Name: Eine einfache Methode für Pflanzen Polysomen Profilieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Lernen Sie eine einfache Methode zur Isolierung von Polysomen und Monosomen aus Pflanzengeweben zur Analyse aktiv übersetzter mRNAs. Dieses Protokoll demonstriert die Anwendung an Arabidopsis thaliana-Sämlingen.

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Diese Arbeit wurde von der Französisch nationalen Forschungsagentur (ANR-14-CE02-0010) unterstützt. Wir danken Dr. Benjamin Field und Dr. Elodie Lanet für das kritische Lesen des Manuskripts. Wir danken Herrn Michel Terese für seine Hilfe bei Videobearbeitung.

1. Herstellung von 20 bis 50% (w / v) Saccharosegradienten Anmerkung: Die Gradienten sind aus 4 Schichten von Saccharose (50%, 35% und 2 Schichten aus 20%) in 13,2 ml Ultrazentrifugenröhrchen. Unserer Erfahrung nach in zwei getrennten Schichten, die die 20% Saccharose Gießen verbessert die Qualität der Polysoms Zubereitungen. <ol><li> Bereiten Sie die Stammlösungen. Stellen Sie sicher, dass alle Lösungen RNAse und DNAse frei. <ol><li> Bereiten 10X Salzlösung: 400 mM Tris-HCl pH 8,4, 200 mM KCl und 100 mM MgCl 2. </li><li> Bereiten Sie 2 M Saccharose-Lösung: Für 200 ml, lösen sich 137 g Saccharose in 1X Salzlösung. </li></ol></li><li> Verdünnen Sie die Saccharose-Lösung in Salzlösung, wie in Tabelle 1 beschrieben, um die Steigungen vorzubereiten. Die Volumina beziehen sich auf sechs Steigungen. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Endgültige Saccharosekonzentration </td><td> Sucrose 2M (ml) </td><td> Salzlösung 1X (ml) </td><td> Finale Vol. (ml) </td></tr><tr><td> 50% </td><td> 8.8 </td><td> 3.2 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 35% </td><td> 12.9 </td><td> 12.1 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20% </td><td> 7.4 </td><td> 17.6 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20% </td><td> 5.8 </td><td> 14.2 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Verdünnungen der Saccharose - Lösung sechs Steigungen vorzubereiten. <ol start="3"><li> Gießen Sie die Schichten gemäß Tabelle 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sucrose Schicht </td><td> 50% </td><td> 35% </td><td> 20% </td><td> 20% </td></tr><tr><td> Vol. (Ml) </td><td> 1,85 </td><td> 3,65 </td><td> 3.65 </td><td> 1,35 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Volumen von Saccharoselösung pro Schicht. <ol start="4"><li> Nach jeder Schicht Gießen, halten Sie die Röhrchen in einem -40 ° C oder -80 ° C Gefrierschrank bis zur vollständigen Einfrieren, bevor die nächste Schicht Saccharose Zugabe. Das Einfrieren ist in der Regel nach 2 Stunden bei -40 ° C erreicht, sondern warten etwa 6 Stunden, bevor die nächste Schicht wird empfohlen, zu gießen. Die letzten 20% Schicht kann frisch des Experiments am Tag eingefroren oder hinzugefügt werden. Hinweis: jede Schicht Einfrieren bevor Sie die nächste Zugabe von jeder Vermischung oder Störung der Schichten verhindert. Gradienten können in einem -40 ° C oder -80 ° C Gefrierschrank für mindestens sechs Monate aufbewahrt werden. </li><li> Wenn sie nicht bereits geschehen ist, fügen Sie den Gradienten am Tag des Experiments die letzten 20% Schicht. Dann lassen Sie die Steigungen in einem kalten Raum auftauen oder einen Kühlschrank. </li></ol> 2. Herstellung von Cytosolextrakten Hinweis: Wir empfmit zwei Steigungen pro biologischen Probe zu beenden. 