Kontinuierliche Hochauflösende mikroskopische Beobachtung Replikative Aging in Bäckerhefe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einzelne Haplo-Hefezellen während ihrer gesamten replikativen Lebensdauer zu verfolgen. Der erste Schritt besteht darin, einen mikrofluidischen Chip herzustellen, der ein Array von Mikropads enthält. Als nächstes werden die Hefezellen in den mikrofluidischen Chip geladen, und da der Bereich unter den Mikropads eine Höhe hat, die dem Durchmesser einer Hefezelle entspricht, setzen sich die Zellen dort an.

Anschließend wird ein kontinuierlicher Fluss von frischem Medium über die eingeschlossenen Hefezellen aufgebracht, und die entstehenden Tochterzellen werden durch den Fluss von Medium Hellfeld und Fluoreszenz weggespült. Die Mikroskopie wird verwendet, um Veränderungen in der Zell- oder Organellenmorphologie, der Proteinexpression und der Proteinlokalisierung sichtbar zu machen, die in alternden Hefezellen auftreten können. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der klassischen Mikrodissektionsmethode besteht darin, dass sie weniger arbeitsintensiv ist und langfristige kontinuierliche mikroskopische Bilder der gesamten Lebensdauer einzelner Hefezellen ermöglicht.

Obwohl diese Methode Einblicke in das replikative Altern geben kann, kann sie auch für Studien verwendet werden, die eine kontinuierliche mikroskopische Beobachtung über längere Zeiträume erfordern. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da bei bestimmten Schritten der Herstellung des Mikro-Feic-Chips Vorsicht geboten ist. Darüber hinaus kann das Laden der Zellen in den Micro-Feic-Chip etwas Erfahrung erfordern.

Die Silizium-Wafer-Form wird durch Softlithographie hergestellt. Einzelheiten zur Herstellung sind dem beigefügten Protokoll zu entnehmen. Text Schneiden Sie ein Stück hartes Etikett in dünne Streifen von etwa 0,5 Millimetern x drei Millimetern.

Legen Sie die Streifen vorsichtig mit einem Skalpell auf die Silikonwaferform, leicht auf der Kanalstruktur zwischen den Einlaufkanälen und dem Micropadre. Decken Sie als nächstes eine Petrischale aus Glas mit einer doppelten Schicht Aluminiumfolie ab und legen Sie die Waffel in die Petrischale. Die Aluminiumfolie verhindert, dass PDMS während der Herstellung der mikrofluidischen Chips zwischen dem Wafer und der Petrischale verläuft.

Um mit der Herstellung von Mikrofluidik-Chips zu beginnen, stellen Sie einen leeren Plastikbecher auf die Waage und zerreißen Sie die Waage. Gießen Sie 40 Gramm PDMS-Basis in den Plastikbecher. Geben Sie PDMS-Härter in einem Gewichtsverhältnis von eins zu 10 zu, was in diesem Fall etwa vier Milliliter entspricht.

Mit der Einweg-Kunststoffpipette, die mehrere Minuten lang gründlich gemischt wird, ist es wichtig, dass die Mischung gut gemischt wird, um später eine ordnungsgemäße Polymerisation des PDMS zu gewährleisten. Gießen Sie das PDMS auf den Wafer in der gläsernen Petrischale. Das PDMS-Gemisch in der Petrischale enthält viele Blasen für Degas.

Das PDMS legt die Petrischale für ca. 30 Minuten in ein Trockenmittel, das mit einer Vakuumpumpe verbunden ist, wenn alle Blasen entfernt wurden. Polymerisieren Sie das PDMS, indem Sie die Petrischale mit dem Wafer eine Stunde lang bei 120 Grad Celsius auf eine heiße Platte legen, gefolgt von 65 Grad Celsius für eine weitere Stunde. Entfernen Sie nach den zwei Stunden den Aluminiumfolienwafer und das polymerisierte PDMS aus der Petrischale aus Glas.

Ziehen Sie die Aluminiumfolie von der Rückseite des Wafers in PDMS ab. Heben Sie dann vorsichtig die PDMS-Schicht von der Oberseite des Wafers ab. Legen Sie die PDMS-Schicht kopfüber mit den Kanälen nach oben auf die Bank und schneiden Sie die auf dem PDMS aufgedruckten Single-Chip-Designs vorsichtig mit dem Skalpell aus.

