Name: Methodik zur effizienten Erzeugung fluoreszierender Vaccinia-Virusproteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Erfahren Sie eine modulare Methode zur Erzeugung fluoreszierender rekombinanter Vaccinia-Viren mittels transienter dominanter Selektion. Dieses Protokoll vereinfacht die genetische Modifikation und verbessert die Effizienz bei der viralen Plaque-Isolierung erheblich.

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Diese Arbeit wurde durch das Australian Research Council Federation Discovery Project Grant #1096623 finanziert.

1. Erstellen des Rekombinationsvektors
<ol><li>Identifizieren Sie 150 bp lange flankierende Bereiche der Homologie (als linke und rechte Arme bezeichnet), die erforderlich sind, um entweder N- oder C-terminal zu kennzeichnen, das virusische Gen von Interesse zu kennzeichnen (siehe Abbildung 1b).</li>
	<li>Entwerfen Sie eine Oligonukleotid-Sequenz, die die 150 bp linken und rechten Arme umfasst, die durch ein Paar von Restriktionsstellen ihrer Wahl getrennt sind. Diese gesamte Sequenz muss auch durch ein zweites Paar von Restriktionsstellen (anders als das erste Paar) flankiert werden, um die Aufnahme in den TDS-Vektor nach der Synthese zu ermöglichen. Achten Sie beim Entwerfen des Oligonukleotids mit Restriktionsstellen darauf, dass die Sequenzen im Rahmen mit der gewünschten Einfügestelle sind.</li>
	<li>Integrieren Sie Bei der Gestaltung des Oligonukleotids für die Synthese Restriktionsstellen zwischen dem linken und dem rechten Arm,die denen entsprechen müssen, die den offenen Leserahmen des fluoreszierenden Tags der Wahl flankieren (siehe Abbildung 1b). Es ist möglich, eine NotI-Einschränkungsstelle als drei Aminosäure-Linker zwischen dem linken Arm und dem Beginn des Fluoreszenz-Tags zu verwenden.</li>
	<li>Integrieren Sie dieselben Restriktionssites auf beiden Seiten des Fluoreszenz-Tags durch PCR (siehe Abbildung 1c).</li>
	<li>Klonen Sie das synthetisierte Fragment in den TDS-Vektor.</li>
	<li>Klonen Sie das fluoreszierende Tag in den resultierenden Rekombinationsvektor mithilfe der Einschränkungsstellen zwischen dem linken und rechten Armder der Homologie (siehe Abbildung 1d).</li>
</ol>2. Rekombinante Virusgenerierung
<ol><li>Gemäß Abbildung 2infizieren Sie eine Monoschicht von BS-C-1-Zellen mit dem Impfvirus in serumfreien Medien bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) > 1.</li>
	<li>1 Std. nach der Infektion, Rettungszellen mit Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM) und transfekt mit einer Mischung aus Rekombinationsvektorplasmid und Transfektionsreagenz im Verhältnis 3:1 in serumfreien Medien.</li>
	<li>Nach 24 Stunden, kratzen und erholen Zellen in DMEM enthält kein fetales Rinderserum (FBS) und führen Drei Frost-Tau-Zyklen, um aufgebrochene Zellen zu brechen und Viruspartikel freizusetzen.</li>
	<li>Führen Sie einen Plaque-Assay mit einem flüssigen Overlay von 10% FBS DMEM und GPT-Auswahlreagenzien Mycophenolsäure (25 g/ml) und Xanthin (250 g/ml) wie folgt durch:<ol>
<li>Säen Sie eine 6-Well-Platte mit einer Monoschicht von BS-C-1-Zellen.</li>
		<li>Infizieren Sie 100% konfluente Zellmonolayer mit seriellen Verdünnungen der gefriergetauten Zellen, die Viruspartikel enthalten, um eine angemessene Trennung einzelner Plaques zu gewährleisten.</li>
		<li>Overlay mit flüssigen 10% FBS enthaltende DMEM enthält die GPT-Auswahlreagenzien - Mycophenolsäure und Xanthin bei Endkonzentrationen von 25 g/ml bzw. 250 g/ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Nach einer 24-stündigen Inkubation entfernen Sie die Flüssigkeitsüberlagerung und suchen mit einem Fluoreszenzmikroskop nach Plaques, die eine diffuse rote Fluoreszenz aufweisen, die der Einbeziehung von mCherry aus dem TDS-Vektor in das Virus entspricht. Je nach Zielgen und gewähltem Fluoreszenz-Tag kann die lokalisierte Fluoreszenz des markierten Gens auch in derselben roten Plaque beobachtet werden.</li>
