Eine einfache Methode für Pflanzen Polysomen Profilieren

Hallo, ich bin Cecile. Ich arbeite am LGBP in Marseille. Das Protokoll, das wir in diesem Video beschreiben, ist eine einfache Methode zur Isolierung von Polysomen und Monosomen aus verschiedenen Pflanzengeweben, um mRNA-Moleküle zu identifizieren, die aktuell translatiert werden, und um die Regulation der Translation zu untersuchen.

Als Beispiel zeigen wir die Isolierung von Polysomen aus sechs Tage alten Arabidopsis thaliana-Keimlingen, die anschließende Isolierung von RNA sowie die Analyse der Ergebnisse. Säen Sie die Samen auf eine Petrischale und lagern Sie sie zwei Tage bei vier Grad. Züchten Sie die Pflanzen anschließend sechs Tage lang.

Die Keimlinge gewinnen und in flüssigem Stickstoff zermahlen. 300 Milligramm Pflanzenpulver abwiegen und 2,4 Milliliter Polysomenpuffer hinzufügen. Zentrifugieren, um die Pflanzenfragmente zu sammeln, und das Überstand auf die Spitze eines Saccharosegradienten auftragen.

Ultra-Zentrifugieren Sie das Gradientenmaterial und sammeln Sie es anschließend von unten nach oben unter kontinuierlicher Messung der Extinktion (OD). Fraktionieren Sie die Probe in eine Polysomen-, eine Monosomen- und eine Überstandfraktion, und fällen Sie die RNA über Nacht aus. Zentrifugieren Sie erneut, lösen Sie das Pellet auf und extrahieren Sie die RNA zur weiteren Analyse. Einige Tage vor der Durchführung der Polysomenprofilierung bereiten Sie den Saccharosegradienten vor.

Stellen Sie 50, 35 und 20 %ige Saccharoselösungen her und bewahren Sie sie bei vier Grad auf. Gießen Sie die 50 %ige Saccharoselschicht. Gefrieren Sie sie in einem Minus-40-Gefrierschrank ein.

Nach sechs Stunden die 35 %-Schicht hinzufügen und über Nacht in einem Minus-40-Gefrierschrank einfrieren. Die erste 20 %-Schicht einfüllen und einfrieren. Am Tag des Experiments die erforderliche Anzahl an Gradienten aus dem Gefrierschrank entnehmen.

Fügen Sie die letzte 20 %ige Saccharoselösung hinzu und lassen Sie die Gradienten im Kühlraum auftauen. Bereiten Sie die Probe vor, für die wir frisch gesammelte Pflanzenmaterial verwenden. Hier verwenden wir sechs Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana.

Die in flüssigem Stickstoff gefrorenen Pflanzen sammeln und gründlich mahlen. 300 Milligramm Pflanzenpulver abwiegen. Schnell 2,4 Milliliter frisches Polysomen-Puffer zugeben und homogenisieren.

Pipettieren Sie die Lösung in zwei 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie den zytosolischen Extrakt. Pipettieren Sie den Überstand.

Seien Sie vorsichtig, um Pflanzenfragmente zu vermeiden. Diese würden das Profil im nächsten Schritt beeinträchtigen. Geben Sie das Überstand auf die Saccharose-Dichtegradienten, ohne diesen zu stören.

Platzieren Sie den Gradienten in einem SW-41-Rotorbehälter. Zentrifugieren Sie. Um das Polysomenprofil zu visualisieren und die Fraktion zu sammeln, verwenden wir ein einfaches System, das aus einem Kapillarrohr besteht, das in den Gradienten eintaucht. Es ist mit einer UV-Küvette verbunden.

Es ist selbstständig mit einer peristaltischen Pumpe verbunden. Ein UV-Spektrophotometer registriert kontinuierlich die Extinktion, während der Gradient durch die Küvette verläuft. Der Fraktionssammler ermöglicht die Sammlung von zwei Milliliter-Fraktionen.

Reinigen Sie die Küvette und stellen Sie sie in das Spektrophotometer. Entfernen Sie den Gradienten aus dem Behälter, ohne ihn zu stören. Chlorophylle müssen sich an der Spitze des Gradienten konzentrieren.

Die Kapillarröhrchen bis zum Boden der Gradienten eintauchen. Die peristaltische Pumpe starten. Der Gradient wird von unten nach oben gesammelt und die OD kontinuierlich gemessen.

Es werden Fraktionen zu je zwei Milliliter gesammelt. So sieht die Form eines klassischen Profils aus. Die RNA-Fällung wird unter Verwendung von Guanidiniumhydrochlorid und Isopropanol durchgeführt.

Zunächst eine Portion Guanidiniumhydrochlorid in einem 50-Milliliter-Röhrchen ansetzen und dann die Fraktion hinzufügen. Anschließend 1,5 Portionen Isopropanol und 50 Mikrogramm gleichwertigen Carrier hinzufügen. Die RNA über Nacht bei minus 20 Grad Celsius ausfällen lassen.

Überführen Sie die Fraktionen in 40-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen und balancieren Sie die Röhrchen mit Isopropanol ab. Zentrifugieren Sie. Entfernen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet an der Luft. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikroliter warmer TE-Pufferlösung.

Extrahieren Sie die RNA weiter, indem Sie eine klassische Phenol-Chloroform-Extraktion durchführen. Hier ist ein repräsentatives Profil von Polysomen, extrahiert aus sechstagealten Sämlingen von Arabidopsis, dargestellt. Der Hauptpeak entspricht dem Monosom, der mRNA, die mit einem einzelnen Ribosom assoziiert ist.

Der erste Teil des Profils entspricht den polysomalen Fraktionen, also der mRNA, die mit vielen Ribosomen assoziiert ist. Jedes Peak entspricht der Bindung eines neuen Ribosoms an die mRNA. Der letzte Teil des Profils entspricht der sogenannten Überstandfraktion, die freie ribosomale Untereinheiten und RNA enthält.

Größere Mengen der 60S-Untereinheit bilden eine Schulter neben dem Monosomen-Peak. Um ihre Integrität zu überprüfen, können die aus den Fraktionen isolierten RNAs auf einem klassischen Agarosegel aufgetrennt werden, bevor sie für weitere Experimente verwendet werden. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um Polysomen aus Sämlingen von Arabidopsis thaliana sowie aus jungen und alten Rosetten, aber auch aus Blättern von Nicotiana benthamiana, Tomate und Reis zu isolieren, sodass es mit einer breiten Palette von Pflanzen und Geweben funktionieren sollte.

Die gereinigten RNAs sind kompatibel mit Mikroarray-Analysen sowie mit der Identifizierung kleiner RNAs, die mit polysomalen Fraktionen assoziiert sind.