Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren
30. Oktober 2016
Vaccinia-Virus (VV) ist in der biomedizinischen Forschung und der Verbesserung der Gesundheit des Menschen weit verbreitet. Dieser Artikel beschreibt eine einfache, hocheffiziente Methode, um die VV-Genom mit Hilfe eines CRISPR-Cas9 System zu bearbeiten.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Effizienz der Erzeugung von mutierten Vaccinia-Viren durch den Einsatz der CRISPR-Cas9-Technologie zu verbessern. Diese Methode kann helfen, neue Vaccinia-Virusvektoren für die biologische und medizinische Forschung, insbesondere für die Gentherapie und Impfung, zu schaffen. Der Virusnachweis mit dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig ist, positive Plaques zu identifizieren und aufzuspüren.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Effizienz bei der Herstellung unserer Mutante zum Vaccinia-Virus drastisch verbessert. Beginnen Sie mit geernteten CV-1-Zellen, passen Sie ihre Konzentration auf 100.000 Zellen pro Milliliter an. Säen Sie dann zwei Milliliter der Suspension zur Transfektion in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte.
Am nächsten Tag transfizieren Sie die Zellen mit 0,5 Nanogramm gRNA-N2-Plasmid und 0,5 Nanogramm pSTCas9-Plasmid. Dann inkubieren Sie sie 24 Stunden lang. Tauschen Sie das Medium 24 Stunden später aus.
Bereiten Sie als Nächstes den VVL15-Virus vor. Verdünnen Sie das VVL15-Virus mit DMEM auf 200.000 PFU pro Milliliter. Geben Sie dann 100 Mikroliter des verdünnten Virus in jede Vertiefung der transfizierten CV-1-Zellen.
Zwei Stunden später transfizieren Sie die Zellen mit einem Mikrogramm des Shuttle-Donor-Vektors für die Expression der HR und inkubieren die Zellen 24 Stunden lang. Am nächsten Tag lösen Sie die transfizierten CV-1-Zellen mit einem Zellschaber ab. Sammeln Sie dann die Zellsuspension in einem Kryogefäß und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung.
Um die erste Runde der Aufreinigung des modifizierten VV zu beginnen, besäen Sie 15 Sechs-Well-Platten mit 300.000 unmodifizierten CV-1-Zellen pro Well. Tauen Sie am nächsten Tag die gefrorene Suspension der transfizierten CV-1-Zellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf und wirbeln Sie die Suspension dann 30 Sekunden lang kräftig ein, um die Zellen zu lysieren. Verdünnen Sie dann einen Mikroliter des Lysats mit drei Millilitern DMEM.
Geben Sie einen halben Milliliter dieser Verdünnung in jede Plattenvertiefung mit unmodifizierten CV-1-Zellen. Legen Sie die Platten dann für zwei Tage wieder in den Inkubator. Zwei Tage später identifizieren Sie RFP-positive Plaques mit einem Fluoreszenzmikroskop.
Sie können mit einem 10-fachen Objektiv erkannt werden. Wenn sie identifiziert sind, beschriften Sie die Plaques unter der Platte mit einem Markierungsstift genau. Bereiten Sie nun für jede zu erntende positive Plaque ein Kryofläschchen mit 200 Mikrolitern serumfreiem DMEM vor.
Als nächstes ist es wichtig, das gesamte Medium aus den Vertiefungen mit markierten Plaques abzusaugen. Verwenden Sie dann ein 200-Mikroliter-Pipettenset, um 30 Mikroliter zu aspirieren, laden Sie die Pipette teilweise mit 10 Mikrolitern Medium aus dem Kryofläschchen, kratzen Sie dann die Plaque ab und ziehen Sie die Zellen mit der restlichen Aspiration auf. Werfen Sie diese in das Kryofläschchen aus und wiederholen Sie diesen Vorgang noch zweimal, wobei Sie auf dieselbe RFP-positive Plaque abzielen, um so viele Zellen wie möglich zu sammeln.
Lagern Sie die Entnahmen bei minus 80 Grad Celsius oder, wenn die zweite Reinigungsrunde sofort durchgeführt werden soll, frieren Sie die Kryofläschchen 10 Minuten lang auf Trockeneis ein. Die zweite Runde der Aufreinigung des modifizierten VV wird genau wie die erste mit den gefrorenen Zellen aus der ersten Runde durchgeführt. Für jede RFP-positive Linie können jedoch mehr als sechs RFP-positive Plaques ausgewählt werden.
