Kontinuierliche Hochauflösende mikroskopische Beobachtung Replikative Aging in Bäckerhefe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einzelne haploide Hefe-Zellen während ihrer gesamten reproduktiven Lebensdauer zu verfolgen. Der erste Schritt besteht darin, einen mikrofluidischen Chip mit einem Array aus Mikro-Pads herzustellen. Anschließend werden die Hefe-Zellen in den mikrofluidischen Chip geladen, und da der Bereich unterhalb der Mikro-Pads eine Höhe aufweist, die dem Durchmesser einer Hefe-Zelle ähnelt, sammeln sich die Zellen dort an.

Anschließend wird ein kontinuierlicher Strom frischen Mediums über die eingefangenen Hefezellen geleitet, und die entstehenden Tochterzellen werden durch den Mediumstrom abgespült, wobei Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, um Veränderungen in der Zell- oder Organellenmorphologie, der Proteinausprägung und der Proteinlokalisation zu visualisieren, die während des Alterns von Hefezellen auftreten können. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der klassischen Mikrodissektionsmethode liegt darin, dass sie weniger arbeitsintensiv ist und langfristige, kontinuierliche mikroskopische Aufnahmen über die gesamte Lebensdauer einzelner Hefezellen ermöglicht.

Obwohl diese Methode Einblicke in das replikative Altern ermöglicht, kann sie auch für Studien verwendet werden, die eine kontinuierliche mikroskopische Beobachtung über längere Zeiträume erfordern. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da bei bestimmten Schritten der Herstellung des Micro feic-Chips besondere Sorgfalt erforderlich ist. Außerdem kann das Beladen der Zellen in den Micro feic-Chip etwas Erfahrung erfordern.

Die Siliziumwafer-Form wird mittels weicher Lithografie hergestellt. Für Einzelheiten zur Herstellung siehe das begleitende Protokoll. Schneiden Sie ein Stück strapazierfähiges Etikett in dünne Streifen von etwa 0,5 Millimetern mal drei Millimetern.

Platzieren Sie die Streifen mit einem Skalpell vorsichtig auf der Siliziumwafer-Form leicht oberhalb der Kanalstruktur zwischen den Zuführungskanälen und dem Mikro-„padre“. Bedecken Sie anschließend eine Glaspetrischale mit einer doppelten Schicht Aluminiumfolie und stellen Sie den Wafer in die Petrischale. Die Aluminiumfolie verhindert, dass PDMS während der Herstellung der mikrofluidischen Chips zwischen Wafer und Petrischale fließt.

Um mit der Herstellung von mikrofluidischen Chips zu beginnen, stellen Sie eine leere Plastikschale auf die Waage und tarieren Sie die Waage. Geben Sie 40 Gramm PDMS-Grundmasse in die Plastikschale. Fügen Sie PDMS-Härter im Gewichtsverhältnis von eins zu 10 hinzu, was in diesem Fall etwa vier Milliliter entspricht.

Mit der Einweg-Kunststoffpipette mehrere Minuten gründlich vermischen; es ist wichtig, dass die Mischung gut homogenisiert wird, um eine ordnungsgemäße Polymerisation des PDMS später zu gewährleisten. Das PDMS auf dem Wafer in der Glas-Petri-Schale verteilen. Die PDMS-Mischung in der Petri-Schale enthält viele Blasen, die entgast werden müssen.

Platzieren Sie die PDMS-Schicht zusammen mit der Petrischale in einem mit einer Vakuumpumpe verbundenen Exsikkator für etwa 30 Minuten, bis alle Blasen entfernt sind. Polymerisieren Sie die PDMS, indem Sie die Petrischale mit dem Wafer auf eine Heizplatte bei 120 Grad Celsius für eine Stunde und anschließend bei 65 Grad Celsius für eine weitere Stunde stellen. Entfernen Sie nach den zwei Stunden das Aluminiumfolien-Wafer und die polymerisierte PDMS vorsichtig aus der Glas-Petrischale.

Lösen Sie die Aluminiumfolie von der Rückseite des Wafers vorsichtig vom PDMS ab. Heben Sie danach die PDMS-Schicht vorsichtig von der Oberseite des Wafers ab. Legen Sie die PDMS-Schicht mit der Kanalseite nach oben auf den Laborplatz und schneiden Sie die einzelnen auf dem PDMS eingeprägten Chip-Designs vorsichtig mit dem Skalpell aus.

