Name: Eine effiziente Methode erhalten Sie Dedifferenzierte Fettzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Erfahren Sie eine effiziente Zellkulturmethode zur Gewinnung dedifferenzierter Fettzellen (DFAT) für die regenerative Medizin. Dieses verbesserte Protokoll steigert die Zellqualität und erleichtert zukünftige Anwendungen in der Zelltherapie.

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Diese Forschung wurde teilweise unterstützt durch das Program for Creating Start-ups from Advanced Research and Technology (START-Programm) der Japan Society for the Promotion of Science (ST261006IP, TM) und durch das Program for the Strategic Research Foundation at Private Universities (2014-2019) (S1411018, TM) vom Ministerium für Bildung, Sport, Wissenschaft und Technologie.

Proben von menschlichem subkutanen Fettgewebes wurden von Patienten in der Chirurgie in der Abteilung für Plastische Chirurgie, Urologie, Kinderchirurgie und Orthopädische Chirurgie der Nihon Universität Itabashi Hospital (Tokyo, Japan) erhalten. Die Patienten gaben informierte Zustimmung geschrieben, und die Ethikkommission der Nihon University School of Medicine der Studie zugelassen. 1. Gewebepräparation <ol><li> Bringen Sie die Gewebeprobe aus dem Operationssaal zu Labor. </li><li> Wash 1-2 g Fettgewebe mit 5 ml PBS (-) bei Raumtemperatur (RT) einmal, in einem 50-ml-Röhrchen und dann die Probe in einem 10 cm Plastikschale. </li></ol> 2. Collagenaseverdau <ol><li> Entfernen der Probe aus der PBS (-), dann werden 10 ml steriler 0,1% (w / v) Lösung Kollagenase (Kollagenase Typ II) in die Schale der Gewebeprobe enthält. </li><li> Mince das Gewebe mit einer chirurgischen Schere für etwa 15 Minuten, bis er eine pürierte erreicht bestehenparenz. </li><li> Anschließend verdauen das zerkleinerte Gewebe in dem 0,1% (w / v) Kollagenase-Lösung bei 37 ° C für 30 min (60 rpm) in einem 50 ml Röhrchen unter leichtem Schütteln auf einem Schüttler. </li><li> Filtern Sie die aufgeschlossene Probe durch ein 100 um-Filter in ein 50 ml Röhrchen. Als nächstes wurden 10 ml DCM passieren mit 2% FBS durch den Filter ergänzt (siehe Tabelle der Materialien). </li></ol> 3. Zell Isolation <ol><li> Zentrifugieren der filtrierten Zellen bei 100 · g für 1 min bei RT. </li><li> An dieser Stelle vorbereiten 5 ml DCM mit 2% FBS in einer 50-ml-Tube ergänzt. </li><li> die schwimmenden Fettzellen unter Verwendung einer 1000 ul Pipette und fügen Sie die Zellen in ein 50 ml Röhrchen, das Medium Als nächstes erstellen. </li><li> Anschließend schütteln Sie die 50-ml-Röhrchen vorsichtig das DCM-Medium mit den Zellen zu mischen. </li><li> Zentrifuge dann das Rohr bei 100 × g für 1 min bei RT. </li><li> Verwerfen das Medium an der Unterseite des Rohrs eine 18 G-Nadel und einer 20 ml Spritze. </li><li> Als nächstes werden 10 ml DCM supplemented mit 2% FBS zu den gesammelten Zellen. </li><li> Mischen Sie die DCM mit den Zellen durch Schütteln des 50-ml-Röhrchen sanft. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 100 g für 1 min bei RT. </li></ol> 4. Plating Cells <ol><li> Hinzufügen 41 ml DCM oder DMEM, supplementiert mit 20% FBS auf eine 12,5 cm-Kolben. </li><li> Als nächstes wird unter Verwendung einer 200 ul Pipette 40 ul Fettzellen in den Kolben hinzufügen. </li><li> Dann füllen Sie den Kolben mit DCM oder DMEM mit 20% FBS ergänzt. Kritischste Schritt: An dieser Stelle sicher, dass die Zellen im gesamten Medium verteilt sind. Eine Sichtprüfung der abgelösten Zellen und danach den Kolben eines runden Petrischale auf dem Deckel halten es flach zu halten. </li><li> Schließlich wird der Kolben im Inkubator und lassen Sie es für 7 Tage bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator ungestört. </li><li> Nach einer Woche Inkubation kehren die Kolben und prüfen, ob DFAT Zellen. Als nächstes beurteilen Tüchtigkeit DFAT Zellgeneration wie seit fibrobl an dieser Stelle 10 beschriebenast-ähnlichen Zellen (DFAT Zellen) werden in den Regionen unterscheiden sich von Fettzellen. </li><li> 5 ml DCM oder DMEM, supplementiert mit 20% FBS in den Kolben der früheren Zellkulturmedium nach der Entfernung. Lassen Sie die DFAT Zellen für eine weitere Woche zu wachsen, nachdem das Medium verändert. </li><li> Mit Hilfe eines Zellzählers, zählen die Anzahl der DFAT unter verschiedenen Zellkulturbedingungen (DCM gegen DMEM) erzeugten Zellen. </li></ol>