300 mg ist die optimale Menge an Pflanzenmaterial zwei Steigungen vorzubereiten , wenn sie mit 6 Tage alten Arabidopsis thaliana Keimlingen arbeiten. Wenn es mit weniger translational aktiven Geweben arbeiten, kann die Menge an Pflanzenmaterial erhöht werden, bis zu 600 mg. <ol><li> Ernte 6 Tage alten Sämlinge wachsen auf ½ Murashige und Skoog 8 - Medium mit 1% Saccharose oder gleichwertigen Medien ergänzt durch das Tiefgefrieren in flüssigem Stickstoff </li><li> Grind Pflanzenmaterial in einem vorgekühlten Mörser und Stößel mit flüssigem Stickstoff. </li><li> Man wiegt 300 mg pulverisiertes Material in einem vorgekühlten Waagschale. Führen Sie diesen Schritt schnell Auftauen der Probe zu vermeiden. Hinweis: Halten Sie die gefrorenen Proben für nicht mehr als eine Woche in einem -80 ° C Gefrierschrank. </li><li> Hinzufügen 2,4 ml vorgekühltem Polysomen - Puffer (Salt Solution 4X, 5,26 mM EGTA, 0,5% (v / v) Octylphenoxy - poly (ethylenoxy) ethanol, verzweigt, 50 μg.ml -1 Cycloheximid, 50 μg.ml 1Chloramphenicol) und homogenisieren, indem sie mit der Pipettenspitze vermischt wird. Übertragen in zwei 1,5-ml-Röhrchen. Arbeiten Sie schnell die Proben, um zu verhindern Erwärmung. </li><li> Zentrifuge bei 16.000 xg für 15 min bei 4 ° C in einer Mikrozentrifuge zur Pelletierung Schutt. Hinweis: Um die RNA-Abbau zu verhindern, halten immer die Proben bei 4 ° C, verwenden RNase / DNase frei Lösungen und arbeiten in RNase / DNase freien Bedingungen. Heparin kann in die Polysomen - Puffer zugegeben werden, bis zu einer Endkonzentration von 300 μg.ml -1, RNA - Schutz zu verbessern. Da jedoch Heparin mit nachgeschalteter Analyse stören kann, wird es durch Ausführen einer Lithiumchloridfällung anstelle von Ethanolfällung (siehe Anmerkung 4.7) während der RNA-Fällungsschritt entfernt werden. </li></ol> 3. Polysomen Profilieren <ol><li> Sorgfältig pipettieren den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Wenn Pflanzenfragmente pipettiert wurden, wiederholen Sie Schritt 2.5. Laden Sie den Überstand auf der Oberseite des Gradienten durch sanft pipetting auf die Seitenwand des Röhrchens in einem konstanten Strom. Verwenden Sie einen Gradienten für jede 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Transfer zum vorgekühlten Eimer und Zentrifuge bei 175.000 xg für 2 h 45 min bei 4 ° C, in einer Ultrazentrifuge (zB 32.000 Umdrehungen pro Minute bei einem SW41-Rotor verwendet wird). </li><li> Stellen Sie den Gradienten Sammelsystem auf , als in Figur 1 beschrieben ist . Die UV - Küvette hat einen 1 mm Weglänge. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig1.jpg" /> Abbildung 1. Gradient Sammelsystem. Die UV - Küvette wird durch Polyvinylchlorid Schlauch auf eine Glaskapillare verbunden, die auf dem Boden des Gradienten abfällt. Die Steigung schreitet durch das System dank einer Schlauchpumpe. OD 260 wird kontinuierlich gelesen und 2 ml - Fraktionen werden gesammelt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version zu sehen</a>diese Figur. <ol start="4"><li> Stellen Sie den Fraktionssammler auf RT und setzen Sie das Karussell mit einer Geschwindigkeit, die die Sammlung von 2 ml Fraktionen ermöglichen. Verwenden Sie vorgekühlten Sammelröhrchen. </li><li> Sammeln Sie die Fraktionen von unten eine Glaskapillare von Polyvinylchlorid Schlauch mit dem Gradienten Sammelsystem verbunden nach oben mit. Mit einem Kunststoffparaffinfilm die Verbindung zwischen dem Polyvinylchlorid-Rohr und der Glaskapillare zu sichern. </li><li> Die Extinktion bei 260 nm von der Unterseite zur Oberseite des Gradienten. Wenn der gesamte Gradienten gesammelt wird, legen Sie die Sammelröhrchen auf Eis vor der RNA-Extraktion. </li></ol> 4. RNA-Extraktion <ol><li> Pool der Fraktionen aus zwei Gradienten gesammelt, in 50 ml Zentrifugenröhrchen mit einer Kappe bedeckt, wie folgt: Polysomen: Fraktionen 1 bis 3 (12 ml) Monosomes: Fraktion 4 (4 ml) Überstand: Fraktionen 5 und 6 (8 ml) </li><li> Zu jeder Fraktion, fügen Sie 1 vol. 8M Guanidin-Hydrochlorid,50 &amp; mgr; g Acrylträger und 1,5 Vol. Isopropanol. Hinweis: Acryl Träger lineares Acrylamid, als Co-Fällmittel verwendet, um die Rückgewinnung von Nukleinsäuren während Alkoholfällung zu verbessern. </li><li> Mischen Sie durch die Rohre Umkehren und O / N bei -20 ° C