Versuchen Sie, etwa drei Millimeter PDMS an den Rändern der Kanäle zu halten. Der nächste Schritt besteht darin, Löcher in das PDMS an den Enden des Einlasses und des Seitenkanals zu stanzen, wie in diesem Diagramm dargestellt. Um ein Loch zu stanzen, schieben Sie einen 20-Gauge-Köderstummel gerade durch das PDMS.

Entfernen Sie die PDMS-Säule im Köderstummel, bevor Sie den Stummel herausziehen. Auch dies verhindert, dass die PDMS-Spalte das neu gestanzte Loch blockiert. Sobald alle Löcher gestanzt sind, reinigen Sie die Oberflächen des Chips von Staubpartikeln und PDMS-Resten, indem Sie Klebeband darauf legen und das Klebeband sofort entfernen.

Reinigen Sie auf ähnliche Weise das Deckglas, an dem der Chip befestigt werden soll. Legen Sie den Chip und das Deckglas unter die UV-Lampe eines UV-Ozonreinigers, wobei die Seiten, die miteinander verbunden werden müssen, sechs bis acht Minuten lang der Lampe zugewandt sind, die dem UV-Licht ausgesetzt ist, und legen Sie die freiliegenden Oberflächen übereinander. Klopfen Sie vorsichtig an den Seiten des Chips, um die Befestigung des PDMS am Deckglas zu fördern und Luftblasen zu entfernen.

Klopfen Sie nicht auf die Oberseite der Kanalstruktur, da dies dazu führen kann, dass die Mikropads an der Abdeckung befestigt werden. Auch Glas. Stellen Sie den neu hergestellten mikrofluidischen Aufbau für eine Stunde bei 100 Grad Celsius auf eine heiße Platte.

Überprüfen Sie anschließend die Verklebung des Deckglases mit dem PDMS-Chip, indem Sie die Kanten des PDMS-Chips leicht anheben. Ist dies nicht möglich, ist die Verklebung erfolgreich und der Chip einsatzbereit. Um den mikrofluidischen Chip für die Zellbeladung vorzubereiten, platzieren Sie den Chip in dem Metallhalter mit Silikongel zwischen dem Glas des Chips und den Metallteilen des Halters.

Um eine wasserdichte Abdichtung zu erzielen, schrauben Sie die Muttern vorsichtig fest, um ein Zerbrechen des Glases zu vermeiden. Verbinden Sie dünne Rohre mit dem Seitenkanal und dem Auslasskanal des Chips. Die Verwendung einer Pinzette erleichtert das Einführen des Schlauchs in die gestanzten Löcher.

Füllen Sie eine 50-Milliliter-Köderverschlussspritze mit Nährmedium. Entfernen Sie die Luft aus der Spritze und schließen Sie sie nacheinander an eine Spritze an. Filtrieren Sie einen 20-Gauge-Köderstummel, einen kurzen, dicken Schlauch und einen dünnen Schlauch.

Legen Sie die Spritze in die Spritzenpumpe und spulen Sie die Pumpe vor, bis der dünne Schlauch vollständig mit Medium gefüllt ist. Schieben Sie den dünnen Schlauch, der mit der Spritze verbunden ist, in den Einlasskanal der Spritze und lassen Sie das Medium mit einer Geschwindigkeit von 10 Mikrolitern pro Minute durch den Chip fließen. Sammeln Sie das Medium, das den Chip in einer Petrischale zurücklässt.

Über den Seitenkanal läuft das Medium aus. Wegen des Widerstandsunterschieds zwischen dem großen, robusten Seitenkanal und dem Auslasskanal. Platzieren Sie den Chip auf dem Mikroskoptisch und stellen Sie den Fokus des Mikroskops auf die Pads.

Um diesen Vorgang zu starten, verbinden Sie eine Fünf-Milliliter-Köderspitzenspritze mit einem 20-Gauge-Köderstummel und einem dicken Schlauch. Laden Sie die Spritze mit etwa einem Milliliter der Zellsuspension, die in den Chip geladen werden soll. Die bevorzugte Zellzahl für die Beladung liegt zwischen einer und fünf mal 10 der sechs Zellen pro Milliliter.

Verringern Sie die Durchflussmenge der Spritzenpumpe auf 0,5 Mikroliter pro Minute. Der schwierigste Teil dieses Verfahrens ist das Laden der Zellen in den Mikrome-Chip. Dies erfordert in der Regel etwas Übung.