<ol><li>Lanzoni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+clinical+programs+of+stem+cell+therapies+for+liver+and+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas.</a> Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).</li>
<li>de Girolamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%3A+a+new+%22cells+as+drugs%22+paradigm.+Efficacy+and+critical+aspects+in+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy.</a> Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).</li>
<li>Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+adipose+stem+cells+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">The potential of adipose stem cells in regenerative medicine.</a> Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).</li>
<li>Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+a+treatment+for+peripheral+arterial+disease%3A+current+status+and+potential+impact+of+type+II+diabetes+on+their+therapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy.</a> Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).</li>
<li>Ringden, O., Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+as+treatment+for+chronic+GVHD%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD.</a> Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).</li>
<li>Matsumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocyte-derived+dedifferentiated+fat+cells+exhibit+multilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential.</a> J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).</li>
<li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+adipose+stem+cells+through+dedifferentiation+of+mature+adipocytes+in+ceiling+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures.</a> J. Vis. Exp. (97), (2015).</li>
<li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dedifferentiating+human+mature+adipocytes+from+the+visceral+and+subcutaneous+fat+compartments%3A+fibroblast-activation+protein+alpha+and+dipeptidyl+peptidase+4+as+major+components+of+matrix+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling.</a> PLoS One. 10 (3), 0122065(2015).</li>
<li>Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeng%2C+X+%22Biomed.+Res.+Int%22">Biomed. Res. Int</a>. 2015, 673651(2015).</li>
<li>Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+properties+of+feline+dedifferentiated+fat+cells+and+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+J%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells.</a> Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).</li>
<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Ältere Adipozyten , die in vitro Dedifferenzierung, ein Verfahren bekannt , als Deckenkultur unterzogen werden , können zu einer primitiveren Phänotyp zurückkehren und proliferativen Fähigkeiten gewinnen. Diese Zellen werden als dedifferenzierte Fett (DFAT) -Zellen bezeichnet. Die multilineage Differenzierungspotential von DFAT Zellen wurde bewertet. Durchflusszytometrie Analyse und Genexpressionsanalyse ergab , dass DFAT Zellen im Vergleich zu ASCS 6 sehr homogen waren. In der Tat ist das Zelloberfl...