auszufallen. </li><li> Zentrifuge bei 175.000 × g für 1 Stunde bei 4 ° C in einer Ultrazentrifuge (32.000 rpm in einem SW32 Rotor). Wenn das Fällungsschritt in einem Rohr durchgeführt wird, die nicht kompatibel mit Ultrazentrifugation ist, zu einem geeigneten Rohr. </li><li> Überstand verwerfen und lösen Sie das Pellet in 200 &amp; mgr; l RNAse-freiem TE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5-1 mM EDTA). Übertragen auf ein frisches 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Extrahieren RNA durch Zugabe von 1 vol. Wasser gesättigtem Phenol (pH 6,6) und 1 Vol. Chloroform: Isoamylalkohol (24: 1). Gründlich mischen. Zentrifuge bei 15.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Anmerkung: Säure Phenol (pH 4.5) kann verwendet werden, um DNA-Kontamination zu minimieren. </li><li>Ausfällen RNA von 1/10 Vol Zugabe. 3 M Natriumacetat und 3 vol. 100% Ethanol. Lassen Sie Fällung bei -80 ° C für 20 min oder O / N bei -20 ° C. Zentrifuge bei 15.000 xg für 15 min bei 4 ° C. Hinweis: Wenn in der Polysomen - Puffer (vgl Note 2.5), führen ein Lithiumchlorid (LiCl) Fällung anstelle von Ethanolfällung unter Verwendung von Heparin richtig jede Spur von Heparin zu entfernen , die 9 mit nachgeschalteter Analyse stören könnten. Nach der Extraktion hinzufügen LiCl zu einer Endkonzentration von 2,5 M. Niederschlag Lassen Sie für 30 Minuten bei -20 ° C oder O / N bei 4 ° C. Zentrifuge bei 15.000 xg für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie das Pellet mit 500 ul 75% Ethanol. Air das Pellet trocknen und in 30 ul TE-Puffer lösen. Beurteilen RNA Qualität durch Elektrophorese auf einem RNAse frei 1,2% Agarosegel (100 V, 15 min) oder durch Kapillarelektrophorese Methoden. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Export-Rohdaten in eine Grafik und Datenanalyse-Software. Hinweis: Wie in 2A und B gezeigt, geben die Rohprofile qualitative Informationen: die Anzahl der Polysoms Spitzen, die die Höhe des monosome Spitze, und das Vorhandensein einer Schulter entsprechend den freien Ribosomen - Untereinheiten zu sehen ist. </li><li> Merge Profile Vergleich der Profile zwischen den Proben zu ermöglichen. indem zusätzliche Datenpunkte zu Beginn der Kurven Verwenden Sie den Bildschirmleser Werkzeug, um den X-Wert des monosome Spitze für jede Probe zu bestimmen und die monosome Gipfel auszurichten. Identifizieren Sie den tiefsten Punkt der Kurve und bestimmen dessen Y-Wert (mit dem Screenreader-Tool). Stellen Sie den tiefsten Punkt Y-Wert auf 0, indem Sie den &quot;Set Spalten Wert&quot; -Funktion. </li><li> Bestimmen Sie den Polysomen / monosomes Verhältnis , indem die Fläche unter der Kurve von Rohprofile (3C) zu integrieren. Verwenden Sie die Datenauswahlwerkzeug die Grenze des Gebiets zu definieren, zu integrieren. Dann die Integration verwenden Funktion (Analysis-Mathematik). </li><li> Normalisierendie Kurven an den monosome Spitze durch alle Datenpunkte einer Kurve von der Y-Wert des Gipfels des monosome Spitzenteilung (bestimmt den Screenreader-Tool). Wählen Sie die Spalte, dann unter Analysis-Mathematik, wählen Sie Normalisieren und wählen Sie die &quot;geteilt durch einen bestimmten Wert&quot; Methoden. Dieser Schritt ermöglicht einen Vergleich der relativen Pegel von Polysomen (Abbildung 3D). </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Polysoms Profile. Arabidopsis thaliana Wildtyp (wt, Ökotyp Col-0) und mutierten Keimlinge wurden für sechs Tage auf ½ Murashige und Skoog - Medium unter langen Tag Photoperiode gezüchtet (16 Stunden Licht, 8 Stunden Dunkelheit). A: roh Polysoms Profile wt Sämlinge. B: roh Polysoms Profile aus dem mutierten Sämlinge. C: Die Bestimmung des Prozentsatzes von Polysomen und monosomes durch Integration der Fläche unter der Kurve D: Polysomen Profiles zum monosome Spitze normalisiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen

Das Protokoll, das wir hier vorstellen, ist eine einfache und kostengünstige Methode zur Generierung von Polysomenprofilen und zur Isolierung von mRNAs, die mit Polysomen, einzelnen Ribosomen oder frei von Ribosomen assoziiert sind. In der Literatur wird eine breite Palette unterschiedlicher Polysomenfraktionierungsmethoden beschrieben. Die hier beschriebene Methode wurde so optimiert, dass nur die notwendigen Verbindungen erhalten bleiben, und wurde für pflanzliches Material angepasst. Insbesondere reduzierten wir die M...

Die Proteinsynthese ist ein wesentlicher und energetisch kostspieliger Prozess in allen 1 - Zellen. Zuallererst Zellen müssen Energie in der Herstellung der Translationsmaschinerie, die Ribosomen investieren. Zum Beispiel erzeugt eine teilungsaktiven Hefezelle so viel wie 2000 Ribosomen pro Minute. Eine solche Produktion erfordert bis 60% der Gesamttranskriptionsaktivität und bis zu 90% der Gesamt Spleißen Aktivität der Zelle 2. Zusätzlich wird Energie für die Synthese von Aminosäuren, Aminoacyl-tRNA und Peptidbindungen erforderlich. In Pflanzen, das Hinzufügen einer Aminosäure einer Peptidkette Kosten 4,5-5,9 Moleküle ATP 3. Daher ist es nicht verwunderlich, dass die Translation von mRNA zu Protein ein wichtiger Ort der Regulierung, vor allem, wenn es mit wechselnden Umweltbedingungen fertig zu werden. Die Einleitung Schritt der Übersetzung, dass die Assoziation einer mRNA mit dem Ribosom ist, ist das Hauptziel der RegulierungÜbersetzung 4. Als Folge der Regulation der Translation sowie andere post-transkriptionale regulatorische Schritte können nur 40% der Variationen in Proteinkonzentration von mRNA Menge 5,6 erläutert. So gibt die Studie der Gesamt-mRNA relativ schlechte Informationen über Protein Hülle und Fülle. Auf der anderen Seite gibt der Verband der mRNA mit Ribosomen besseren Einblick in die Proteinmenge durch den Zugang zu diesen in Translation beteiligt mRNAs zu geben. Aktiv werden übersetzt mRNAs mit mehreren Ribosomen in Strukturen genannt Polysomen assoziiert. Im Gegensatz dazu wird schlecht übersetzt mRNAs mit nur einem Ribosom (monosome) zugeordnet werden. Folglich kann die Translations Status einer mRNA durch Überwachung seiner Verbindung mit Ribosomen 7 ausgewertet werden. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Polysomen aus 6 Tage alten Arabidopsis thaliana Keimlinge, die anschließende Isolierung von RNA und die Analyse der Ergebnisse. Polysomes und monosomes werden durch einen Saccharose-Dichtegradienten getrennt. Gradienten werden in sechs Fraktionen gesammelt. Einige der Fraktionen werden vereinigt drei zu erhalten gut getrennten Fraktionen: Polysomen, monosomes und die Leichtfraktion (im Folgenden als Überstand), die enthält die freien 60S und 40S ribosomalen Untereinheiten und mRNAs, die nicht mit Ribosomen assoziiert. Globale Translationsaktivität kann durch Erzeugen eines Polysomen / monosome Verhältnis geschätzt werden, die durch Integration der Fläche unter der Kurve bestimmt wird, und durch die Polysomen Profilen verglichen wird. mRNAs und Proteine ​​werden dann aus den verschiedenen Fraktionen und zur Analyse mittels RT-PCR, qRT-PCR, Northern Blot, Microarray, Western-Blot oder Proteomik extrahiert. Dieses Protokoll wurde für andere Pflanzen und Geweben validiert. Das Gerät benötigt, um dieses Protokoll zu erfüllen sind häufig in den meisten Labors gefunden: Es besteht keine Notwendigkeit für einen Gradienten ausgestattet. Einfrieren jede Schicht bevor die nächste Zugabe verhinderns aus einem Mix oder Störung der Schichten. Kein Schlauch piercer für Gradienten Sammlung verwendet, die durch Eintauchen eines Glaskapillarrohres in dem Gradienten erreicht werden kann. Daher bleiben die teuren Ultrazentrifugenröhrchen unbeschädigt und wiederverwendet oft werden kann. Zusammen macht dies das vorliegende Protokoll eine einfache und billige Methode für Polysoms Profilierung.