	<li>Wählen Sie mehrere Plaques für jedes rekombinante Virus durch lokalisiertes Abkratzen mit einer Pipettenspitze und 100 l 5% FBS, das DMEM enthält, um Zellen in ein Eppendorf-Rohr zu übertragen, gefolgt von drei Runden Gefriertau von abgekratzten Zellen, um rekombinante Viren freizusetzen.</li>
	<li>Fügen Sie das DMEM enthaltende gefriertaute Virus zu einer Monoschicht von Zellen in einer 12-Well-Platte hinzu, um rekombinante Viren mit GPT-Selektionsreagenzien in den Wachstumsmedien zu verstärken. Kratze erfolgreiche Verstärkungen 24 Stunden nach der Infektion.</li>
	<li>Führen Sie einen Plaque-Test von erfolgreich verstärkten Plaques mit roter Fluoreszenz durch, diesmal mit einer Agarose-Overlay- und GPT-Auswahl, wie folgt:<ol>
<li>Säen Sie eine 6-Well-Platte mit einer Monoschicht von BS-C-1-Zellen.</li>
		<li>Führen Sie eine serielle Verdünnung der rekombinanten Viren durch und infizieren Sie Brunnen mit einer zunehmenden Verdünnung von Viren in FBS-freiem DMEM.</li>
		<li>1 Std. nach der Infektion, entfernen Sie die flüssigen Medien und überlagern Sie jeden Brunnen mit 0,5% Agarose in minimalem essentiellen Medium (MEM) mit 2,5% FBS, 292 g/ml L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin, zusammen mit den GPT-Auswahlreagenzien.</li>
	</ol></li>
	<li>2-3 Tage nach der Infektion, Wählen Sie Plaques mit Fluoreszenz, die sowohl rot ist und die Farbe der gewählten Fluoreszenz-Tag wieder zu verstärken, diesmal ohne GPT-Auswahl.</li>
	<li>Führen Sie den nächsten Plaque-Assay mit einem Agarose-Overlay ohne Auswahl durch.</li>
	<li>Wählen Sie Plaques, die ihre diffuse rote Fluoreszenz verloren haben, aber die lokalisierte Fluoreszenz beibehalten, die dem Tag der Wahl entspricht.</li>
	<li>Setzen Sie die Plaquereinigung ohne Auswahl fort, um einen reinen Vorrat an rekombinanten Viren zu erhalten, die die mCherry- und gpt-Selektionsgene verloren haben, aber die lokalisierte Fluoreszenz beibehalten, die dem gewählten Tag entspricht. Check Stocks sind rein durch Plaque Assay, alle Plaques sollten einen ähnlichen Plaque-Phänotyp haben.</li>
	<li>Verwenden Sie das PCR-Screening genomischer DNA, um sicherzustellen, dass virale Bestände rein sind.<ol>
<li>Designprimer, die die fluoreszierende Gen-Einfügungsstelle flankieren, und Primer, die das eingefügte fluoreszierende Gen selbst verstärken. Verschiedene Kombinationen dieser Primer erzeugen PCR-Amplicons, die die Geneinfügung erkennen und reinheit anzeigen.</li>
		<li>Verstärken Sie virale Bestände, um PCR in einem Brunnen einer 12-Well-Plattenmonolayer von BS-C-1-Zellen gescreent werden.</li>
		<li>24 Stunden nach der Infektion, kratzen infizierte Zellen in 250 l DMEM.</li>
		<li>Zentrifugen-infizierte Zellen (18.000 x g für 10 min, 4 °C), Überstand entfernen und Zellpellet in 500 l TE (10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA, pH 8) mit 0,1% (v/v) SDS wieder aufsetzen. Wirbel zu Lyse-Zellen.</li>
		<li>500 l Phenol-Chloroform-Isoamyl-Akohol hinzufügen, invertieren, um zu mischen. Zentrifuge (18.000 x g für 4 min, 4 °C). Nehmen Sie den Überstand und wiederholen Sie ihn.</li>
		<li>Führen Sie eine Ethanolfällung auf den Überstand durch Zugabe von 1 ml 100% Ethanol (gekühlt) und 50 l Natriumacetat, invertieren zu mischen.</li>
		<li>Bei -20 °C über Nacht oder -80 °C für 1 Stunde lassen. Zentrifuge (18.000 x g für 30 min, 4 °C), entfernen Sie alle Flüssigkeiten und lassen gefällte DNA lufttrocknen. Resuspend in 50 l TE.</li>
		<li>Verwenden Sie dies als Vorlage für das genomische DNA-PCR-Screening.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Generierung von rekombinanten Viren, die mehr als ein Tag tragen
<ol><li>Koinfizieren Sie dieselbe Zellmonoschicht mit fluoreszierenden rekombinanten Viren, um doppel- oder dreifach markierte Viren oder Wiederholungsprozeduren aus Protokoll 1) mit einem anderen Tag zu erzeugen.</li>
	<li>Reinigen Sie Viren auf der Grundlage von Plaque-Phänotyp oder PCR-Screening von Virusisolat genomische DNA.</li>
</ol>

