Methodik zur effizienten Erzeugung fluoreszierender Vaccinia-Virusproteine

Dieses Experiment erzeugt fluoreszenzmarkierte rekombinante EO-Viren durch eine modulare und schnelle Methode, die auf transienter dominanter Selektion basiert. Erstellen Sie zunächst einen rekombinanten Vektor, der ein Fluoreszenz-Tag enthält, das von synthetisierten minimalen Homologieregionen sowie Markern für die metabolische und fluoreszierende Selektion umgeben ist. Transfizieren Sie diesen Rekombinationsvektor in infizierte Zellen und amplifizieren Sie ihn für rekombinante Viren durch metabolische Selektion und Fluoreszenz.

Entfernen Sie als Nächstes die metabolische Selektion, um die Markerkassette zu entfernen, und isolieren Sie die Zellen, die rekombinante Viren enthalten, durch Fluoreszenzmarker. Auswahl. Die Ergebnisse von viralen Plaques auf Zellmonoschichten ermöglichen die Visualisierung einzelner Viruspartikel, die für das fluoreszenzmarkierte Gen charakteristisch sind. Wir haben diese Methode entwickelt, weil wir rekombinante Viren mit mehreren genetischen Modifikationen erzeugen wollten, indem wir eine Selektionsmethode verwenden, die unabhängig von der Markierung wiederholt und universell eingesetzt werden kann.

Obwohl das Prinzip der transienten dominanten Selektion bereits zuvor beschrieben wurde, wollten wir es in größerem Maßstab und modular anwenden, um uns mehr Flexibilität bei der Durchführung genomischer Modifikationen zu geben. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das Screening und die Isolierung von rekombinanten viralen Plaques schwierig sein können. Ihre Häufigkeit kann gering sein, und daher sind einige einzigartige Methoden für eine effiziente Wiederherstellung des Virus erforderlich.

Also markiert ein virales Gen von Interesse am N- oder C-Ende des Proteins. Identifizieren Sie dementsprechend 150 Basenpaare lange, flankierende Regionen der Homologie. Entwerfen Sie dann eine Oligonukleotidsequenz, die den linken und rechten Arm mit 150 Basen umfasst, die durch ein Paar Restriktionsstellen Ihrer Wahl getrennt sind.

Flankieren Sie diesen Bereich auch durch ein zweites Paar von Restriktionsstellen, die sich vom ersten Paar unterscheiden, um den Einbau in den TDS-Vektor zu ermöglichen. Nach der Synthese ist nun zu überprüfen, ob das Oligonukleotid mit den Restriktionsstellen so gestaltet ist, dass es sich im Rahmen mit der gewünschten Insertionsstelle befindet. Für die Oligonukleotidsynthese stellen Sie sicher, dass die Restriktionsstellen zwischen dem linken und rechten Arm eingebaut sind.

Passen Sie sie an die Flanken des offenen Leserahmens des Fluoreszenzetiketts Ihrer Wahl an. Integrieren Sie dieselben Restriktionsstellen auf beiden Seiten des Fluoreszenz-Tags durch PCR. Klonen Sie das synthetisierte Fragment in den TDS-Vektor.

Klonieren Sie auch den Fluoreszenz-Tag in den resultierenden Rekombinationsvektor unter Verwendung der Restriktionsstellen zwischen dem linken und rechten Arm. Regionen der Homologie. Infizieren Sie eine Monoschicht von BSC one-Zellen mit dem Vaccinia-Virus und serumfreien Medien.

Eine Stunde nach der Infektion. Retten Sie die Zellen mit ECCOs modifiziertem Eagle-Medium, das mit einer Mischung aus Rekombinations-, Vektorplasmid- und Transfektionsreagenzien in einem Verhältnis von drei zu eins in serumfreien Medien transfectiert wird. Nach 24 Stunden werden Zellen in DMEM, die kein fötales Rinderserum enthalten, abgekratzt und zurückgewonnen.

Setzen Sie die Zellen drei freien Auftauzyklen aus, um die Zellen aufzubrechen und die Viruspartikel freizusetzen, um eine angemessene Trennung der einzelnen Plaques zu erreichen. Infizieren Sie 100% konfluente Zellmonoschichten von BSC one Zellen mit seriellen Verdünnungen der Zubereitung von Viruspartikeln. Überlagern Sie es mit flüssigen 10% FBS und DMEM sowie der GPT-Auswahl, den Reagenzien und inkubieren Sie es 24 Stunden lang.

Aspirieren Sie die flüssige Überlagerung und suchen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop nach Plaques. Mit diffuser roter Fluoreszenz, die dem Einbau von M-Kirsche aus dem TDS-Vektor in das Virus entspricht. Abhängig vom Zielgen und dem gewählten Fluoreszenz-Tag kann eine lokalisierte Fluoreszenz des Tag-Gens auch in derselben roten Plaque beobachtet werden.

Um nun mehrere Plaques für jedes rekombinante Virus zu entnehmen, kratzen Sie mit der Pipettenspitze und übertragen Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern 5%FBS, die DMEM enthalten, in ein Einor-Röhrchen. Führen Sie drei Runden des Gefrierauftauens der geschabten Zellen durch. Um die rekombinanten Viren freizusetzen.