Die Zelltherapie und Tissue Engineering sind heiße Themen auf dem Gebiet der regenerativen Medizin 1-5. Während diese therapeutischen Modalitäten großes Versprechen halten, die derzeit einige technische Probleme, ihre klinische Anwendung behindern. In diesem Zusammenhang ist, wie bei der Erzeugung von iPS-Zellen, alle Therapien Tissue Engineering müssen Zellen frei von äußeren Gen Transduktionen produzieren, um die Sicherheit der Patienten zu gewährleisten. Dementsprechend waren wir die erste Gruppe erfolgreich menschliche DFAT Zellen produzieren 6. Mehrere andere Arbeitsgruppen haben unsere Methode , da angenommen DFAT Zellen von Säugetieren 7-9, weiter hervorheben , die Nützlichkeit unseres Modells zu generieren. Im Laufe von mehreren Studien haben wir festgestellt, dass die Qualität der Zellkulturumgebung durch Einstellen des Inhalts des Zellmediums verändert werden. Diese Erkenntnis hat zu einer Erhöhung der Erfolgsrate von DFAT Zellproduktion geführt und Zellqualität verbessert; beide kritischen Faktoren ineffizient Zellen für zukünftige klinische Studien zu generieren. In dieser Hinsicht verbesserte einer DFAT Kulturmedium (DCM, ein Medium ähnliche Zellmedium stammen mesenchymalen, die rekombinantes humanes Insulin, Serumalbumin, L-Glutaminsäure, verschiedene Fettsäuren und Cholesterin enthält) und ein Verfahren zur DFAT Zellgeneration und Proliferation wurde entwickelt (weitere Informationen über den Inhalt von DCM ist auf Anfrage erhältlich). Mit dieser Methode hohe Qualität DFAT Zellen wurden mit der Fähigkeit, erzeugt in verschiedene Zelltypen, einschließlich adipogenen, osteogenen und chondrogenen Zellen zu differenzieren. Insgesamt verbessert diese validierten Zellkultur Protokoll, um die Qualität der DFAT Zellen und kann zur Verbesserung der klinischen Anwendung der Zelltherapie und Tissue Engineering sehr nützlich sein.

<table><tbody><tr><td>CSTI303-MSC mittelgroße&nbsp;</td><td>CSTI</td><td>87-671</td><td>Dieses Medium wird im Text als DCM definiert</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td>Es enthält kein Mg2+ und Ca2+</td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum</td><td>Sigma</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ II</td><td>Sigma</td><td>C-6885</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Takasago Medical Industry Co., Ltd</td><td>TKZ-F2194-1</td><td></td></tr><tr><td>Schüttler</td><td>TAITEC</td><td>Bioshaker V.BR-36</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Sieb 100 &mu; m Gelb</td><td>CORNING LIFE SCIENCES&nbsp;</td><td>DL 352360</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 12,5 cm&sup2; Rechteckiger Zellkulturkolben mit schrägem Hals und blauem, belüftetem Schraubverschluss</td><td>CORNING LIFE SCIENCES&nbsp;</td><td></td><td></td>353107</tr><tr><td>18 G Nadel</td><td>NIPRO</td><td>02-002</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Spritze&nbsp;</td><td>NIPRO</td><td>08-753</td><td></td></tr><tr><td>Z-Serie Scharzähler</td><td>BECKMAN SCHAR</td><td>383550</td><td></td></tr></tbody></table>