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</ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.

Diese Technik beschreibt ein effizientes und modulares Protokoll zur Erzeugung rekombinanter Viren, die fluoreszierend markierte virale Proteine ausdrücken. Die Methode stellt sicher, dass die einzige Änderung am viralen Genom die Hinzufügung eines Tags oder Markers ist, sodass keine Auswahlmarker zurückbleiben. Die kurze Armlänge, die für die homologe Rekombination erforderlich ist, ermöglicht seine direkte Synthese, wodurch mehrere zeitaufwändige Runden pcR und Klonen eliminiert werden, während die Fluoreszenz von mCherry und metabolische GPT-Auswahl verwendet werden, um virale Rekombinationszwischenprodukte zu isolieren. Diese Zwischenprodukte können nach der Entfernung der Selektion zu einem Virus mit einem markierten Gen oder zurück zum elterlichen Typ aufgelöst werden. Eine ähnliche Methode, bei der sowohl fluoreszierende als auch metabolische Selektion verwendet wird, wurde zuvor27 beschrieben, obwohl die in dieser Studie verwendete Methode kürzere, synthetisierte Homologiebereiche nutzt, die die Identifizierung des gewünschten rekombinanten Virus ermöglichen, indem die Fluoreszenz des markierten Gens von Interesse geschildert wird. Diese sekundäre Auswahl ist nur für die Kennzeichnung hochexprimierter viraler Gene anwendbar, die in einem Plaque-Assay eine ausreichende Fluoreszenz erzeugen. Alternativ könnte man sich vorstellen, eine vollständige Expressionskassette einzufügen, zum Beispiel ein fluoreszierendes Protein unter einem starken viralen Promotor. In diesem Fall würden die linken und rechten Arme den Einfügepunkt definieren und nicht das virale Gen, das markiert werden soll.
Es gibt einige wichtige Schritte, die sich während des experimentellen Verfahrens als hilfreich erwiesen haben. Die oben beschriebene Flüssigkeitsüberlagerung in Schritt 2.3.3 erwies sich als entscheidend für den Nachweis und die Isolierung von rot-grünen Fluoreszenz-Plaques. Wir glauben, dass die Kombination der GPT-Auswahlreagenzien und Agarose-Overlay das Wachstum rekombinanter Viren abschreckte und daher für den ersten Schritt der Verstärkung von Viren nach der Transfektion auf ein flüssiges Overlay umgestellt wurde. Es ist auch wichtig, fluoreszierende Plaques zu wählen, die lokalisierte Tag-Farbfluoreszenz zur Anreicherung und Reinigung zeigen, da Zwischenprodukte, die durch die Rekombination des linken Arms entstehen, zu einer diffusen Fluoreszenz führen können, die in Plaques beobachtet wird, wenn der linke Arm auch eine Promotorsequenz enthält. Das mCherry-Markergen im TDS-Vektor kann beispielsweise auch durch gfpersetzt werden, um die einfache Einbindung und Auswahl von mCherry als fluoreszierendes Tag zu ermöglichen.
Einige oben beschriebene Techniken unterscheiden sich geringfügig von etablierten Methoden zur Entstehung des rekombinanten Impfvirus. Zum Beispiel ist die MOI des Virus verwendet, um Rekombinanten zu erstellen ist in der Regel weniger als 128, aber die Verwendung von höheren MOIs war ausreichend für die Schaffung von rekombinanten Vaknienvirus mit dieser Methode. Die Verwendung von GPT-Selektionsreagenzien erfordert in der Regel eine Vorinkubation der Zellen mit Selektionsreagenzien18, allerdings bietet die Zugabe während der Rettungsphase nach der Infektion noch eine ausreichende Auswahl an gewünschten Rekombinanten, insbesondere aufgrund des Vorhandenseins eines fluoreszierenden Selektionsmarkers.
Wie bereits erwähnt, ist eine der Einschränkungen dieser Technik, dass der sekundäre Fluoreszenzauswahlschritt davon abhängt, dass das markierte Protein von Interesse stark exprimiert wird, auf einem Niveau, das seine Erkennung durch Das Auge in einem Plaque-Assay ermöglicht. Ohne dies wäre es möglich, Viren zu reinigen, die nur mCherry-Fluoreszenz aufweisen, von denen mindestens 50% die gewünschten rekombinanten Viren enthalten würden, die durch molekulare Strategien wie PCR, wie in Schritt 2.12 beschrieben, identifiziert werden könnten. Eine weitere Einschränkung könnte die Inaktivierung bestimmter Proteine als Folge ihrer Kennzeichnung sein. Das fluoreszierende Tag kann Mutationen durchmachen oder durch das rekombinante Virus mit Passaging im Laufe der Zeit ausgeschnitten werden. Daher wird eine regelmäßige Probenahme von rekombinanten Virusbeständen durch Mikroskopie und PCR empfohlen. Schließlich kann die Anzahl der fluoreszierend markierten Proteine begrenzt werden, die in ein einzelnes Virus eingearbeitet werden können. Ein Aspekt davon ist die Fähigkeit, sie alle gleichzeitig zu visualisieren; Angesichts der Überlappung der Emissionsspektren verfügbarer Fluoreszenz-Tags ist es wichtig, sie sorgfältig auszuwählen, um eine minimale spektrale Durchblutung zu gewährleisten. Darüber hinaus eröffnet die Verwendung eng verwandter Tags wie GFP und Cerulean die Möglichkeit einer Rekombination zwischen den beiden, abhängig von ihren Positionen im rekombinanten Genom.
Der modulare Charakter dieser Technik ermöglicht die einfache Substitution von Fluoreszenz-Tags basierend auf kompatibilität mit anderen Färbungs- und/oder Tag-Optionen. Durch die Ausscheidung wählbarer Marker ermöglicht die TDS-Methode die serielle Zugabe verschiedener fluoreszierender Proteine oder die Kombination von TDS-basiertem Tagging mit TDS-basierten Genlöschungen für phänotypische Analysen29. Als Beispiel für den Nutzen dieses Ansatzes wurde ein doppelt markiertes fluoreszierendes Virus erzeugt, das Viruskerne und die WV-Membran kennzeichnet. Bildgebende Studien mit diesem Virus könnten verwendet werden, um Bewegung, Morphogenese und Das Umhüllung von Viren während der Virusreplikation zu untersuchen. Noch nicht charakterisierte Impfungviralproteine können auch mit dieser Technik markiert und untersucht werden.
Das Vaccinia-Virus wurde in bildgebenden Studien aufgrund vieler Merkmale des Virus, die für die Live-Zellmikroskopie günstig sind, ausgiebig eingesetzt. Fluoreszierende Tags werden aus dem viralen Genom exprimiert, wodurch die Transfektion überflüssig wird, sodass Primärzellen, die von infizierten Tieren oder nicht transfizierbaren Zellen gewonnen wurden, leicht analysiert werden können. Anfänglich wurden fluoreszierende VACVs für die einfache subzelluläre Verfolgung der Virusbewegung30verwendet, aber neuere Ansätze haben ihren Nutzen erweitert, um FRET-Studien31, FRAP an einzelnen Viruspartikeln32, Promoter-Reporter33, intravitale Bildgebung34und Strukturstudien35-37. Alle diese Techniken könnten in der Nähe von einfacher und näherer Reichweite mit dieser Methode der Schaffung rekombinanter fluoreszierender Viren sein.