Geben Sie das DMEM-haltige Gefrier-aufgetaute Virus in eine Monoschicht von Zellen. In einer 12-Well-Platte zur Amplifikation der rekombinanten Viren mit GPT-Selektionsreagenzien in den Wachstumsmedien. Kratzen Sie dann die erfolgreichen Amplifikationen 24 Stunden nach der Infektion ab, um einen Plaque-Assay mit erfolgreich amplifizierten Plaques zu erhalten, die eine rote Fluoreszenz C zwei sechs aufweisen, die gut mit einer Monoschicht von BSC 1-Zellen gespielt wird.

Führen Sie eine serielle Verdünnung der rekombinanten Viren durch und infizieren Sie die Vertiefungen mit einer zunehmenden Verdünnung von Viren in FBS-freiem DME M1 Stunde nach der Infektion. Entfernen Sie das flüssige Medium und überlagern Sie jede Vertiefung drei Tage nach der Infektion mit 0,5 % Agros in einem vollständigen, minimalen essentiellen Medium. Wählen Sie die Plaques aus, die eine Fluoreszenz aufweisen, die sowohl rot als auch die Farbe des gewählten Fluoreszenz-Tags ist.

Verstärken Sie diese wieder ohne GPT-Auswahl. Wählen Sie Plaques aus, die ihre diffuse rote Fluoreszenz verloren haben, aber die lokalisierte Fluoreszenz beibehalten, die dem Tag der Wahl entspricht. Setzen Sie die Plaquereinigung ohne Selektion fort, um einen reinen Bestand an rekombinanten Viren zu erhalten, die die Selektionsgene M-Kirsche und GPT verloren haben, aber die lokalisierte Fluoreszenz beibehalten, die dem gewählten Tag entspricht.

Bewerten Sie die Reinheit der Stämme mit einem Plaque-Assay, der auf alle Plaques eines ähnlichen Plaque-Phänotyps abzielt. Amplifizieren Sie die Testvirusstämme in einer Monoschicht aus BSC one-Zellen. 24 Stunden nach der Infektion kratzen Sie die infizierten Zellen in 250 Mikroliter DMEM-Zentrifuge und zentrifugieren Sie die infizierten Zellen.

Entfernen Sie das Supernat und resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikrolitern 0,1 % SDS im TE-Pufferwirbel, um die Zellen zu lyzieren. Fügen Sie dann 500 Mikroliter Phenol, Chloroform, Isoamylalkohol hinzu und invertieren Sie die Zentrifuge. Ernten Sie die obere Phase und wiederholen Sie die Extraktion.

Um die DNA aus der wässrigen Schicht auszufällen, fügen Sie dann einen Milliliter gekühltes, 100%iges Ethanol und 50 Mikroliter Natriumacetat hinzu. Mischen Sie durch Inversion und stellen Sie die Probe über Nacht bei minus 20 Grad Celsius auf. Nachdem Sie die DNA durch Zentrifugation pelletiert haben, entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit und trocknen Sie das DNA-Pellet und die Reanimation an der Luft.

Suspendieren Sie es in 50 Mikrolitern TE-Puffer. Verwenden Sie diese genomische DNA-Vorlage, um ein PCR-Screening auf Virusinsertion durchzuführen. Generieren Sie rekombinante Viren mit mehreren Tags, wie im Textprotokoll beschrieben.

Diese rekombinanten Vaccinia-Viren exprimieren Proteine, die mit fluoreszierenden Markern markiert sind, die auf die viralen Strukturproteine A drei und F 13 abzielen, die Teil des inneren Viruskerns bzw. der äußeren Hülle sind. Gene, die den virionlokalisierten Proteinen entsprechen, wurden ausgewählt, um Viruspartikel sichtbar zu machen. A drei ist ein Kernprotein des Vaccinia-Virions, und F 13 ist ein virales Hüllprotein.

Ein doppelt markiertes Virus, das sowohl fluoreszenzmarkiert ist als auch mit F 13, ist ebenfalls zu sehen. Die Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie kann mit einem doppelt markierten Virus durchgeführt werden. In diesem Fall das innere Kernprotein des Vaccinia-Virus. Eine Drei ist rot markiert und das äußere Hüllprotein F 13 ist grün markiert.

Unverpackte Viruspartikel aus der Virusfabrik werden rot visualisiert und verpacktes Virion wird durch Kolokalisation von roten und grünen Kanälen dargestellt. Die quantitative Analyse wurde verwendet, um die Rekombinationseffizienz zwischen rekombinanten Vektoren und dem Vaccinia-Virusgenom zu bestimmen. Die Effizienz der homologen Rekombination von Vektoren mit dem Vaccinia-Virus-Genom kann bereits mit 70 Basenpaarregionen der Homologie nachgewiesen werden.

Diese Methode wurde verwendet, um Viren mit mehreren fluoreszierenden Markierungen und/oder mehreren Gendeletionen zu erzeugen. Diese wurden bei der Untersuchung des infektiösen Lebenszyklus von Viren, der Rolle viraler Proteine bei der Unterwanderung von Wirtsabwehrsystemen sowie der Wechselwirkungen mit den Signalprozessen des Wirts eingesetzt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie rekombinante Vaccinia-Viren mit einer Methode erzeugt werden können, die modular in den verwendeten Tags ist, akribisch bei der Auflösung gewünschter Rekombinanten und in einer Vielzahl von Forschungskontexten anwendbar ist.