Mittels PCR wurde die Deletion des gezielten Gens verifiziert.
Das modifizierte Virus zeigte ein positives Signal für RFP und kein Signal für N1L, im Gegensatz zum intakten N1L-Kontrollvirus. Alle waren positiv für das nicht gezielte Gen A52R. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man schnell einen neuen Vakzinia-Virusvektor herstellt.
Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 10 Tagen durchgeführt werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der biomedizinischen Wissenschaften den Weg, um neue virale Vektoren bei der Entwicklung biologischer Wirkstoffe zur Behandlung und Vorbeugung von Krebs- und Infektionskrankheiten zu erforschen.
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine äußerst effiziente Methode zur Bearbeitung des Vaccinia-Virus-(VV-)Genoms mithilfe der CRISPR-Cas9-Technologie vor. Die Technik verbessert signifikant die Erzeugung mutierter VV und ermöglicht Fortschritte in der biologischen und medizinischen Forschung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Virologie
- Gentechnik
- Biomedizinische Forschung
Hintergrund
- Vaccinia-Virus ist ein wertvolles Werkzeug in der biomedizinischen Forschung.
- Die CRISPR-Cas9-Technologie ermöglicht eine präzise Genomeditierung.
- Die effiziente Erzeugung viraler Mutanten ist entscheidend für Forschungsanwendungen.
- Herkömmliche Methoden zur Erzeugung von Mutanten können ineffizient sein.
Zweck der Studie
- Verbesserung der Effizienz bei der Erzeugung mutierter Vaccinia-Viren.
- Entwicklung neuer viraler Vektoren für die Gentherapie und Impfung.
- Vereinfachung der Identifizierung positiver Plaques in viralen Assays.
Verwendete Methoden
- Transfektion von CV-1-Zellen mit gRNA- und Cas9-Plasmiden.
- Infektion der transfizierten Zellen mit dem VVL15-Virus.
- Identifizierung von RFP-positiven Plaques mittels Fluoreszenzmikroskopie.
- Reinigung des modifizierten VV durch mehrfache Selektionsschritte.
Hauptergebnisse
- Die Methode verbessert die Rekombinationseffizienz um mehr als das 100-Fache.
- Die erfolgreiche Erzeugung von RFP-positiven Plaques weist auf eine wirksame Modifikation hin.
- Die PCR bestätigte die Deletion der gezielten Gene im modifizierten Virus.
- Die Technik kann in etwa 10 Tagen abgeschlossen werden.
Schlussfolgerungen
- Diese CRISPR-Cas9-Methode stellt einen bedeutenden Fortschritt für die VV-Forschung dar.
- Sie ermöglicht die schnelle Entwicklung neuer viraler Vektoren für therapeutische Anwendungen.
- Der Ansatz kann weitere Studien zur Behandlung von Krebs und Infektionskrankheiten erleichtern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieser CRISPR-Cas9-Ansatz behebt einen zentralen Engpass bei der Entwicklung viraler Vektoren, indem er die Effizienz bei der Erzeugung mutierter Vaccinia-Virusstämme erheblich verbessert. Eine verbesserte Rekombinationsrate ermöglicht schnellere Iterationen bei der präklinischen Zielvalidierung und der Optimierung von Vektoren. Die Methode ermöglicht die schnelle Erzeugung rekombinanter Viren für die Gentherapie und Impfstoffforschung und verkürzt damit die Zeitspannen in den frühen Entdeckungsphasen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die gezielte Untersuchung der Funktion viraler Gene durch gezielte Knockouts, wie beispielsweise die Deletion von N1L, um pathogene Mechanismen aufzuklären.
- Operativer Wert: Verbessert die Effizienz der Generierung rekombinanter Viren um mehr als das 100-Fache im Vergleich zur herkömmlichen homologen Rekombination und beschleunigt damit die Entwicklung von Stämmen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem saubere genetische Modifikationen ermöglicht werden, die eine eindeutige Zuordnung von Phänotypen in nachgeschalteten Assays erlauben.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt mit RFP markierte Reporterviren, die quantitative, fluoreszenzbasierte Plaque-Assays für die Hochdurchsatz-Screening von antiviralen Wirkstoffen oder Immunantworten ermöglichen.