Das Vaccinia-Virus (VACV) ist das prototypische Poxvirus und steht in entham mit dem Variolavirus, dem Erreger der Pocken, in Verbindung. Beide Viren sind Mitglieder der Gattung orthopox, die andere bemerkenswerte Krankheitserreger wie Affenpocken und Ektomienvirus (Mauspocken)1umfasst. Orthopoxviren haben große doppelsträngige DNA-Genome (180-220 kb), die mehr als 200 vorhergesagte offene Leserahmen2,3kodieren. Die Replikation dieser Viren beinhaltet die Bildung einer perinuclearvirus-Fabrik, in der ausgereifte Viren (MV) hergestellt werden, und das Trans-Golgi-Netzwerk, in dem eine Teilmenge von MV zwei zusätzliche Membranen anschafft, um verpackte Viren (WV) zu erzeugen (überprüft von Roberts und Smith4). Orthopox-Genome sind aufgrund des hohen Grades an genetischer Rekombination, der ein Merkmal der VACV-Genomreplikation ist und durch die virale DNA-Polymerase5vermittelt wird, sehr gut für genetische Manipulationen geeignet. Die Generierung rekombinanter Viren beruht auf homologen Rekombinationen und linearen DNA-Molekülen, wobei Homologien von nur 12 bp ausreichen, um eine Rekombination in impfvirusinfizierten Zellen zu vermitteln6. Die fluoreszierende Kennzeichnung von Impfstoffviren kann aufgrund der großen Größe von Orthopoxpartikeln extrem helle Viruspartikel hervorigen, was die Aufnahme vieler fluoreszierender Proteine pro Virion7ermöglicht. Vaccinia hat die Fähigkeit, große Fragmente fremder DNA8 zu tragen, und darüber hinaus kann das Fehlen einer starren Kapsidsymmetrie ein gewisses Maß an Flexibilität beim Ausdruck viraler Proteingenfusionen aus ihrem endogene loci9ermöglichen. Fluoreszierende Kennzeichnung von VACV-Proteinen hat sich als unschätzbar erwiesen für die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen auf subzellulärer Ebene, insbesondere im Bereich des Viruseintrags10, Transport11-13und Morphogenese, insbesondere von verpackten Virionen7.
Rekombinante Viren können durch Rettung eines abgeschwächten Wachstumsphäpnotyps14,15, metabolische Selektion16-18oder durch Expression eines Markergens(z.B. X-gal19 oder fluoreszierendes Protein13,20) ausgewählt werden. Hier beschreiben wir die Auswahl fluoreszierender Viren mit einer leistungsstarken Kombination aus fluoreszierender und metabolischer Selektion. Transient dominante Selektionsvektoren (TDS), entwickelt von Faulkner und Moss (1990)21, ermöglichen die Integration von Markern zusammen mit dem gewünschten fluoreszierend gekennzeichneten Gen von Interesse. Wenn die metabolische Selektion entfernt wird, kann ein sekundäres Rekombinationsereignis auftreten, das die Selektionsgene ausklammert, aber das fluoreszierend markierte Virusprotein intakt lässt. Abbildung 2 gibt einen Überblick über das experimentelle Verfahren. Die in dieser Studie verwendeten Selektionsgene sind mCherry und das Escherichia coli guanine phosphoribosyltransferase (gpt) Gen, beide aus einem synthetischen frühen/späten viralen Promotor exprimiert und zuvor von Cordeiro et al. verwendet. 22 Darüber hinaus gibt es fluoreszenz des markierten Fusionsproteins von Interesse. Wenn die metabolische Auswahl entfernt wird, werden die wählbaren Marker (mCherry und gpt) ausgeschnitten, sodass nur die Fluoreszenz des markierten Gens übrig bleibt, was die Identifizierung der richtigen rekombinanten Viren ermöglicht. Die Exzision der Selektionsmarker bietet die Möglichkeit, mehrere fluoreszierende Tags zu kombinieren, so dass wir Viren mit der Fähigkeit erzeugen können, mehrere virale Proteine gleichzeitig fluoreszierend zu kennzeichnen. Frühere Studien haben die minimalen Homologieanforderungen für die Vaknien-Rekombination von linearen und kreisförmigen DNA-Molekülen bestimmt, die in mit Dematratien infizierte Zellen transfiziert wurden6. Wir wollten die Rekombinationseffizienzen unterschiedlicher Homologielängen flankierender Arme im gpt-mCherry TDS-Vektor durch seine Aufnahme in das vaccinia virale Genom bestimmen. Es wurde festgestellt, dass homologe Regionen von 100 bp im TDS-Vektor ausreichen, um die Einfügung rekombinanter DNA in das VACV-Genom durch homologe Rekombination zu zielen und zu vermitteln (Abbildung 4). Während kleinere Homologielängen auch eine Rekombination ermöglichen würden, boten 100 bp Homologielängen genügend rekombinante Viren, die leicht mit metabolischer und fluoreszierender Selektion identifiziert werden konnten. DNA-Fragmente dieser Größe können zu relativ niedrigen Kosten kommerziell synthetisiert werden und erleichtern die Produktion mehrerer Vektoren für die Bildung rekombinanter Viren erheblich. Wir haben uns entschieden, die Homologielänge auf 150 bp zu erhöhen, um eine höhere Rekombinationshäufigkeit zu bieten und gleichzeitig die Kosten für die Synthese der Oligonukleotidsequenz flankierender Regionen niedrig zu halten.