Versuchen Sie, etwa drei Millimeter PDMS an den Rändern der Kanäle beizubehalten. Der nächste Schritt besteht darin, Löcher in das PDMS an den Enden des Einlass-, Auslass- und Seitenkanals zu stanzen, wie in diesem Diagramm dargestellt. Um ein Loch zu stanzen, drücken Sie eine 20-Gauge-Lure-Spitze geradlinig vollständig durch das PDMS.

Entfernen Sie die PDMS-Säule im Lockstoff-Stummel, bevor Sie den Stummel herausziehen. Auch dies verhindert, dass die PDMS-Säule das neu gestanzte Loch blockiert. Sobald alle Löcher gestanzt wurden, reinigen Sie die Oberflächen des Chips von Staubpartikeln und restlichem PDMS, indem Sie Klebeband darauf platzieren und sofort wieder entfernen.

Reinigen Sie auf die gleiche Weise das Deckglas, an das der Chip befestigt wird. Platzieren Sie den Chip und das Deckglas unter die UV-Lampe eines UV-Ozon-Reinigers auf Tischhöhe, wobei die Seiten, die miteinander verbunden werden sollen, zur Lampe hin ausgerichtet und sechs bis acht Minuten lang UV-Licht ausgesetzt werden. Legen Sie anschließend die behandelten Oberflächen aufeinander. Klopfen Sie vorsichtig um die Ränder des Chips herum, um die Haftung von PDMS an das Deckglas zu fördern und eventuelle Luftblasen zu entfernen.

Klopfen Sie nicht auf die Kanalstruktur, da dies dazu führen kann, dass die Mikropads an der Abdeckung haften bleiben. Auch Glas. Stellen Sie die neu hergestellte mikrofluidische Anordnung eine Stunde lang auf eine Heizplatte bei 100 Grad Celsius.

Überprüfen Sie anschließend die Verbindung zwischen Deckglas und PDMS-Chip, indem Sie leicht an den Rändern des PDMS-Chips anheben. Ist dies nicht möglich, ist die Verbindung erfolgreich und der Chip ist betriebsbereit. Um den mikrofluidischen Chip für das Beladen mit Zellen vorzubereiten, platzieren Sie den Chip in der Metallhalterung mit Silikongel zwischen dem Glas des Chips und den metallischen Teilen der Halterung.

Um eine wasserdichte Abdichtung zu erzielen, die Muttern vorsichtig zuschrauben, um das Glas nicht zu beschädigen. Dünne Schläuche mit dem Seitenkanal und dem Auslasskanal des Chips verbinden. Die Verwendung von Pinzetten erleichtert das Einsetzen der Schläuche in die gestanzten Löcher.

Füllen Sie eine 50-Milliliter-Lure-Lock-Spritze mit Kulturmedium. Entfernen Sie die Luft aus der Spritze und verbinden Sie sie nacheinander mit einer Spritze. Filtern Sie über eine 20-Gauge-Lure-Kanüle, ein kurzes dickes Rohr und ein dünnes Rohr.

Platzieren Sie die Spritze in der Spritzenpumpe und fahren Sie die Pumpe vor, bis der dünne Schlauch vollständig mit Medium gefüllt ist. Stecken Sie den mit der Spritze verbundenen dünnen Schlauch in den Einlasskanal des Chips und lassen Sie das Medium mit einer Geschwindigkeit von 10 Mikrolitern pro Minute durch den Chip fließen. Sammeln Sie das Medium, das den Chip verlässt, in einer Petrischale.

Das Medium fließt über den Seitenkanal ab. Aufgrund des Widerstandsunterschieds zwischen dem seitlich angebrachten, großflächigen, robusten Markierungskanal und dem Auslasskanal. Stellen Sie den Chip auf den Mikroskoptisch und fokussieren Sie das Mikroskop auf die Pads.

Um dieses Verfahren zu beginnen, verbinden Sie eine 5-Milliliter-Luer-Spitzen-Spritze mit einem 20-Gauge-Luer-Stutzen und einem dicken Schlauch. Befüllen Sie die Spritze mit etwa einem Milliliter der Zellsuspension, die in den Chip geladen werden soll. Die empfohlene Zellanzahl zum Beladen liegt zwischen 1 und 5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter.

Verringern Sie die Flussrate der Spritzenpumpe auf 0,5 µL pro Minute. Der schwierigste Teil dieses Verfahrens ist das Befüllen der Zellen in den Mikrome-Chip. Dies erfordert normalerweise etwas Übung.