Wiederholen Sie den Auswahlvorgang, bis alle Plaques, die aus einer positiven Plaque gebildet wurden, RFP-positiv sind, was darauf hinweist, dass die Plaque rein ist, was weitere drei bis fünf Runden dauern kann. Bereiten Sie einen Tag im Voraus eine sechswandige Platte mit einer halben Million CV-1-Zellen pro Vertiefung vor. Tauen Sie am nächsten Tag die gefrorene gereinigte Plaque drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf.
Wirbeln Sie dann die Plaque 30 Sekunden lang kräftig ein, um ein Lysat herzustellen. Geben Sie das gesamte Lysat, einschließlich der Zelltrümmer, in eine Vertiefung mit CV-1-Zellen und inkubieren Sie die Platte drei Tage lang. Verwenden Sie nicht die anderen fünf Vertiefungen.
Untersuchen Sie die Zellen täglich unter dem Mikroskop. Wenn mehr als die Hälfte der Zellen zytopathisch erscheinen, ernten Sie die infizierten Zellen. Idealerweise sollten alle Zellen zytopathisch sein.
Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen mit Kulturmedium zu sammeln. Pelletieren Sie dann die Zellen bei 300 g für drei Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und fahren Sie mit der PCR fort, um die Modifikation der mutierten VV zu überprüfen, oder frieren Sie das Zellpellet bei minus 80 Grad Celsius ein, um dies später zu tun.
Die beschriebene Methode verbessert die Rekombinationseffizienz um mehr als das 100-fache im Vergleich zu herkömmlichen Protokollen. Zum Beispiel wurde der VV N1LG für die Modifikation ins Visier genommen. Wie beschrieben, wurden Plasmen, die Cas9 exprimieren, und eine N1L-spezifische gRNA in die CV-1-Zellen co-transfiziert, um deren Effizienz bei der homologen Rekombination zu erhöhen.
Einen Tag nach der Transfektion wurde RFP in den CV-1-Zellen exprimiert. Als nächstes wurden CV-1-Zellen mit dem gesamten Lysat aus der homologen Rekombination infiziert. In den CV-1-Zellen wurden sowohl RFP-positive als auch negative Plaques beobachtet.
Nach dem Aufreinigungsprotokoll wurde eine reine Rekombinante erhalten. Alle Plaques nach einer Infektion mit dem Zelllysat, das von einer reinen Plaque mit dem mutierten Vaccinia-Virus abgeleitet war, stellten ein RFP-Signal dar. Die PCR wurde verwendet, um die Deletion des Zielgens zu verifizieren.
Das modifizierte Virus zeigte im Gegensatz zur intakten N1L-Kontrolle ein positives Signal für RFP und kein Signal für N1L. Alle waren positiv für das nicht-zielgerichtete Gen A52R. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie schnell einen neuen Vaccinia-Virusvektor herstellen können.
Einmal gemeistert, kann diese Technik in 10 Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der biomedizinischen Wissenschaften, um neue virale Vektoren bei der Entwicklung biologischer Wirkstoffe zur Behandlung und Vorbeugung von Krebs und Infektionskrankheiten zu erforschen.
Überblick
Dieser Artikel präsentiert eine hocheffiziente Methode zur Bearbeitung des Vaccinia-Virus (VV)-Genoms unter Verwendung der CRISPR-Cas9-Technologie. Die Technik verbessert die Erzeugung von mutantem VV erheblich und erleichtert Fortschritte in der biologischen und medizinischen Forschung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Virologie
- Genetisches Engineering
- Biomedizinische Forschung
Hintergrund
- Vaccinia-Virus ist ein wertvolles Werkzeug in der biomedizinischen Forschung.
- CRISPR-Cas9-Technologie ermöglicht präzise Genombearbeitung.
- Effiziente Erzeugung viraler Mutanten ist entscheidend für Forschungsanwendungen.
- Traditionelle Methoden zur Erzeugung von Mutanten können ineffizient sein.
Ziel der Studie
- Verbesserung der Effizienz bei der Erzeugung von mutantem Vaccinia-Virus.
- Entwicklung neuer viraler Vektoren für Gentherapie und Impfungen.
- Vereinfachung der Identifizierung von positiven Plaques in viralen Tests.