<table><tbody><tr><td>Mycophenolsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3536-50MG</td><td>Lösen in 0,1 N NaOH</td></tr><tr><td>Xanthin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X0626-5G</td><td>Lösen in 0,1 N NaoH</td></tr><tr><td>FuGENE HD Transfektionsreagenz</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop mit Chroma-Filtern 31001, 31002</td><td>Olympus, Chroma</td><td>BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)&</td><td>nbsp;</td></tr></tbody></table>

methodik zur effizienten erzeugung fluoreszierender vaccinia-virusproteine

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Die Kennzeichnung viraler Proteine mit fluoreszierenden Proteinen hat sich als unverzichtbarer Ansatz erwiesen, um unser Verständnis von Virus-Host-Wechselwirkungen zu fördern. Das Vaccinia-Virus (VACV), der Lebendimpfstoff, der bei der Ausrottung von Pocken eingesetzt wird, ist aufgrund seiner großen Virionsgröße und der Leichtigkeit, mit der er auf Genomebene entwickelt werden kann, besonders für die fluoreszierende Lebendzellmikroskopie geeignet. Wir berichten hier über ein optimiertes Protokoll zur Generierung rekombinanter Viren. Es wurden die minimalen Anforderungen an eine gezielte homologe Rekombination während der Vaccinia-Replikation ermittelt, was eine Vereinfachung der Konstrukterzeugung ermöglicht. Dies ermöglichte die Allianz der transienten dominanten Selektion (TDS) mit einem fluoreszierenden Reporter und einer metabolischen Selektion, um einen schnellen und modularen Ansatz zur fluoreszierenden Kennzeichnung viraler Proteine zu bieten. Durch die Rationalisierung der Erzeugung fluoreszierender rekombinanter Viren sind wir in der Lage, nachgelagerte Anwendungen wie die erweiterte bildgebende Analyse vieler Aspekte des Virus-Host-Zusammenspiels, die während der Virusreplikation auftreten, zu erleichtern.

Abbildung 1 listet die verschiedenen Konstrukte auf, die für dieses Verfahren erforderlich sind, die entweder synthetisiert (Abbildungen 1b und 1c) oder durch Klonschritte erstellt werden (Abbildung 1d). Abbildung 2 gibt einen Überblick über das experimentelle Verfahren mit repräsentativen fluoreszierenden Plaquebildern eines A3-GFP-rekombinanten VACV, das für jeden Schritt des Auswahlprozesses dargestellt wird. In Abbildung 3werden rekombinante Impfviren gezeigt, die Proteine exmittierten, die mit fluoreszierenden Markern markiert sind, die auf virale Strukturproteine A3 und F13 abzielen, die Teil des inneren Viruskerns23 bzw. der äußeren Hülle24sind. Beobachtungen von Virusplaques und infizierten Zellen für jedes der erzeugten rekombinanten Viren werden dargestellt. Die Effizienz der homologen Rekombination von Vektoren mit dem VACV-Genom, das so wenig wie 70 bp Homologiebereiche enthält, wurde getestet und die Ergebnisse sind in Abbildung 4dargestellt. Der relative Erfolg der Identifizierung viraler Plaques, die aus der Rekombination mit Vektoren mit 100 bp Homologie hergestellt wurden, war der Grund für die Entscheidung, 150 bp Länge links und rechts der Homologie zum Zielgen zu synthetisieren.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1.jpg" width="400px"> Abbildung 1. Transient Dominant Selection (TDS) Rekombinationsvektor. (a) TDS-Vektor mit gpt- und mCherry-Auswahlmarkern. (b) Die linken und rechten Arme der Homologie sind mit spezifischen Restriktionsstellen dazwischen und flankierend auf die Arme der Homologie ausgelegt. Restriktionsstellen zwischen dem linken und rechten Arm, die bei dieser Methode verwendet wurden, waren NotI und BamHI, wobei die NotI-Site auch als Bindeglied zwischen dem Gen und dem fluoreszierenden Tag verwendet wurde. (c) Fluoreszierende Tags, die mit dieser Methode kompatibel sind, werden von entsprechenden Einschränkungsstellen flankiert. Einige Tags sind GFP (grünes fluoreszierendes Protein), RFP (rotes fluoreszierendes Protein), Cerulean (eine Verbesserung gegenüber ECFP, einem Cyan-Fluoreszenzprotein, durch standortgesteuerte Mutagenese25) und Mini-SOG, ein fluoreszierendes Protein aus GFP, das ein Produkt erzeugt, das von EM auf Beleuchtung aufbereitet wird26. (d) Klonschritte bei der Erzeugung des endgültigen TDS-Rekombinationsvektors. Das synthetisierte Oligonukleotid, das die linken und rechten Flankenarme enthält, wird zuerst in den TDS-Vektor geklont. Dies bietet einen Rekombinationsvektor, in den jedes Tag ihrer Wahl durch Klonen in die Zwischenhalteflächen zwischen dem linken und rechten Arm ein- und ausgegliedert werden kann. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2.jpg" width="500px"> Abbildung 2. Gliederung des experimentellen Verfahrens zur Erstellung eines rekombinanten Impfungsvirus. Ereignisse, die auf genetischer und zellulärer Ebene auftreten, werden dargestellt, zusammen mit repräsentativen Plaque-Bildern, die die Schritte nach der Entstehung eines A3-GFP-markierten fluoreszierenden Impfvirus skizzieren. (A) Zellen, die mit dem Impfvirus infiziert sind, werden mit dem TDS-Rekombinationsvektor transfiziert. (B) In dieser Abbildung wird nur das Ergebnis der Linksrekombination dargestellt, und das Beispiel verwendet GFP als fluoreszierendes Tag der Wahl. Eine Rechtsrekombination würde dazu führen, dass das gesamte TDS-Plasmid in ähnlicher Weise in das Genom integriert wird, außer dass das Tag im Zwischenschritt, d. h. Schritt C, mit dem gesamten Zielgen verschmolzen würde. Ein Plaque-Assay wird auf einer Zellmonolayer mit dem Rekombinationsmix durchgeführt und der GPT-Auswahl unterzogen. (C) Plaques mit roter und grüner Fluoreszenz, die dem mCherry- bzw. GFP-Ausdruck entsprechen, werden gepflückt und verstärkt. Sobald die Selektion entfernt ist, wird es einen Verlust der roten Fluoreszenz geben, der dem Verlust der gpt- und mCherry-Gene (D) entspricht, und Plaques, die ausschließlich grüne Fluoreszenz aufweisen, werden gepflückt und verstärkt (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3.jpg" width="500px"> Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse des TDS-Rekombinationssystems. Die Bilder zeigen ganze Plaques rekombinanter VACV-Infektionszellen nach 48 Stunden(a, c, e; Scale bar 100 m), begleitet von einem Bild einer einzelnen Zelle, die nach 8 Stunden mit dem entsprechenden rekombinanten Virus infiziert ist (b, d, f; Scale bar 10 m). Gene, die Virionen-lokalisierten Proteinen entsprechen, wurden ausgewählt, um Viruspartikel zu visualisieren. A3 ist ein Kernprotein der Vaknia virion (a, b) und F13 (c, d) ist ein virales Umschlagprotein. Ein doppelt markiertes Virus mit fluoreszierend a3 und F13 (e, f) wird ebenfalls gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4.jpg" width="500px"> Abbildung 4. Quantitative Analyse der Rekombinationseffizienz zwischen rekombinanten Vektoren und dem VACV-Genom. BS-C-1-Monolayer wurden mit VACV infiziert und transfizierten 1 Stunde nach der Infektion mit drei Rekombinationsvektoren, die Homologiebereiche von entweder 500 bp, 100 bp oder 70 bp zum VACV-Genom enthielten. Jeder Vektor enthielt auch die TDS-Kassette, die gpt- und mCherry-Selektionsgene enthielt. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Infektion geborgen und lysiert, um die gebildeten rekombinanten Viren freizusetzen. Plaque-Assays wurden an Zelllysaten mit GPT-Auswahlmedien durchgeführt und Plaques, die mCherry Fluoreszenz zeigten, wurden als erfolgreiche Rekombinanten gezählt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5.jpg" width="500px"> Abbildung 5. Karte des gpt-mCherry TDS-Vektors, der die Multiple-Klon-Site anzeigt. Der Vektor wurde zuvor22 beschrieben und die Vektorkarte wurde mit Hilfe von EZ Plasmid Map v1.9 von der Zhang Lab Group (SCU) erstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>