eine effiziente methode erhalten sie dedifferenzierte fettzellen

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Tissue Engineering und Zelltherapie vielversprechend klinisch. In dieser Hinsicht multipotenten Zellen wie mesenchymalen Stammzellen (MSCs), können therapeutisch, in naher Zukunft wieder herzustellen Funktion geschädigte Organe verwendet. Dennoch einige technische Probleme, einschließlich der hochinvasiven Verfahren von MSCs und die Ineffizienz rund um ihre Verstärkung zu isolieren, behindern gegenwärtig die möglichen klinischen Verwendung dieser therapeutischen Modalitäten. Hierin stellen wir eine hocheffiziente Methode zur Erzeugung von dedifferenzierten Fettzellen (DFAT), MSC-ähnlichen Zellen. Interessanterweise kann DFAT Zellen in verschiedene Zelltypen, einschließlich adipogenen, osteogenen, chondrogenen Zellen und differenzieren. Obwohl andere Gruppen zuvor verschiedene Verfahren zur Erzeugung von DFAT Zellen aus reifen Fettgewebe präsentiert haben, unsere Methode ermöglicht es uns, mehr DFAT Zellen effizient zu produzieren. In dieser Hinsicht zeigen wir, dass DFAT Kulturmedium (DCM), ergänzt mit 20% FBS,ist wirksamer DFAT Zellen bei der Erzeugung als DMEM, ergänzt mit 20% FBS. Zusätzlich können die Zellen durch DFAT unserem Zellkulturverfahren hergestellt in verschiedene Gewebetypen redifferenziert werden. Als solche ein sehr interessantes und nützliches Modell für die Untersuchung von Gewebe Dedifferenzierung dargestellt.

<html> In dieser Studie wurde das Verfahren und das Toolkit für DFAT Zellgeneration verbessert (Abbildung 1). Unser Verfahren ermöglicht es uns , DFAT Zellen sowohl mit DCM und DMEM - Medium , das 20% FBS (2A) zu erzeugen. Als solche verglichen wir die Effizienz von DCM und DMEM DFAT Zellen zu erzeugen. In dieser Hinsicht verbesserte DCM DFAT Zellproliferation durch drei Mal , wenn auf DMEM verglichen, unabhängig von der Anzahl von Adipozyten (2A<...

Wir haben die Bedingungen für die DFAT-Zellerzeugung modifiziert und geben hierin Informationen über die Verwendung eines verbesserten Wachstumsmediums für die Produktion dieser Zellen.