<table><tbody><tr><td>Ultrazentrifugenröhrchen, dünnwandig, Polyallomer - 13,2 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenröhrchen, dünnwandig, Polyallomer - 38,5 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillarröhrchen</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima Serie</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge Rotor SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge Rotor SW32</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon R3607 Polyvinylchlorid Schlauch&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>070534-22</td><td>Schlauch aus Polyvinylchlorid, 2,29 mm;</td></tr><tr><td>Fraktionssammler Modell 2110</td><td>Bio-Rad</td><td>731-8120</td><td></td></tr><tr><td>UV-Küvette</td><td>Hellma</td><td>170.700-QS</td><td>Quarz-Durchflussküvette</td></tr><tr><td>UV-Spektralphotometer</td><td>Varian</td><td>Cary50</td><td>Alle 0.0125 sec Alle</td></tr><tr><td>Chemikalien</td><td>Alle</td><td></td> Verwendungen <td>Nur für Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Murashige und Skoog Basalsalzmischung (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Rnasefreies Wasser</td><td>Jegliche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>10083251&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Octylphenoxypoly(ethylenoxy)ethanol, verzweigt (Nonidet P40)</td><td>Euromedex</td><td>UN3500</td><td></td></tr><tr><td>Lineares Acrylamid (Acrylträger)</td><td>ThermoFischer scientific</td><td>AM9520</td><td>RNA-Fällungsträger</td></tr><tr><td>OriginPro 8</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Analysesoftware</td></tr></tbody></table>

eine einfache methode für pflanzen polysomen profilieren

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Die Übersetzung von mRNA in Protein ist ein grundlegender und stark regulierter biologischer Prozess. Das Polysomen-Profiling gilt als Goldstandard für die Analyse der translationalen Regulation. Die hier beschriebene Methode ist eine einfache und kostengünstige Methode zur Fraktionierung von Polysomen aus verschiedenen Pflanzengeweben. Ein Saccharose-Gradient wird ohne die Notwendigkeit eines Gradientenherstellers hergestellt, indem jede Schicht nacheinander eingefroren wird. Zytosolische Extrakte werden dann in einem Puffer hergestellt, der Cycloheximid und Chloramphenicol enthält, um die zytosolischen und chloroplastischen Ribosomen an mRNA zu immobilisieren, und werden auf den Saccharosegradienten geladen. Nach der Zentrifugation werden sechs Fraktionen direkt von unten nach oben im Gradienten gesammelt, ohne das Ultrazentrifugationsröhrchen zu durchstechen. Während der Entnahme wird die Absorption bei 260 nm kontinuierlich gelesen, um ein Polysomenprofil zu erzeugen, das eine Momentaufnahme der globalen Translationsaktivität liefert. Die Fraktionen werden dann gepoolt, um drei verschiedene mRNA-Populationen herzustellen: die Polysomen, mRNAs, die an mehrere Ribosomen gebunden sind; die Monosomen, mRNAs, die an ein Ribosom gebunden sind; und mRNAs, die nicht an Ribosomen gebunden sind. Anschließend werden mRNAs extrahiert. Dieses Protokoll wurde für verschiedene Pflanzen und Gewebe validiert, darunter Arabidopsis thaliana-Sämlinge und adulte Pflanzen, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum und Oryza sativa-Blätter.