Hier wird ein schnelles und modulares Protokoll zur Erzeugung rekombinanter Impfstoffviren beschrieben, die fluoreszierend markierte Proteine gleichzeitig mit der Methode der transienten dominanten Selektion exezieren.

Methodik zur effizienten Erzeugung fluoreszierender Vaccinia-Virusproteine

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Dieses Experiment erzeugt fluoreszenzmarkierte rekombinante Vaccinia-Viren mithilfe einer modularen und schnellen Methode, die auf einer vorübergehenden dominanten Selektion basiert. Zunächst wird ein rekombinanter Vektor erstellt, der einen fluoreszenten Marker enthält, der von synthetisierten minimalen homologen Bereichen sowie Markern für die metabolische und fluoreszente Selektion umgeben ist. Dieser Rekombinationsvektor wird in infizierte Zellen transfiziert und die rekombinanten Viren werden durch metabolische Selektion und Fluoreszenz angereichert. Anschließend wird die metabolische Selektion entfernt, um das Markerkassetten-Gen zu excidieren, und die Zellen, die rekombinante Viren enthalten, werden mittels fluoreszenter Markerauswahl isoliert. Die Analyse viraler Plaques auf Zellmonolagen ermöglicht die Visualisierung einzelner Viruspartikel, die charakteristisch für das fluoreszenzmarkierte Gen sind.Wir haben diese Methode entwickelt, um rekombinante Viren mit mehreren genetischen Modifikationen zu erzeugen, wobei eine Selektionsmethode verwendet wird, die unabhängig vom Tag wiederholt und universell eingesetzt werden kann. Obwohl das Prinzip der transienten dominanten Selektion bereits früher beschrieben wurde, wollten wir es in größerem Maßstab und modular anwenden, um mehr Flexibilität bei der Vornahme genomischer Modifikationen zu erlangen. Eine visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da das Screening und die Isolierung rekombinanter Virus-Plaques schwierig sein können. Ihre Häufigkeit kann gering sein, weshalb spezielle Methoden für eine effiziente Gewinnung des Virus erforderlich sind.Markieren Sie also das gewünschte virale Gen am N- oder C-Terminus des Proteins. Identifizieren Sie entsprechend 150 Basenpaare lange flankierende homologe Bereiche. Entwerfen Sie dann eine Oligonukleotidsequenz, die aus den 150 Basenpaare langen linken und rechten Armen besteht, die durch ein Paar ausgewählter Restriktionsstellen getrennt sind. Flanken Sie diesen Bereich außerdem durch ein zweites Paar von Restriktionsstellen, das sich von dem ersten Paar unterscheidet, um die Einbindung in den TDS-Vektor nach der Synthese zu ermöglichen. Überprüfen Sie nun, ob das Oligonukleotid mit den Restriktionsstellen so konzipiert ist, dass es im Leseraster mit der gewünschten Insertionsstelle liegt. Für die Oligonukleotidsynthese stellen Sie sicher, dass die zwischen den linken und rechten Armen eingefügten Restriktionsstellen mit denen übereinstimmen, die den offenen Leserahmen des gewählten Fluoreszenzmarkers flankieren. Fügen Sie diese gleichen Restriktionsstellen mittels PCR auf beiden Seiten des Fluoreszenzmarkers ein. Klonen Sie das synthetisierte Fragment in den TDS-Vektor. Klonen Sie außerdem den Fluoreszenzmarker unter Verwendung der Restriktionsstellen zwischen den Bereichen der linken und rechten homologen Arme in den resultierenden Rekombinationsvektor. Infizieren Sie eine Monoschicht von BS-C-1-Zellen mit Vacciniavirus in serumfreiem Medium.Eine Stunde nach der Infektion die Zellen mit Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium retten. Transfizieren Sie mit einer Mischung aus Rekombinationsvektor-Plasmid und Transfektionsreagenzien im Verhältnis drei zu eins in serumfreiem Medium. Nach 24 Stunden die Zellen abkratzen und in DMEM ohne fetalen bovinen Serum gewinnen. Den Zellen drei Gefrier-Tau-Zyklen unterziehen, um die Zellen zu lysieren und die Viruspartikel freizusetzen. Um eine ausreichende Trennung einzelner Plaques zu erzielen, infizieren Sie 100 % konfluente Zellmonolagen aus BS-C-1-Zellen mit seriellen Verdünnungen der Virensuspension. Mit flüssigem 10 % FBS und DMEM plus GPT-Selektionsreagenzien überlagern und 24 Stunden inkubieren.Entfernen Sie die flüssige Überlagerung und verwenden Sie ein fluoreszierendes Mikroskop, um nach Plaques mit diffuser roter Fluoreszenz zu suchen, die der Einbindung von M-Cherry aus dem TDS-Vektor in das Virus entspricht. Abhängig vom Zielgen und dem gewählten Fluoreszenzfarbstoff kann im selben roten Plaque auch eine lokalisierte Fluoreszenz des Markergens beobachtet werden.Um nun mehrere Plaques für jeden rekombinanten Virus zu gewinnen, diese mit der Pipettenspitze abkratzen und die Zellen mit 100 Mikrolitern DMEM, das 5 % FBS enthält, in ein Eppendorf-Röhrchen