- Operativer Wert: Erzeugt stabile, reine Viruspräparationen nach mehreren Reinigungsschritten, wodurch die Reproduzierbarkeit des Assays sichergestellt und die Variabilität der Messergebnisse verringert wird.
- Skalierbarkeit: Das Protokoll verwendet Standard-Ausrüstung für Zellkultur und Transfektion und kann daher problemlos an verschiedene Laborgrößen angepasst werden, ohne dass spezielle Instrumente erforderlich sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Bietet eine Plattform zur Konstruktion von Vaccinia-Virus-Vektoren, die therapeutische Antigene oder Immunmodulatoren exprimieren, zur präklinischen Evaluation in Modellen von Krebs und Infektionskrankheiten.
- Relevanz für präklinische Modelle: Ermöglicht die schnelle Erzeugung isogener Virusstämme (z. B. Wildtyp im Vergleich zu N1L-deletiert), um Virulenzmechanismen aufzuklären und die Sicherheitscharakterisierung zu unterstützen.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: PCR-verifizierte Genlöschungen und RFP-Expression erlauben fundierte Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf genetischer Treue, bevor In-vivo-Studien durchgeführt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Bereich von der frühen Entdeckung bis zur Identifizierung von Leitstrukturen ein, in dem eine schnelle Konstruktion viraler Vektoren die Überprüfung von Target-Hypothesen und die mechanistische Validierung unterstützt.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die hypothesengeleitete Bearbeitung viraler Genome, um die Genfunktion bei der Immunflucht oder in Replikationswegen zu untersuchen.
- Screening: Erzeugt standardisierte, RFP-exprimierende Virusstämme, die für fluoreszenzbasierte Screening-Assays zur Prüfung antiviraler Wirkstoffe oder Impfstoffwirksamkeit geeignet sind.
- Analytik: Ermöglicht PCR- und fluoreszenzbasierte Nachweismethoden, um die Modifikationseffizienz und klonale Reinheit quantitativ während der Vektorentwicklung zu bewerten.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Kontinuität von der Vektorerstellung bis zur präklinischen Testung, indem genetisch definierte Viren mit nachgewiesener Transgenintegration und Genlöschung bereitgestellt werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die Genommodifikation von Vaccinia-Viren, die in Programmen für virale Vektoren für verschiedene Zielstrukturen und Transgen-Lasten eingesetzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Hochpräzise Genom-Editierung mit messbar verbesserter Rekombinationseffizienz, wodurch falsch-negative Ergebnisse bei der Mutanten-Screening reduziert werden.
- Operationaler Wert: Ein optimierter Workflow unter Verwendung leicht zugänglicher Reagenzien (Plasmide, CV-1-Zellen, Fluoreszenzmikroskopie) minimiert technische Hürden bei der Einführung.
- Strategischer Wert: Beschleunigt die Design-Bau-Test-Zyklen für virale Vektoren und verbessert so die Kapitalnutzungseffizienz in frühen Entwicklungsprogrammen für Biopharmazeutika.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die schnelle Erstellung von Prototypen viraler Vektoren und unterstützt dadurch die parallele Untersuchung mehrerer Kandidaten sowie eine fundierte Priorisierung basierend auf genetischer Validierung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert molekularbiologische Fachkenntnisse in Plasmidtransfektion und viralem Umgang unter BSL-2-Bedingungen.
- Benötigt Fluoreszenzmikroskopie zur Plaque-Screening und Standard-PCR-Ausrüstung zur genotypischen Verifikation.
- Erfordert die Optimierung der gRNA- und Donorvektorkonstruktion für jeden Ziellocus, um die Editier-Spezifität aufrechtzuerhalten.
- Anwendbar auf adhärente Säugerzelllinien wie CV-1; die Anpassung an andere Systeme könnte empirische Tests erfordern.
- Mehrere Runden der Plaque-Reinigung sind notwendig, um klonale Reinheit zu erreichen, was die manuelle Arbeitszeit beeinflusst, trotz eines Gesamtzeitraums von 10 Tagen.