In der Literatur sind Polysomen Profile oft aus der leichten Fraktion in die Schwerfraktion als Ergebnis der Art und Weise gezeigt sind, die Gradienten gesammelt, also von oben nach unten. Da in dem beschriebenen Protokoll hier die Gradienten von unten nach oben gesammelt werden, mit der schweren Fraktion (die Polysomen) und gehen die Profile zeigen wir auf die leichte Fraktion (freie Ribosomen - Untereinheiten und RNAs) (2A) beginnen. Wir sammeln dann jeden Gradienten i...

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Extraktion und Fraktionierung von Transkripten aus pflanzlichem Gewebe auf der Grundlage der Anzahl der gebundenen Ribosomen. Es ermöglicht eine globale Abschätzung der Translationsaktivität und die Bestimmung des Translationsstatus spezifischer mRNAs.

Eine einfache Methode für Pflanzen Polysomen Profilieren

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Hallo, ich bin Cecile. Ich arbeite am LGBP in Marseille. Das Protokoll, das wir in diesem Video beschreiben, ist eine einfache Methode zur Isolierung von Polysomen und Monosomen aus verschiedenen Pflanzengeweben, um mRNA-Moleküle zu identifizieren, die aktuell translatiert werden, und um die Regulation der Translation zu untersuchen.Als Beispiel zeigen wir die Isolierung von Polysomen aus sechs Tage alten Arabidopsis thaliana-Keimlingen, die anschließende Isolierung von RNA sowie die Analyse der Ergebnisse. Säen Sie die Samen auf eine Petrischale und lagern Sie sie zwei Tage bei vier Grad. Züchten Sie die Pflanzen anschließend sechs Tage lang.Die Keimlinge gewinnen und in flüssigem Stickstoff zermahlen. 300 Milligramm Pflanzenpulver abwiegen und 2,4 Milliliter Polysomenpuffer hinzufügen. Zentrifugieren, um die Pflanzenfragmente zu sammeln, und das Überstand auf die Spitze eines Saccharosegradienten auftragen.Ultra-Zentrifugieren Sie das Gradientenmaterial und sammeln Sie es anschließend von unten nach oben unter kontinuierlicher Messung der Extinktion (OD). Fraktionieren Sie die Probe in eine Polysomen-, eine Monosomen- und eine Überstandfraktion, und fällen Sie die RNA über Nacht aus. Zentrifugieren Sie erneut, lösen Sie das Pellet auf und extrahieren Sie die RNA zur weiteren Analyse. Einige Tage vor der Durchführung der Polysomenprofilierung bereiten Sie den Saccharosegradienten vor.Stellen Sie 50, 35 und 20 %ige Saccharoselösungen her und bewahren Sie sie bei vier Grad auf. Gießen Sie die 50 %ige Saccharoselschicht. Gefrieren Sie sie in einem Minus-40-Gefrierschrank ein.Nach sechs Stunden die 35 %-Schicht hinzufügen und über Nacht in einem Minus-40-Gefrierschrank einfrieren. Die erste 20 %-Schicht einfüllen und einfrieren. Am Tag des Experiments die erforderliche Anzahl an Gradienten aus dem Gefrierschrank entnehmen.Fügen Sie die letzte 20 %ige Saccharoselösung hinzu und lassen Sie die Gradienten im Kühlraum auftauen. Bereiten Sie die Probe vor, für die wir frisch gesammelte Pflanzenmaterial verwenden. Hier verwenden wir sechs Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana.Die in flüssigem Stickstoff gefrorenen Pflanzen sammeln und gründlich mahlen. 300 Milligramm Pflanzenpulver abwiegen. Schnell 2,4 Milliliter frisches Polysomen-Puffer zugeben und homogenisieren.Pipettieren Sie die Lösung in zwei 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie den zytosolischen Extrakt. Pipettieren Sie den Überstand.Seien Sie vorsichtig, um Pflanzenfragmente zu vermeiden. Diese würden das Profil im nächsten Schritt beeinträchtigen. Geben Sie das Überstand auf die Saccharose-Dichtegradienten, ohne diesen zu stören.Platzieren Sie den Gradienten in einem SW-41-Rotorbehälter. Zentrifugieren Sie. Um das Polysomenprofil zu visualisieren und die