Eine effiziente Methode erhalten Sie Dedifferenzierte Fettzellen

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Das übergeordnete Ziel dieser neuartigen Zellkulturmethode besteht darin, dedifferenzierte Fettzellen mit höherer Effizienz zu erzeugen. Unsere Methode könnte Forschern auf dem Gebiet der regenerativen Medizin helfen, zentrale Fragen zu den verschiedenen Prozessen bei der Herstellung adipogener, osteogener und chondrogener Zellen zu beantworten. Da der Hauptvorteil unseres Zellkulturprotokolls in der Verbesserung der Qualität von DEFAT-Zellen liegt, könnte es in naher Zukunft zur Optimierung bestehender Anwendungen in der Zelltherapie und Gewebeengineering eingesetzt werden.Nachdem die subkutane Fettprobe des Patienten aus dem Operationssaal ins Labor gebracht wurde, das Gewebe wiegen und eine Probe von ein bis zwei Gramm Fettgewebe in ein 15-Milliliter-Gefäß geben. Anschließend die Probe mit fünf Milliliter PBS waschen und danach in eine 10-Zentimeter-Kunststoffschale überführen. Den PBS entfernen.Gegeben Sie anschließend 10 Milliliter sterilem 0,1 % Gewicht pro Volumen Kollagenase in die Schale mit der Probe. Zerkleinern Sie das Gewebe anschließend mit einer chirurgischen Schere, bis es eine pürierartige Konsistenz erreicht hat. Überführen Sie das zerkleinerte Gewebe und die Kollagenase-Lösung in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und inkubieren Sie bei 37 °C für 30 Minuten unter Schütteln mit 60 U/min.Nach der Verdauung filtrieren Sie die verdauten Probe durch einen 100-Mikron-Filter in ein frisches 15-Milliliter-Röhrchen. Anschließend leiten Sie 10 Milliliter DEFAT-Kulturmedium, ergänzt mit 2 % FBS, durch den Filter. Um die Fettzellen aus der Zellsuspension zu isolieren, zentrifugieren Sie zunächst die filtrierten Zellen bei 100 × g für eine Minute bei Raumtemperatur.Während der Zentrifugation bereiten Sie fünf Milliliter DCM, ergänzt mit 2 % FBS, in einem 15-Milliliter-Röhrchen vor. Verwenden Sie anschließend eine 1000-Mikroliter-Pipette, um die schwimmenden Fettzellen aus dem zentrifugierten Röhrchen aufzusaugen, und geben Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das Medium enthält. Schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig, um das DCM-Medium mit den Zellen zu vermischen.Anschließend die Probe bei Raumtemperatur eine Minute lang mit 100 × g zentrifugieren. Nach der Zentrifugation das Medium am Boden des Gefäßes mit einer 18-Gauge-Nadel und einer 20-Milliliter-Spritze abziehen. Danach 10 Milliliter DCM, ergänzt mit 2 % FBS, zu den Zellen geben und durch vorsichtiges Schütteln des Gefäßes mischen.Zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 100 × g für eine Minute bei Raumtemperatur. Um mit dem Ansäen zu beginnen, geben Sie 41 Milliliter DCM oder DMEM, ergänzt mit 20 % FBS, in eine 12,5-Zentimeter-Flasche. Verwenden Sie dann eine 200-Mikroliter-Pipette, um 40 Mikroliter Fettzellen aufzusaugen, und geben Sie diese in die Flasche. Füllen Sie dann den Kolben mit DCM oder DMEM, das mit 20 % FBS ergänzt wurde. Es ist entscheidend, dass die Zellen gleichmäßig im Medium verteilt sind. Stellen Sie den Kolben auf den Deckel einer runden Petrischale, um ihn flach zu lagern.Schließlich wird der Kolben in einen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und 37 °C gestellt und sieben Tage lang ungestört gelassen. Nach einer Woche Inkubation wird der Kolben umgedreht und auf dedifferenzierte Fettzellen überprüft. Anschließend wird das Medium abgesaugt und dem Kolben fünf Milliliter DCM oder DMEM mit 20 % FBS zugesetzt.Lassen Sie die DEFAT-Zellen eine weitere Woche wachsen, nachdem das Medium gewechselt wurde. Verwenden Sie nach einer Woche einen Zellzähler, um die Anzahl der unter verschiedenen Zellkulturbedingungen generierten DEFAT-Zellen zu bestimmen. Dieses Bild zeigt DEFAT-Zellkolonien nach 14 Tagen Kultur in DMEM.Hier sind die DEFAT-Zellen nach 14 Tagen Kultur in DCM dargestellt. In jedem Fall entspricht die Maßstabsleiste 200 Mikrometern. Die Proliferation der DEFAT-Zellen wurde mithilfe eines Zellzählgeräts quantifiziert, und die Effizienz von DCM und DMEM bei der Erzeugung von DEFAT-Zellen wurde verglichen.Wie hier zu sehen ist, wird durch die Verwendung von DCM eine verbesserte Zellproliferation beobachtet. In diesem Fall wurden humane DEFAT-Zellen, die mit DCM erzeugt wurden, drei Wochen lang in geeigneten Induktionsmedien kultiviert, um die Redifferenzierung und Differenzierungsfähigkeit der DEFAT-Zellen zu bewerten. Die Zellen zeigten sich positiv für osteogene Kapazität durch die Nachfärbung mit alkalischer Phosphatase und mit Alizarinrot S. Schließlich wurde die adipogene Kapazität mittels Oil-Red-O-Färbung nachgewiesen.Es ist äußerst wichtig sicherzustellen, dass die Kollagenasebehandlung mit dem Keim und die Fettzellisolierung beide mit größter Sorgfalt durchgeführt werden, um hochwertige DEFAT-Zellen erfolgreich zu erzeugen. Mit diesen Maßnahmen zielt unsere validierte Zellkulturmethode darauf ab, sowohl aktuelle als auch zukünftige Forschungsvorhaben in den Bereichen Entwicklungsbiologie und regenerative Medizin zu unterstützen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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