Verbinden Sie die Spritze, die die Zellsuspension enthält, mit dem Schlauch des Auslasskanals. Laden Sie die Zellen, indem Sie den Kolben der Spritze vorsichtig betätigen. Beobachten Sie sanft das Eintreten und das Unter den Mikrokissen zum Liegen kommen der Zellen über das Okular oder den Computerschirm.

Üben Sie Druck auf den Kolben aus, bis ausreichend Zellen unterhalb der Pads abgesetzt haben. Die optimale Beladung beträgt ein bis drei Zellen pro Pad. Trennen Sie die für die Zellbeladung verwendete Spritze und spülen Sie den Seitenkanal einige Minuten lang mit höheren Flussraten, um Luftblasen und Zellen, die den Chip noch nicht verlassen haben, zu entfernen.

Verringern Sie den Fluss der Spritzenpumpe erneut auf 0,5 Mikroliter pro Minute und verschließen Sie den Seitenkanal, indem Sie ihn mit einem dicken Schlauch verbinden, der an seinem Ende einen Katheterstopfen enthält. Erhöhen Sie den Fluss der Spritzenpumpe auf eine endgültige Flussrate von ein bis fünf Mikroliter pro Minute. Die Flussraten können je nach Medium und Hefe-Stamm variieren.

Starten Sie eine Aufnahme mit dem Mikroskop und den Kameraeinstellungen, die für das Ziel des Experiments geeignet sind. Dies ist ein Beispiel für einen Zeitraffervideo einer einzelnen wildtypischen E-Zelle, die auf YPD wächst. Mittlere Bilder wurden alle 10 Minuten aufgenommen, und die angezeigte Maßstabsleiste entspricht fünf Mikrometern.

Die Zelle bildet insgesamt 30 Auswüchse, bevor sie abstirbt. Die replikative Lebensdauer kann bestimmt werden, indem man die Anzahl der von einer einzelnen Mutterzelle gebildeten Auswüchse zählt. Diese Daten werden in eine Lebensdauer-Kurve umgewandelt, indem der Prozentsatz der lebensfähigen Zellen gegen die Anzahl der gebildeten Auswüchse oder die Anzahl der Generationen aufgetragen wird.

Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für Lebensdauerkurven, die für einen Wildtyp-Hefestamm und zwei Mutantenstämme erhalten wurden. Die Deletion des SER-two-Gens führt zu einer kürzeren Lebensdauer, während die Deletion des FOB-one-Gens zu einer längeren Lebensdauer führt. Die mitochondriale Morphologie in Abhängigkeit vom Alter kann mithilfe der Mikrofluidikvorrichtung untersucht werden.

Ein Alternsexperiment wurde mit Wildtyp-Hefezellen des Stammes BY 7 42 durchgeführt, die ILV 3G FP exprimieren, ein Protein, das für die Mitochondrien bestimmt ist. In dieser Abbildung ist ein repräsentatives Beispiel altersassoziiierter Veränderungen der mitochondrialen Morphologie in einer einzelnen Zelle durch den weißen Pfeil markiert. Alle Bilder sind identisch skaliert, und die Maßstabsleiste entspricht fünf Mikrometern.

Der zweite Zeitrafferfilm zeigt eine einzelne Zelle, die ILV-3G-FP aus dem Experiment exprimiert, in dem die mitochondriale Morphologie in Abhängigkeit vom Alter beobachtet wurde. Die Aufnahmen wurden alle 30 Minuten angefertigt, und die Maßstabsleiste entspricht fünf Mikrometern. Diese letzte Abbildung zeigt die beobachteten mitochondrialen Morphologien in derselben Zellpopulation zu unterschiedlichen reproduktiven Alterungsstadien vor der Bildung ihrer ersten Knospe, nach 10 Knospen und vor dem Zelltod.

Ein Beispielbild jeder Morphologieklasse ist enthalten: tubulär, fragmentiert tubulär, sowie Flecken und große Flecken. Die bei mittelalterigen Zellen beobachteten Morphologieveränderungen ähneln jenen, die zuvor beschrieben wurden. Durch die kontinuierliche Beobachtung von Zellen während ihrer Teilung kann diese Methode helfen, zentrale Fragen im Bereich der replikativen Alterung von Hefe zu beantworten: Warum altert eine Hefezelle? Welche phänotypischen Veränderungen laufen dabei ab? Und wie beeinflussen diese die replikative Lebensdauer der Hefe?

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie wissen, wie man eigene Mikrochips herstellt und die replikative Alterung von Zellen mithilfe im Wesentlichen jedes fluoreszierenden Mikroskops untersucht.