Fraktion zu sammeln, verwenden wir ein einfaches System, das aus einem Kapillarrohr besteht, das in den Gradienten eintaucht. Es ist mit einer UV-Küvette verbunden.Es ist selbstständig mit einer peristaltischen Pumpe verbunden. Ein UV-Spektrophotometer registriert kontinuierlich die Extinktion, während der Gradient durch die Küvette verläuft. Der Fraktionssammler ermöglicht die Sammlung von zwei Milliliter-Fraktionen.Reinigen Sie die Küvette und stellen Sie sie in das Spektrophotometer. Entfernen Sie den Gradienten aus dem Behälter, ohne ihn zu stören. Chlorophylle müssen sich an der Spitze des Gradienten konzentrieren.Die Kapillarröhrchen bis zum Boden der Gradienten eintauchen. Die peristaltische Pumpe starten. Der Gradient wird von unten nach oben gesammelt und die OD kontinuierlich gemessen.Es werden Fraktionen zu je zwei Milliliter gesammelt. So sieht die Form eines klassischen Profils aus. Die RNA-Fällung wird unter Verwendung von Guanidiniumhydrochlorid und Isopropanol durchgeführt.Zunächst eine Portion Guanidiniumhydrochlorid in einem 50-Milliliter-Röhrchen ansetzen und dann die Fraktion hinzufügen. Anschließend 1,5 Portionen Isopropanol und 50 Mikrogramm gleichwertigen Carrier hinzufügen. Die RNA über Nacht bei minus 20 Grad Celsius ausfällen lassen.Überführen Sie die Fraktionen in 40-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen und balancieren Sie die Röhrchen mit Isopropanol ab. Zentrifugieren Sie. Entfernen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet an der Luft. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikroliter warmer TE-Pufferlösung.Extrahieren Sie die RNA weiter, indem Sie eine klassische Phenol-Chloroform-Extraktion durchführen. Hier ist ein repräsentatives Profil von Polysomen, extrahiert aus sechstagealten Sämlingen von Arabidopsis, dargestellt. Der Hauptpeak entspricht dem Monosom, der mRNA, die mit einem einzelnen Ribosom assoziiert ist.Der erste Teil des Profils entspricht den polysomalen Fraktionen, also der mRNA, die mit vielen Ribosomen assoziiert ist. Jedes Peak entspricht der Bindung eines neuen Ribosoms an die mRNA. Der letzte Teil des Profils entspricht der sogenannten Überstandfraktion, die freie ribosomale Untereinheiten und RNA enthält.Größere Mengen der 60S-Untereinheit bilden eine Schulter neben dem Monosomen-Peak. Um ihre Integrität zu überprüfen, können die aus den Fraktionen isolierten RNAs auf einem klassischen Agarosegel aufgetrennt werden, bevor sie für weitere Experimente verwendet werden. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um Polysomen aus Sämlingen von Arabidopsis thaliana sowie aus jungen und alten Rosetten, aber auch aus Blättern von Nicotiana benthamiana, Tomate und Reis zu isolieren, sodass es mit einer breiten Palette von Pflanzen und Geweben funktionieren sollte.Die gereinigten RNAs sind kompatibel mit Mikroarray-Analysen sowie mit der Identifizierung kleiner RNAs, die mit polysomalen Fraktionen assoziiert sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Extraktion des Übersetzens Ribosomen aus eukaryotischen Zellen. Sobald extrahiert, Ribosomen in monosomes und Polyribosomen durch Saccharose-Gradienten Fraktionierung getrennt, um verschiedene ribosomale Populationen analysiert werden. Als solche ist diese Methode der Goldstandard für die Untersuchung der Regulation der Translation.

Eukaryotische Polyribosome Profile Analysis

Hier beschreiben wir ein Verfahren, um Veränderungen in der mRNA-Translationsinitiation eukaryontischer Zellen in Reaktion auf Stress-Bedingungen zu untersuchen. Dieses Verfahren basiert auf der Geschwindigkeit Trennung auf Saccharosegradienten übersetzen Ribosomen nicht übersetzen Ribosomen basiert.

