Probenvorbereitung für die Massen Cytometry-Analyse

Das übergeordnete Ziel dieses Probenvorbereitungsprozesses ist es, eine robuste und konsistente Antikörperfärbung verschiedener Proben zu erzeugen, um die Untersuchung heterogener Zellpopulationen zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, Fragen zur Zellidentität, zur Zellsignalisierung und zur Zellantwort in einer komplexen heterogenen Zellpopulation zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Messung von Proteinspiegeln mit hohen Parametern auf Einzelzellebene ermöglicht.

Dieses Verfahren wird von Aundrietta Duncan, einer Doktorandin aus unserem Labor, demonstriert. Für jede einzelne Zellsuspensionsprobe wird sie bei viermal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in serumfreiem Medium resuspendiert, 500 Mikroliter frisch zubereitetes 50 Mikromolares Cisplatin pro 2/10 in die sechs Zellen gegeben und die Proben auf einem Orbitalschüttler unter ständigem Mischen bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer Minute wird das Cisplatin mit einem gleichen Volumen Waschpuffer abgeschreckt und die Zellen zentrifugiert.

Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Proben zwei weitere Male, indem Sie 500 Mikroliter Waschpuffer hinzufügen, die Zellen zentrifugieren und den Waschpuffer abgießen. Anschließend werden die Proben zweimal in 500 Mikrolitern PBS gewaschen, wobei die Proben auf ähnliche Weise zentrifugiert und der Überstand verworfen wird. Nach der zweiten PBS-Wäsche resuspendieren Sie die Pellets in 500 Mikrolitern frischem PBS und fixieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern 4%PFA.

Pipettieren Sie die Zellen, um sie zu mischen. Anschließend werden die Proben 15 Minuten lang bei Raumtemperatur unter konstantem Mischen auf den Orbitalschüttler gelegt. Am Ende der Inkubation pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, gießen den Überstand ab und waschen anschließend frisches PBS.

Um die Zellen zu permeabilisieren, schleudern Sie die Zellen wieder herunter und verwerfen Sie die Überstände. Die Proben werden durch sanftes Vortexen wieder in das restliche PBS suspendiert und sofort ein Milliliter 100 %Methanol pro 2/10 10 in die sechsten Zellen durch sanftes Pipettieren gegeben. Inkubieren Sie die Proben mindestens eine Stunde lang bei vier Grad und zentrifugieren Sie die Zellen am Ende der Inkubation.

Anschließend das Methanol abgießen. Waschen Sie dann die Pellets in einem Milliliter Waschpuffer für jeden Milliliter Methanol, gefolgt von zwei weiteren Waschgängen in 500 Mikrolitern frischem Waschpuffer. Übertragen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette auf 50 Mikroliter den restlichen Waschpuffer aus jedem Pellet in ein Röhrchen mit dem entsprechenden Antikörpercocktail.

Pipettieren Sie die kombinierte Lösung wieder hoch, ohne Luft in die Spitze zu ziehen, indem Sie den Kolben teilweise gedrückt halten. Übertragen Sie dann die Pipettenspitze in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 Mikrolitern Waschpuffer, ohne den Kolben loszulassen. Lassen Sie den Kolben los, ziehen Sie den Waschpuffer für ein Gesamtvolumen des Antikörpercocktails von 50 Mikrolitern auf und markieren Sie die entsprechende Probe durch vorsichtiges Pipettieren mit dem aspirierten Antikörpercocktail.

Waschen Sie die Proben nach einer Stunde bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln viermal und gießen Sie den Waschpuffer jedes Mal ab. Um die Zellen mit Iridium zu markieren, suspendieren Sie die endgültigen Pellets erneut in 500 Mikrolitern PBS, gefolgt von der Zugabe von 500 Mikrolitern vier Prozent PFA für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes fügen Sie den Proben 500 Mikroliter frisch zubereitetes 62,5 nanomolares Iridium und PFA hinzu, um weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur zu schütteln.

Zentrifugieren Sie dann die Zellen, gießen Sie den Überstand ab und folgen Sie zwei Wäschen in 500 Mikrolitern 0,1 Prozent BSA und gefiltertem deionisiertem Wasser. Analysieren Sie die Proben, indem Sie Normalisierungskügelchen in die Vertiefungen der Probenplatten geben, Zellen in diese Vertiefungen pipettieren und dann innerhalb von 24 Stunden eine Massenzytometrie durchführen. Nach Normalisierung der Signalintensität können die Kalibrierperlen aus den Daten entfernt werden, indem die negative Population der Iridium-191-positiven Kügelchen angesteuert wird.

Die Einzelzellereignisse können dann mit einem Gated versehen werden, um die Trümmer und Zellmultipletts unter Verwendung eines biaxialen Diagramms der negativen Expression von Iridium 193 im Vergleich zur Ereignislänge zu entfernen. Die Cisplatin-Markierung kann verwendet werden, um die Zelltiefe zu messen. Hier werden zum Beispiel Proben mit geringen und höheren Mengen an toten Zellen gezeigt.

Die toten Zellen können entfernt werden, indem die Platin-198-positive Population weggeged wird, das Barcoding führt zu einer deutlichen Trennung der Proben innerhalb der Barcoding-Parameter, so dass die Zellen ihren ursprünglichen Probenidentitäten zugeordnet werden können. Die IDU-Markierung kann verwendet werden, um hier beobachtete US-Gesichtszellen zu erkennen. Nach der anfänglichen Normalisierung, dem De-Barcoding und dem Gating können die hochdimensionalen Daten mit dem SPADE-Algorithmus analysiert werden, um eine niedrigdimensionale Darstellung der Daten zu generieren, die sich besser für eine visuelle Interpretation eignet.

Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von vier bis sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den Probenverlust während des Waschschritts zu minimieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proben für die Massenzytometrie-Analyse vorbereitet.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Natriumazid gefährlich sein kann, daher sollten Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter PSA treffen.