Verwendete Methoden
- Transfektion von CV-1-Zellen mit gRNA und Cas9 Plasmiden.
- Infektion transfizierter Zellen mit VVL15-Virus.
- Identifizierung von RFP-positiven Plaques mittels Fluoreszenzmikroskopie.
- Reinigung des modifizierten VV durch mehrere Selektionsrunden.
Hauptergebnisse
- Die Methode verbessert die Rekombinationseffizienz um über das 100-fache.
- Erfolgreiche Erzeugung von RFP-positiven Plaques zeigt eine effektive Modifikation an.
- PCR bestätigte die Deletion der Zielgene im modifizierten Virus.
- Die Technik kann in etwa 10 Tagen abgeschlossen werden.
Schlussfolgerungen
- Diese CRISPR-Cas9-Methode ist ein bedeutender Fortschritt für die VV-Forschung.
- Sie ermöglicht eine schnelle Entwicklung neuer viraler Vektoren für therapeutische Anwendungen.
- Der Ansatz kann weitere Studien in der Krebs- und Infektionskrankheitsbehandlung erleichtern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This CRISPR-Cas9 approach addresses a key bottleneck in viral vector development by significantly improving the efficiency of generating mutant vaccinia virus strains. Enhanced recombination efficiency enables faster iteration in preclinical target validation and vector optimization workflows. The method supports rapid generation of recombinant viruses for gene therapy and vaccine research, reducing timelines in early discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise interrogation of viral gene function through targeted knockout, such as N1L deletion, to clarify pathogenic mechanisms.
- Operational Value: Improves recombinant virus generation efficiency by over 100-fold compared to traditional homologous recombination, accelerating strain engineering timelines.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by facilitating clean genetic modifications that allow unambiguous phenotype attribution in downstream assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates RFP-tagged reporter viruses that enable quantitative, fluorescence-based plaque assays for high-throughput screening of antiviral compounds or immune responses.
- Operational Value: Produces stable, pure viral stocks after multiple rounds of purification, ensuring assay reproducibility and reducing variability in readouts.
- Scalability: The protocol uses standard cell culture and transfection equipment, enabling adaptation across laboratory scales without specialized instrumentation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a platform for constructing vaccinia virus vectors expressing therapeutic antigens or immunomodulators for preclinical evaluation in cancer and infectious disease models.
- Preclinical Model Relevance: Enables rapid generation of isogenic viral strains (e.g., wild-type vs. N1L-deleted) to dissect virulence mechanisms and support safety profiling.
- Risk-Adjusted Advancement: PCR-verified gene deletions and RFP expression allow confident go/no-go decisions based on genetic fidelity before in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery to lead identification continuum, where rapid viral vector engineering supports target hypothesis testing and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven editing of viral genomes to probe gene function in immune evasion or replication pathways.
- Screening: Generates standardized RFP-expressing viral stocks suitable for fluorescence-based screening assays in antiviral or vaccine efficacy screening.
- Analytics: Enables PCR and fluorescence-based readouts to quantitatively assess modification efficiency and clonal purity during vector development.
- Translational Research: Supports continuity from vector construction to preclinical testing by delivering genetically defined viruses with confirmed transgene integration and gene deletion.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for vaccinia virus engineering that can be applied across multiple targets and transgene payloads in viral vector programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High-fidelity genome editing with measurable improvement in recombination efficiency, reducing false negatives in mutant screening.
- Operational Value: Streamlined workflow using accessible reagents (plasmids, CV-1 cells, fluorescence microscopy) minimizes technical barriers to adoption.
- Strategic Value: Accelerates viral vector design-build-test cycles, improving capital efficiency in early-stage biologics programs.
- Portfolio Impact: Enables rapid prototyping of viral vectors, supporting parallel exploration of multiple candidates and informed prioritization based on genetic validation.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise in plasmid transfection and viral handling under BSL-2 conditions.
- Dependent on fluorescence microscopy for plaque screening and standard PCR equipment for genotypic verification.
- Necessitates optimization of gRNA and donor vector design for each target locus to maintain editing specificity.
- Applicable to adherent mammalian cell lines like CV-1; adaptation to other systems may require empirical testing.
- Multiple rounds of plaque purification are needed to achieve clonal purity, impacting hands-on time despite overall 10-day timeline.