Analyse der Translation Initiation Während Stress-Bedingungen durch Polysomprofile Profiling

Ribosomen spielen eine zentrale Rolle bei der Proteinsynthese. Polyribosom (Polysomen) Fraktionierung durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation ermöglicht die direkte Bestimmung der Übersetzung Effizienz einzelner mRNAs auf einem genomweiten Maßstab. Darüber hinaus kann dieses Verfahren für die biochemische Analyse von Ribosomen und Polysomen-assoziierten Faktoren wie Chaperone und Signalmolekülen verwendet werden.

Polysomprofile Fraktionierung und Analyse von Säuger Translatomes auf einer Genom-weite Skala

Die Fähigkeit der Zellen, sich an Stress anzupassen, ist entscheidend für ihr Überleben. Die Regulation der mRNA-Translation ist eine solche Anpassungsstrategie, die eine schnelle Regulation des Proteoms ermöglicht. Hier stellen wir ein standardisiertes Polysomen-Profiling-Protokoll zur Verfügung, um spezifische mRNAs zu identifizieren, die unter Stressbedingungen selektiv translatiert werden.

Bewertung der Selective mRNA Translation in Säugerzellen durch Polysomen Profilieren

Hier präsentieren wir ein Interaktom-Capture-Protokoll, das auf Arabidopsis thaliana Blatt-Mesophyll-Protoplasten angewendet wird. Diese Methode beruht kritisch auf in vivo UV-Vernetzung und ermöglicht die Isolierung und Identifizierung von p-mRNA-bindenden Proteinen aus einer physiologischen Umgebung.

MRNA Interactome Capture aus Pflanzenprotoplasten

Das übergeordnete Ziel der Polysome Profilerstellung Technik ist Analyse der übersetzerischen Tätigkeit der einzelnen mRNAs oder Transkriptom mRNAs während der Proteinsynthese. Die Methode ist für Studien von Protein-Synthese-Verordnung, Übersetzung Aktivierung und Repression in Gesundheit und mehrere menschliche Krankheiten wichtig.

Polysome Profilerstellung in Leishmaniose, menschliche Zellen und Maus Hoden

Die Übersetzung der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) bietet die Möglichkeit, Entwicklungsprogramme mit minimaler Verarbeitung von Organen und Geweben zu sezieren. Das Protokoll liefert hochwertige RNA aus Zellen, die mit einem grünen fluoreszierenden Protein (GFP)-markierten ribosomalen Untereinheit begezielt sind. Nachgeschaltete Analysewerkzeuge wie qRT-PCR oder RNA-seq zeigen Gewebe- und zelltypspezifische Expressionsprofile auf.

Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

Die Entwicklung des Säugetiergehirns erfordert eine ordnungsgemäße Kontrolle der Genexpression auf der Ebene der Translation. Hier beschreiben wir ein Polysomen-Profiling-System mit einer einfach zu montierenden Sucrose-Gradientenerstellungs- und Fraktionierungsplattform, um den Translationsstatus von mRNAs im sich entwickelnden Gehirn zu bewerten.

Analyse der Übersetzung im sich entwickelnden Mausgehirn mit Polysome Profiling

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein Polysomenprofil generiert wird, ohne automatisierte Gradientenerzeuger oder Gradientenfraktionierungssysteme zu verwenden.

Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur eukaryotischen Polysomenreinigung aus intakten Sojaknollen. Nach der Sequenzierung können Standardpipelines für die Genexpressionsanalyse verwendet werden, um differentiell exprimierte Gene auf Transkriptom- und Translatomebene zu identifizieren.

Polysomenreinigung aus Sojabohnen-Symbiose-Knötchen

Das hier vorgestellte Protokoll beinhaltet polysomales Profiling zur Isolierung von Translatomen, mRNAs, die mit Ribosomen assoziiert sind, in nicht-polysomale und polysomale RNAs aus Arabidopsis durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation. Diese Methode demonstriert die Translationseffizienz von hitzegestresstem Arabidopsis.

Translationseffizienztest mit Polysomenprofilen unter Hitzebelastung

Lernen Sie eine einfache Methode zur Isolierung von Polysomen und Monosomen aus Pflanzengeweben zur Analyse aktiv übersetzter mRNAs. Dieses Protokoll demonstriert die Anwendung an Arabidopsis thaliana-Sämlingen.

Eine einfache Methode für Pflanzen Polysomen Profilieren

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