High-Throughput-Assay Verzuckerung für Lignocellulose-Materialien

Hallo, ich bin Kara Ted, ich bin Leo. Geh ich. Und ich bin Simon McQueen Mason.

Die Verdaulichkeit pflanzlicher Biomasse ist derzeit ein Thema von großem Interesse. Das liegt daran, dass in den Polysacchariden der pflanzlichen Zellwände, aus denen diese Biomasse besteht, eine Menge Zucker gebunden ist, und wenn wir diese Zucker in verwertbarer Form herausholen können, können wir sie fermentieren, um alle Arten von Produkten wie Kraftstoffe und Chemikalien herzustellen. Leider sind diese Materialien extrem schwer zu verdauen, und es ist dringend erforderlich, ein besseres Verständnis dafür zu erlangen, was diese Verdaulichkeit steuert.

Um also Pflanzenmaterial für die Produktion von Erneuerungsgruppen verwenden zu können, müssen wir in der Lage sein, das Verifizierungspotenzial in diesen Pflanzen zu messen. Hier an der University of York untersuchen wir daher große Populationen von Pflanzenmaterial, um ihr Fiktionspotenzial zu bestimmen. Unter Fiktion versteht man den Prozess, bei dem komplexe Kohlenhydrate in ihre Monosaccharidbestandteile zerlegt werden, um über verschiedene industrielle Prozesse wertvolle Chemikalien herzustellen.

Um das Fiktionspotenzial zu messen, reproduzieren wir industrielle Prozesse auf Mikroebene, wobei wir Biomasse einer Vorbehandlung und Enzymhydrolyse unterziehen, um die freigesetzten Zucker zu bestimmen. Dies identifiziert interessante Varietäten in den Genotypen. Das Hochdurchsatzsystem arbeitet in einem IG-Sechs-Well-Plattenformat.

Milde Hydrolysebedingungen werden verwendet, um feine Unterschiede zwischen den Genotypen aufzudecken, und es ist auch flexibel genug, um verschiedene Substratmaterialien zu unterstützen und verschiedene Enzyme zu bewerten. Bei der von uns verwendeten Methode wird Pflanzenmaterial als Pulver formatiert, das dann 20 Minuten lang mit einer verdünnten Säure oder Lauge bei 90 Grad vorbehandelt wird. Als nächstes wird ein Enzymaufschluss mit einer handelsüblichen Cellulasemischung bei 50 Grad für acht Stunden durchgeführt.

Schließlich wird eine MBTH-Methode verwendet, um die Freisetzung von reduzierenden Zuckern zu bestimmen. Das Pflanzenmaterial wird in Form von trockenen Stängeln geerntet, die in vier Millimeter große Segmente geschnitten werden. Diese werden zusammen mit drei fünf Millimeter großen Metallkugeln in zwei Milliliter-Fläschchen gegeben.

Die Fläschchen sind individuell mit Barcodes beschriftet, die gescannt werden, um die Rückverfolgbarkeit der Proben zu gewährleisten. Die Proben werden in die Schleif- und Formatierungsroboter in den Robotern geladen. Die Proben werden automatisch gemahlen und gemischt, um die Abgabe der Biomasse in eine 96-Well-Platte zu ermöglichen.

Die Fläschchen werden durchstochen, dann wird das Fläschchen im Roboterarm neu positioniert, so dass es in einem Trichter sitzt, der vibriert, um das Pulver abzugeben. Die Vibration des Trichters wird durch eine Waage reguliert, um die Zielmenge an Masse pro abgegebenem Bohrloch zu erreichen. Die Biomasse wird in 10 Säulen der Platten abgegeben, so dass zwei Säulen für die Standards übrig bleiben.

Durch vier Wiederholungen pro Probe laden wir 20 Proben pro Platte. Das Hydrolysat dieser Platte wird in PCR-Platten verdreifacht, was zu drei optischen Platten führt. Auf diese Weise haben wir drei Bestimmungen von reduzierenden Zuckern pro Brunnen Biomasse.

Nach dem Formatieren werden die Platten mit einer Silikonmatte versiegelt, um ein Verdampfen zu vermeiden. Wenn sie fertig sind, werden sie zum Liquid-Handling-Roboter transportiert. Im Liquid Handling erfolgen automatisch die Robotervorbehandlung, die Enzymhydrolyse und die Bestimmung des freigesetzten Zuckers.

Der zwei Meter lange Tisch verfügt über Behälter für die verschiedenen benötigten Reagenzien sowie Stauraum für die Kunststoffwaren. Es gibt Inkubatoren für die Vorbehandlung und Hydrolyse, sowie Thermocycler für die Zuckerbestimmung. Die Vorbehandlung erfolgt in der Deep-Well-Platte.

Durch Zugabe von verdünnten sauren oder alkalischen Lösungen zum Biomassepulver. Die Platten werden in den Heizblock überführt und 20 Minuten lang bei 90 Grad inkubiert. Wenn diese Inkubation beendet ist, wird die Vorbehandlung durch fünfmaliges Spülen mit 500 Mikrolitern Acetatpuffer entfernt.

Sobald die Vorbehandlung gespült ist, wird ein Enzymcocktail hinzugefügt. Es ist eine Standardmischung. Es enthält Cellulose, ein Novozym 1,8 8 in einem Verhältnis von vier zu eins in einer Konzentration von sieben FPU pro Well.

Die Platten werden acht Stunden lang bei 50 Grad unter Schütteln inkubiert. 75 Mikroliter des resultierenden Hydrolysats werden auf eine PCR-Platte übertragen. In den Spalten 11 und 12 der PCR-Platten werden die Glukosestandards zugegeben.

Als nächstes werden 25 Mikroliter eines Molaren Natriumhydroxid in alle Vertiefungen gegeben. Schließlich werden 50 Mikroliter MBTH-Reagenz in die PCR-Platte pipettiert. Die Deep-Well-Platte wird nach Abschluss des Transfers des Hydrolysats auf die dritte PCR-Platte gelagert.

Während die PCR-Platten zur Inkubation bei 60 Grad für 15 Minuten in die Thermocycler gebracht werden. Der letzte Schritt des Prozesses ist die Übertragung des Reaktionsgemisches auf optische Platten zur Entwicklung der Farbe. Nach der Inkubation werden die PCR-Platten aus dem Thermocycler entnommen.

Hundert Mikroliter oxidierendes Reagenz werden dem übertragenen Reaktionsgemisch zugesetzt. Um die Farbentwicklung zu erleichtern, wird der Liquid-Handling-Prozess viermal in 24 Stunden durchgeführt, wobei die Vorbehandlungsspülung, eine Zugabe von Enzymen, etwa zwei Stunden dauert. Die Enzymhydrolyse dauert acht Stunden, die Zuckerbestimmung weitere zwei Stunden.

Während die erste Platte acht Stunden lang inkubiert, beginnt die nächste Platte den Prozess. Mit dieser Allokation von Roboterressourcen wird eine dreimalige Einlagerung von 80 Proben pro Tag erreicht, um die Menge des freigesetzten reduzierenden Zuckers zu bestimmen. Die optischen Platten sind mit 620 Nanometern ausgelegt.

Die erzielten Ergebnisse werden analysiert, um die Freisetzungszucker als Nanomol pro Milligramm pro Reaktionsstunde zu quantifizieren. Vielen Dank fürs Zuschauen, und ich hoffe, dass dies Ihre Forschung im Bereich Biokraftstoffe inspiriert.