Eine einfache Methode für Pflanzen Polysomen Profilieren

Hallo, ich bin Cecile. Ich arbeite bei der LGBP in Marseille. Das Protokoll, das wir in diesem Video beschreiben werden, ist eine einfache Methode zur Isolierung von Polysomen und Monosomen aus verschiedenen Pflanzengeweben, um mRNAs zu identifizieren, die aktiv translatiert werden, und um die Translationsregulation zu untersuchen.

Als Beispiel zeigen wir Ihnen die Isolierung von Polysomen aus sechs Tage alten Arabidopsis thaliana-Sämlingen, die anschließende Isolierung von RNA und die Analyse der Ergebnisse. Säen Sie die Samen auf einem Teller und lassen Sie sie zwei Tage bei vier Grad. Dann züchten Sie die Pflanzen sechs Tage lang.

Ernten Sie den Sämling und mahlen Sie ihn in flüssigem Stickstoff. Selber 300 Milligramm Pflanzenpulver und füge 2,4 Milliliter Polysomenpuffer hinzu. Zentrifugieren Sie, um Pflanzenfragmente zu sammeln und den Überstand auf einen Saccharosegradienten zu laden.

Ultrazentrifugengradient und dann von unten nach oben mit kontinuierlicher Ablesung des Außendurchmessers sammeln. Ziehen Sie die Fraktion in ein Polysom, ein Monosom und eine Überstandsfraktion und fällen Sie die RNA über Nacht. Ultrazentrifugieren, das Pellet resuspendieren und RNA für die anschließende Analyse extrahieren. Bereiten Sie einige Tage vor der Polysomenprofilierung den Saccharosegradienten vor.

Bereiten Sie 50, 35 und 20% ige Saccharoselösung vor und halten Sie sie bei vier Grad. Gießen Sie die 50%ige Saccharoseschicht. Frieren Sie es in einem Gefrierschrank mit minus 40 Grad ein.

Nach sechs Stunden die 35%-Schicht hinzufügen und über Nacht in einem Gefrierschrank mit minus 40 Grad einfrieren. Gießen Sie die erste 20%ige Schicht und frieren Sie sie ein. Entfernen Sie am Tag des Experiments die erforderliche Anzahl von Gradienten aus dem Gefrierschrank.

Die letzten 20%ige Saccharoseschicht hinzufügen und die Farbverläufe in einem Kühlraum auftauen lassen. Bereiten Sie die Probe vor, die wir frisch gesammelt haben. Hier verwenden wir sechs Tage alte Sämlinge von Arabidopsis thaliana.

Ernten Sie die mit flüssigem Stickstoff gefrorenen Pflanzen und mahlen Sie sie gründlich. Wiegen Sie 300 Milligramm Pflanzenpulver. Schnell 2,4 Milliliter frischen Polysomenpuffer zugeben und homogenisieren.

Pipettieren Sie die Lösung in zwei 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie den zytosolischen Extrakt. Pipettieren Sie den Überstand.

Achten Sie darauf, Pflanzenfragmente zu vermeiden. Sie würden das Profil im nächsten Schritt verderben. Laden Sie den Überstand auf den Saccharosegradienten, ohne den Gradienten zu stören.

Geben Sie das Gefälle in eine Rotorschaufel SW 41. Zentrifuge. Um das Polysomenprofil zu visualisieren und den Anteil zu erfassen, verwenden wir ein einfaches System aus einem Kapillarrohr, das in den Gradienten eintaucht. Es ist mit einer UV-Küvette verbunden.

Es ist selbst an eine Schlauchpumpe angeschlossen. Ein UV-Spektralphotometer registriert kontinuierlich den Außendurchmesser, während sich der Gradient durch die Küvette bewegt. Der Fraktionssammler ermöglicht die Sammlung von zwei Milliliterfraktionen.

Reinigen Sie die Küvette und setzen Sie sie in das Spektralphotometer ein. Entfernen Sie das Gefälle aus der Schaufel, ohne sie zu stören. Chlorophylle müssen am oberen Ende des Gradienten konzentriert werden.

Tauchen Sie die Kapillarrohre an den unteren Rand des Gradienten. Starten Sie die Schlauchpumpe. Der Farbverlauf wird von unten nach oben erfasst und der Außendurchmesser kontinuierlich ausgelesen.

Es werden zwei Milliliterfraktionen gesammelt. Hier ist die Form eines klassischen Profils. Die RNA-Fällung erfolgt unter Verwendung von Guanidiniumhydrochlorid und Isopropanol.

Gießen Sie zuerst ein Volumen Guanidiniumhydrochlorid in ein 50-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie dann die Fraktion hinzu. Fügen Sie dann 1,5 Volumen Isopropanol und 50 Mikrogramm gleichen Kurier hinzu. Fällt die RNA über Nacht bei minus 20 Grad aus.

Übertragen Sie die Fraktionen in 40-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen und balancieren Sie das Röhrchen mit Isopropanol aus. Zentrifuge. Entfernen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet an der Luft. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern warmem TE-Puffer.

Extrahieren Sie die RNA weiter, indem Sie eine klassische Phenol-Chloroform-Extraktion durchführen. Ein repräsentatives Profil des Polysomenextrakts aus dem sechs Tage alten Sämling von Arabidopsis ist hier zu sehen. Der Hauptpeak entspricht dem Monosom, den mRNAs, die mit einem einzelnen Ribosom assoziiert sind.

Der erste Teil des Profils entspricht den polysomalen Fraktionen, nämlich der mRNA, die mit vielen Ribosomen assoziiert ist. Jeder Peak entspricht der Assoziation des neuen Ribosoms mit der mRNA. Der letzte Teil des Profils entspricht der sogenannten Überstandsfraktion, die die freien ribosomalen Untereinheiten und RNA enthält.

Eine große Menge an 60S-Untereinheiten bildet eine Schulter neben dem Monosom-Peak. Um ihre Integrität zu beurteilen, können die aus den Fraktionen extrahierten RNAs auf einem klassischen Aragose-Gel laufen gelassen werden, bevor sie für weitere Experimente verwendet werden. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um Polysomen aus Arabidopsis thaliana-Sämlingen, aber auch aus jungen und alten Rosetten sowie aus Nicotiana benthamiana, Tomaten und Reisblättern zu isolieren, so dass es mit einer Vielzahl von Pflanzen und Geweben funktionieren sollte.

Die aufgereinigten RNAs sind sowohl für die Microarray-Analyse als auch für die Identifizierung kleiner RNAs, die mit polysomalen Fraktionen assoziiert sind, kompatibel.