überführen. Führen Sie drei Zyklen von Einfrieren und Auftauen der abgekratzten Zellen durch, um die rekombinanten Viren freizusetzen.Gebe das DMEM, das aufgetauten Virus enthält, auf eine Zellmonolayer in einer 12-Loch-Platte, um die rekombinanten Viren mit GPT-Auswahlreagenzien im Wachstumsmedium zu amplifizieren. Schabe anschließend die erfolgreichen Amplifikationen 24 Stunden nach der Infektion ab. Für einen Plaque-Assay erfolgreich amplifizierter Plaques, die rote Fluoreszenz zeigen, besäe eine 6-Loch-Platte mit einer Monolayer von BS-C-1-Zellen. Führen Sie eine serielle Verdünnung der rekombinanten Viren durch und infizieren Sie die Vertiefungen mit einer zunehmenden Verdünnung der Viren in FBS-freiem DMEM. Eine Stunde nach der Infektion entfernen Sie das flüssige Medium und überdecken jede Vertiefung mit 0,5 % Agarose in vollständigem minimalem essentiellem Medium. Drei Tage nach der Infektion isolieren Sie die Plaques, die sowohl rote Fluoreszenz als auch die Farbe des gewählten Fluoreszenzmarkers aufweisen.Verstärken Sie diese erneut ohne GPT-Auswahl. Wählen Sie Plaques aus, die ihre diffuse rote Fluoreszenz verloren haben, aber die lokalisierte Fluoreszenz entsprechend dem gewählten Tag beibehalten. Fahren Sie mit der Plaque-Reinigung ohne Selektion fort, um eine reine Stammlösung rekombinanter Viren zu erhalten, die die M-cherry- und GPT-Selegensgene verloren haben, aber die lokalisierte Fluoreszenz entsprechend dem gewählten Tag beibehalten.Beurteilen Sie die Reinheit der Vorräte mittels einer Plaque-Assay, wobei alle Plaques ein ähnliches Plaque-Phänotyp aufweisen sollen. Amplifizieren Sie die Testvirusvorräte in einer Monoschicht von BS-C-1-Zellen. 24 Stunden nach der Infektion werden die infizierten Zellen in 250 Mikroliter DMEM abgeschabt. Zentrifugieren Sie die infizierten Zellen, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikroliter 0,1 %iger SDS-Lösung in TE-Puffer. Vortexen Sie, um die Zellen zu lysieren. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol hinzu und invertieren Sie zur Vermischung. Zentrifugieren Sie. Gewinnen Sie die obere Phase und wiederholen Sie die Extraktion.Um anschließend die DNA aus der wässrigen Schicht auszufällen, geben Sie ein Milliliter kalten, 100 %igen Ethanol und 50 Mikroliter Natriumacetat hinzu. Mischen Sie durch mehrmaliges Vorsichtig Invertieren und stellen Sie die Probe über Nacht bei minus 20 Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren zur Pellettierung der DNA entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit, trocknen das DNA-Pellet lufttrocken und lösen es in 50 Mikrolitern TE-Puffer auf. Verwenden Sie diese genomische DNA als Vorlage für die PCR-Detektion viraler Insertionen. Erzeugen Sie rekombinante Viren mit mehreren Markierungen, wie im textuellen Protokoll beschrieben.Diese rekombinanten Vaccinia-Viren exprimieren mit fluoreszierenden Markern gekennzeichnete Proteine, die gegen virale Strukturproteine, A3 und F13, gerichtet sind, die jeweils Teil des inneren Virus-Kerns und der äußeren Hülle sind. Gene, die entsprechenden in Virionen lokalisierten Proteinen entsprechen, wurden zur Visualisierung von Viruspartikeln ausgewählt. A3 ist ein Kernprotein des Vaccinia-Virions, und F13 ist ein virales Hüllprotein.Ein doppelt markiertes Virus mit sowohl fluoreszenzmarkiertem A3 als auch F13 ist ebenfalls dargestellt. Mit einem doppelt markierten Virus kann eine Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden. In diesem Fall wird das innere Core-Protein des Vaccinia-Virus, A3, rot markiert und das äußere Hüllprotein F13 grün markiert.Unverpackte Viruspartikel aus der Virusfabrik werden rot dargestellt, verpackte Virionen durch die Kolokalisation der roten und grünen Kanäle. Zur Bestimmung der Rekombinationswirksamkeit zwischen rekombinanten Vektoren und dem Vaccinia-Virusgenom wurde eine quantitative Analyse verwendet. Die Effizienz der homologen Rekombination von Vektoren mit dem Vaccinia-Virusgenom kann bereits mit homologen Regionen von nur 70 Basenpaaren nachgewiesen werden.Mithilfe dieser Methode wurden Viren mit mehreren fluoreszierenden Markierungen und/oder mehreren Genlöschungen erzeugt. Diese wurden zur Untersuchung des infektiösen Lebenszyklus des Virus, der Rolle viraler Proteine bei der Unterminierung der Wirtsabwehrsysteme sowie der Wechselwirkungen mit den Signalwegen des Wirts eingesetzt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie rekombinante Vaccinia-Viren mithilfe einer Methode erzeugt werden können, die modulare Markierungen verwendet, sorgfältig die gewünschten Rekombinanten identifiziert und in einer Vielzahl von Forschungskontexten anwendbar ist.