Verbinden Sie die Spritze mit der Zellsuspension mit dem Schlauch des Auslasskanals. Laden Sie die Zellen, indem Sie auf den Kolben der Spritze drücken. Beobachten Sie vorsichtig mit dem Okular oder dem Computerbildschirm, wie die Zellen eindringen und sich unter den Mikropads absetzen.

Halten Sie den Druck auf den Kolben aufrecht, bis sich genügend Zellen unter den Pads abgesetzt haben. Die optimale Belastung liegt bei ein bis drei Zellen pro Pad. Trennen Sie die Spritze, die zum Laden der Zellen verwendet wurde, und spülen Sie den Seitenkanal einige Minuten lang mit höheren Durchflussraten, um Luftblasen und/oder Zellen zu entfernen, die den Chip noch nicht verlassen haben.

Verringern Sie den Durchfluss der Spritzenpumpe wieder auf 0,5 Mikroliter pro Minute und schließen Sie den Seitenkanal, indem Sie ihn an einen dicken Schlauch anschließen, an dessen Ende sich ein Katheterstopfen befindet. Erhöhen Sie den Durchfluss der Spritzenpumpe auf eine endgültige Durchflussrate von ein bis fünf Mikrolitern pro Minute. Die Durchflussraten können je nach Medium und Hefestamm variieren.

Starten Sie einen Film mit der Mikroskop- und Kameraeinstellung, die für das Ziel des Experiments geeignet ist. Dies ist ein Beispiel für einen Zeitrafferfilm einer einzelnen Wildtyp-E-Zelle, die auf YPD wächst. Mittlere Bilder wurden alle 10 Minuten aufgenommen, und der gerade gezeigte Maßstabsbalken stellt fünf Mikrometer dar.

Die Zelle produziert insgesamt 30 Knospen, bevor sie stirbt. Die replikative Lebensdauer kann bestimmt werden, indem die Anzahl der Knospen gezählt wird, die von einer einzelnen Mutterzelle produziert werden. Diese Daten werden in eine Lebensdauerkurve umgewandelt, indem der Prozentsatz lebensfähiger Zellen gegen die Anzahl der produzierten Knospen oder die Anzahl der Generationen aufgetragen wird.

Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für Lebensdauerkurven, die für einen Wildtyp-Hefestamm und zwei mutierte Stämme erhalten wurden. Die Deletion des SER two-Gens führt zu einer kürzeren Lebensdauer, während die Deletion des FOB-One-Gens zu einer längeren Lebensdauer führt. Die mitochondriale Morphologie als Funktion des Alters kann mit dem mikrofluidischen Gerät untersucht werden.

Ein Alterungsexperiment wurde mit BY 7 42 Wildtyp-Hefezellen durchgeführt, die ILV 3G FP exprimieren, das auf die Mitochondrien abzielt. In dieser Abbildung ist ein repräsentatives Beispiel für altersbedingte Veränderungen der mitochondrialen Morphologie in einer einzelnen Zelle durch den weißen Pfeil dargestellt. Alle Bilder sind identisch skaliert und der Maßstabsbalken stellt fünf Mikrometer dar.

Der zweite Zeitrafferfilm zeigt eine einzelne Zelle, die ILV 3G FP exprimiert, aus dem Experiment, bei dem die mitochondriale Morphologie als Funktion des Alters beobachtet wurde. Die Bilder wurden alle 30 Minuten aufgenommen, und der Maßstabsbalken stellt fünf Mikrometer dar. Diese letzte Abbildung zeigt die mitochondrialen Morphologien, die in der gleichen Gruppe von Zellen in unterschiedlichem replikativen Alter beobachtet wurden, bevor sie nach 10 Knospen und vor dem Tod ihre erste Knospe produzierten.

Ein Beispielbild jeder Morphologieklasse ist enthalten: röhrenförmig, fragmentiert röhrenförmig sowie Flecken und große Flecken. Die morphologischen Veränderungen, die bei Zellen mittleren Alters beobachtet werden, ähneln denen, die zuvor berichtet wurden, indem die Zellen bei der Teilung kontinuierlich überwacht werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der replikativen Alterung von Hefen zu beantworten, z. B. warum eine Hefezelle altert, welche phänotypischen Veränderungen stattfinden und wie diese die replikative Lebensdauer der Hefe beeinflussen.

Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie wissen, wie Sie Ihre eigenen Mikrochips herstellen und die replikative Alterung in Zellen mit praktisch jedem Fluoreszenzmikroskop untersuchen können.