Eine effiziente Methode erhalten Sie Dedifferenzierte Fettzellen

Das übergeordnete Ziel dieser neuartigen Zellkulturmethode ist es, dedifferenzierte Fettzellen mit größerer Effizienz zu erzeugen. Unsere Methode kann Forschern auf dem Gebiet der regenerativen Medizin helfen, Schlüsselfragen zu den verschiedenen Prozessen zu beantworten, die an der Herstellung adipogener, osteogener und chondrogener Zellen beteiligt sind. Da der Hauptvorteil unseres Zellkulturprotokolls darin besteht, dass es die Qualität der DEFAT-Zellen verbessert, könnte es in naher Zukunft eingesetzt werden, um aktuelle Anwendungen in der Zelltherapie und im Tissue Engineering zu verbessern.

Nachdem Sie die subkutane Fettprobe des Patienten aus dem Operationssaal ins Labor gebracht haben, wiegen Sie das Gewebe und geben Sie eine ein bis zwei Gramm schwere Probe des Fettgewebes in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie dann die Probe mit fünf Millilitern PBS und geben Sie die Probe dann in eine 10 Zentimeter große Plastikschale. Entfernen Sie das PBS.

Geben Sie dann 10 Milliliter sterile Kollagenase mit 0,1 % Gewicht pro Volumen in die Schale, die die Probe enthält. Anschließend das Gewebe mit einer chirurgischen Schere zerkleinern, bis es eine pürierte Konsistenz erreicht hat. Übertragen Sie das gehackte Gewebe und die Kollagenaselösung in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und verdauen Sie es 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie es bei 60 U/min.

Nach dem Aufschluss filtrieren Sie die aufgeschlossene Probe durch einen 100-Mikron-Filter in ein frisches 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie dann 10 Milliliter DEFAT-Nährmedium, das mit 2 % FBS angereichert ist, durch den Filter. Um die Fettzellen aus der Zellsuspension zu isolieren, zentrifugieren Sie die gefilterten Zellen zunächst eine Minute lang bei Raumtemperatur bei 100-facher g-Menge.

Während der Zentrifugation werden fünf Milliliter DCM, ergänzt mit 2 % FBS, in einem 15-Milliliter-Röhrchen hergestellt. Verwenden Sie anschließend eine 1000-Mikroliter-Pipette, um die schwimmenden Fettzellen aus dem Zentrifugenröhrchen zu ziehen, und geben Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit Medium. Schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig, um das DCM-Medium mit den Zellen zu vermischen.

Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen eine Minute lang bei Raumtemperatur bei 100 mal g. Verwenden Sie nach dem Zentrifugieren eine 18-Gauge-Nadel und eine 20-Milliliter-Spritze, um das Medium am Boden des Röhrchens zu entfernen. Geben Sie dann 10 Milliliter DCM, ergänzt mit 2%FBS, zu den Zellen und mischen Sie durch leichtes Schütteln des Röhrchens.

Zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 100 mal g für eine Minute bei Raumtemperatur. Um mit dem Plattieren zu beginnen, geben Sie 41 Milliliter DCM oder DMEM, ergänzt mit 20 % FBS, in einen 12,5-Zentimeter-Kolben. Ziehen Sie dann mit einer 200-Mikroliter-Pipette 40 Mikroliter Fettzellen auf und geben Sie sie in den Kolben.

Füllen Sie dann den Kolben mit DCM oder DMEM, ergänzt mit 20 % FBS. Es ist wichtig, dass die Zellen über das gesamte Medium verteilt sind. Stellen Sie den Kolben auf den Deckel einer runden Petrischale, um ihn flach zu halten.

Zum Schluss stellen Sie den Kolben in einen Inkubator, der auf 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius eingestellt ist, und lassen Sie ihn sieben Tage lang ungestört. Nach einer Woche Inkubation den Kolben umdrehen und auf dedifferenzierte Fettzellen prüfen. Anschließend wird das Medium abgesaugt und dann fünf Milliliter DCM oder DMEM, ergänzt mit 20 % FBS, in den Kolben gegeben.

Lassen Sie die DEFAT-Zellen nach dem Wechsel des Mediums noch eine Woche wachsen. Verwenden Sie nach einer Woche einen Zellzähler, um die Anzahl der DEFAT-Zellen zu zählen, die unter verschiedenen Zellkulturbedingungen erzeugt wurden. Dieses Bild zeigt DEFAT-Zellkolonien nach 14-tägiger Kultivierung in DMEM.

Hier sind die DEFAT-Zellen nach 14-tägiger Kultur in DCM zu sehen. In jedem Fall stellt der Maßstabsbalken 200 Mikrometer dar. Die Proliferation von DEFAT-Zellen wurde mit Hilfe eines Zellzählers quantifiziert und die Effizienz von DCM und DMEM bei der Erzeugung von DEFAT-Zellen verglichen.

Wie hier zu sehen ist, wird eine verstärkte Zellproliferation bei der Verwendung von DCM beobachtet. In dieser Arbeit wurden humane DEFAT-Zellen, die mit DCM erzeugt wurden, drei Wochen lang in den entsprechenden Induktionsmedien kultiviert, um die Redifferenzierungs- und Differenzierungsfähigkeiten von DEFAT-Zellen zu bewerten. Die Zellen zeigten sich positiv für die osteogene Kapazität durch alkalische Phosphatase-Färbung und durch Färbung mit Alizarin Red S. Schließlich wurde die adipogene Kapazität mit einer Oil Red O-Färbung nachgewiesen.

Es ist sehr, sehr wichtig sicherzustellen, dass sowohl die Kollagenase mit Rudiment als auch die Isolierung von Fettzellen mit größter Sorgfalt durchgeführt werden, um erfolgreich qualitativ hochwertige DEFAT-Zellen zu erzeugen. Durch diese Bemühungen zielt unsere validierte Zellkulturmethode darauf ab, sowohl aktuelle als auch zukünftige Forschungsbemühungen in den Bereichen Entwicklungsbiologie und regenerative Medizin zu erleichtern.