methodology-for-efficient-generation-fluorescently-tagged-vaccinia

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Verfahren zur Verfolgung synaptisch verbundenen Neuronen beschrieben. Wir verwenden TVA Spezifität eines vorgeschalteten Zelle zu untersuchen, ob eine Zellpopulation von Interesse synaptischen Input von genetisch definierten Zelltypen erhält.

Viral Tracing von genetisch definierten Neural Circuitry

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the expansion of plaque-derived recombinant virus in adherent mammalian cells. The virus carries a fluorescent reporter in place of a virulent gene, enabling infection tracking. Infected cells are harvested for PCR verification of the genetic modification.

Expansion of Mutant Vaccinia Virus in Mammalian Cells

Quelle: Rozelle, D. K., et al. Vaccinia-Reporterviren zur Quantifizierung der viralen Funktion in allen Phasen der Genexpression. J. Vis. Exp. (2014)Dieses Video demonstriert eine Methode zur Überwachung der Vaccinia-Virusreplikation unter Verwendung fluoreszierender Reporter, die durch stadienspezifische Promotoren reguliert werden. Die sequenzielle Expression grüner, roter und blauer fluoreszierender Proteine kennzeichnet die frühen, intermediären und späten Phasen der Infektion und...

Überwachung der stadien-spezifischen Genexpression im Vaccinia-Virus mittels fluoreszierender Reporter

Quelle: Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramyxoviren für die tumorspezifische Immunmodulation: Design und Evaluierung ex vivo. J. Vis. Exp. (2019)In diesem Video wird die Herstellung rekombinanter Masernviren demonstriert, bei der Liposomen verwendet werden, um Plasmide, die das virale Antigenom und essentielle Hilfsproteine kodieren, in Produzentenzellen einzubringen. Die transkribierte und replizierte RNA führt zur Bildung von Viruspartikeln, die immunstimulierende und fluoreszierende...

Erzeugung eines rekombinanten Masernvirus, das ein immunostimulatorisches Protein kodiert

Quelle: Marzook, N. B., et al., Methodik zur effizienten Herstellung fluoreszenzmarkierter Vaccinia-Virus-Proteine. J. Vis. Exp. (2014)Dieses Video demonstriert die Erzeugung rekombinanter Vaccinia-Viren mittels plasmidvermittelter homologer Rekombination in infizierten epithelialen Zellen. Fluoreszierende und metabolische Marker ermöglichen die Selektion und Identifizierung von Viren, die markierte Proteine exprimieren.

Identifizierung von rekombinanten Vaccinia-Virus-infizierten Zellen mittels metabolischer und fluoreszierender Selektion

Wir beschreiben die Verwendung eines fluoreszierenden Reporter Vaccinia-Virus, das Echtzeit-Messung der viralen Infektiosität und Genexpression ermöglicht durch die Stufe-spezifische Expression von spektral unterschiedlichen Fluorophoren Reporter. Wir detailliert ein plattenbasierte Verfahren zum genauen Identifizieren der Phase, in der die Virusreplikation in Reaktion auf kleine Molekül Inhibierung betroffen.

Vaccinia-Viren Reporter zur Quantifizierung von Viral-Funktion auf allen Stufen der Genexpression

Hier stellen wir ein Protokoll für die Synthese von virusähnlichen Partikeln entweder Baculovirus oder Säuger-Expressionssystemen und Ultrazentrifugation Reinigung. Dieser hochgradig anpassbare Ansatz wird verwendet, um virale Antigene als Impfstoff Ziele in eine sichere und flexible Art und Weise identifizieren.

Expression und Reinigung von virusähnlichen Partikeln zur Vakzinierung

Vaccinia-Virus (VV) ist in der biomedizinischen Forschung und der Verbesserung der Gesundheit des Menschen weit verbreitet. Dieser Artikel beschreibt eine einfache, hocheffiziente Methode, um die VV-Genom mit Hilfe eines CRISPR-Cas9 System zu bearbeiten.

Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren

Herpesvirus Puten (HVT) ist als ein Vektor-Plattform für die Generation von rekombinanten Impfstoffen gegen eine Reihe von Vogelkrankheiten verbreitet. Dieser Artikel beschreibt einen einfachen und schnellen Ansatz für die Erzeugung von rekombinanten HVT vektorielle Impfstoffe mit einem integrierten NHEJ-CRISPR/Cas9 und Cre Lox System.

Generierung von rekombinanten aviären Herpesvirus Vektoren mit CRISPR/Cas9 gen bearbeiten

Dies ist eine Methode, um "scarinant" rekombinante Vaknie-Viren mit Host-Range-Auswahl und visuelle Identifizierung von rekombinanten Viren zu generieren.

Schnelle, nahtlose Generierung von rekombinanten Poxviren mit Host Range und visueller Auswahl

Erfahren Sie eine modulare Methode zur Erzeugung fluoreszierender rekombinanter Vaccinia-Viren mittels transienter dominanter Selektion. Dieses Protokoll vereinfacht die genetische Modifikation und verbessert die Effizienz bei der viralen Plaque-Isolierung erheblich.

Methodik zur effizienten Erzeugung fluoreszierender Vaccinia-Virusproteine

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