Name: Probenvorbereitung für die Massen Cytometry-Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Lernen Sie die Probenvorbereitung für Mass Cytometry-Analysen kennen, um heterogene Zellpopulationen mit hohen Parametern auf Einzelzellebene zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in Zellidentität und Signalwege.

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Die Arbeit im Barton-Labor wurde durch einen Zuschuss des Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471) unterstützt. Diese Forschung wurde zum Teil durch ein Ausbildungsstipendium für Ryan L. McCarthy vom National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299 unterstützt. Die Core Facility, die das Massenzytometriegerät wartet und betreibt, wird durch CPRIT Grant (RP121010) und NIH Core Grant (CA016672) unterstützt.

<ol><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> J Vis Exp. , e4398(2012).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+step+on+the+path+to+mass+cytometry+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Another step on the path to mass cytometry standardization.</a> Cytometry A. 87, 380-382 (2015).</li>
<li>Newell, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+tetramer+staining+and+mass+cytometry+analysis+facilitate+T-cell+epitope+mapping+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization.</a> Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).</li>
<li>Leong, M. L., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Peptide-MHC+Tetramer+Staining+with+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).</li>
<li>Zunder, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).</li>
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<li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).</li>
<li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry A. 81, 467-475 (2012).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nat Methods. 3, 361-368 (2006).</li>
<li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81, 552-566 (2012).</li>
<li>Edgar, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hypoxic+cells+using+an+organotellurium+tag+compatible+with+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Horowitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+determinants+of+human+NK+cell+diversity+revealed+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry.</a> Sci Transl Med. 5, 208ra145(2013).</li>
<li>Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+molecular+roadmap+to+iPSC+reprogramming+through+progression+analysis+of+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry.</a> Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).</li>
<li>Han, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+reveals+intracellular+survival%2Fproliferative+signaling+in+FLT3-ITD-mutated+AML+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells.</a> Cytometry A. 87, 346-356 (2015).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+trajectory+detection+uncovers+progression+and+regulatory+coordination+in+human+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development.</a> Cell. 157, 714-725 (2014).</li>
<li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li>
<li>Amir el, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).</li>
<li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+partial+permeabilization+with+saponin+enables+cellular+barcoding+prior+to+surface+marker+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining.</a> Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).</li>
<li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83, 483-494 (2013).</li>
<li>Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithmic+Tools+for+Mining+High-Dimensional+Cytometry+Data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data.</a> J Immunol. 195, 773-779 (2015).</li>
<li>Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+discovery+and+characterization+of+cell+subsets+in+high+dimensional+mass+cytometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data.</a> Methods. 82, 55-63 (2015).</li>
<li>Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Phenotypes+and+Signaling+Networks+of+Single+Human+Cells+by+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).</li>
<li>van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html">Visualizaing Data using t-SNE.</a> J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).</li>
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<li>Chattopadhyay, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brilliant+violet+fluorophores%3A+a+new+class+of+ultrabright+fluorescent+compounds+for+immunofluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments.</a> Cytometry A. 81, 456-466 (2012).</li>
<li>Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-FISH%3A+Analysis+of+cellular+RNA+expression+patterns+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).</li>
<li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nat Methods. 13, 269-275 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das Protokoll hier vorgestellten wurde für die Verarbeitung von verschiedenen kultivierten Zelllinien (H1 und H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) und primäre Gewebeproben (Maus-Knochenmark, embryonale Maus-Leber, Maus Erwachsenen erfolgreich eingesetzt Leber, die Maus-Tumor). Unabhängig von der Quelle, jedes Gewebe, das in einzelne Zellen dissoziiert werden kann, während der zelluläre Zustand bewahren sollte Zytometrie zur Analyse von Massen zugänglich sein, sondern kann eine Protokolloptimierung erforde...

Cytometry ermöglicht die gleichzeitige Messung mehrerer Antikörper Ziele in einer einzelnen Zelle Ebene über große Populationen von Zellen. In herkömmlichen fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie, die Anzahl der Parameter, die quantifiziert werden kann, wird durch spektrale Überlappung zwischen dem Emissionsspektrum von mehreren Fluorophoren begrenzt, die immer komplexer werdenden Kompensationsberechnungen wie die Anzahl der Parameter ansteigt erfordert. Diese Einschränkungen werden durch Massen adressiert Cytometry, wo Schwermetall-konjugierten Antikörper nachgewiesen werden, und durch Flugzeit (TOF) Massenspektrometrie quantifizieren stark die Anzahl der Parameter gesammelt gleichzeitig expandiert und ein hohes Dimensionsprotein Überfluß Profil für jede einzelne Zelle zu ergeben. Ein grundlegendes Verständnis der Funktionsweise des Massen Zytometrie Instrument ist für den Benutzer von Vorteil und kann für die Fehlersuche wesentlich sein. Für eine ausführliche Beschreibung der Abstimmung und eine Masse-Zytometrie Maschine ausgeführt wird,finden Sie im verwandten Manuskript 1. Kurz gesagt, wird eine Zellprobe mit einem Panel von Antikörpern , konjugiert Metallzielzelloberflächenmarker, cytoplasmatische Proteine, nukleäre Proteine, Chromatin-gebundene Proteine oder andere Epitope von Interesse (Figur 1i) markiert. Die markierten Zellen werden auf die Maschine geladen wird, entweder einen nach dem anderen durch manuelle Injektion oder mit Hilfe eines automatischen Probennehmer, dass die Proben von einer 96-Well-Platte. Die beladenen Zellen werden durch einen Zerstäuber injiziert wird , die einen Sprühnebel aus Flüssigkeitströpfchen erzeugt , um die Zellen einkapseln (Abbildung 1II). Dieses Spray wird so positioniert, dass die Zellen durch einen Argonplasmabrenner ionisiert werden. Diese Ionisierung erzeugt eine Partikelwolke aller konstituierenden Atome jeder Zelle (Abbildung 1III) umfasst. Da diese Partikelwolke zu dem Detektor bewegt werden geringe Atommassen Atome aus den Ionen mit hohen Masse durch einen Quadrupol-Massenfilter getrennt. Die verbleibenden Ionen mit hohen Masse weiter zu dem Detektor, wo der abundance jedes Isotop wird (Abbildung 1IV) quantifiziert. Die Rohdaten vom Detektor gesammelt werden, werden von den Massen Cytometry Gerätesoftware analysiert, um Zellereignisse zu identifizieren. Für jedes identifizierte Zelle Ereignis, das Signal in jedem Kanal detektiert wird quantifiziert und mit einem Ausgang .fcs Datei gespeichert. Die Massenkanäle verwendet für das Schwermetall konjugiert Nachweis von Antikörpern eine minimale spektrale Überlappung, die mit den meisten Beiträgen unter 1% von 0-4% liegt. Aufgrund dieses geringen Übersprechens zwischen den Kanälen, ist es in der Regel nicht erforderlich , die Daten mit einer Kompensationsmatrix vor der Analyse 2 zu transformieren. Allerdings sollte Sorgfalt bei der Gestaltung der experimenteller Gruppe von Antikörpern getroffen werden, um sicherzustellen, dass ein Antikörper mit einem Hochfluss-Epitop nicht zu einem Masse Kanal zugeordnet ist, das Signal an einen Kanal zu einem Low-Fülle-Antikörper, da dies zugewiesen trägt eine künstlich hohe Population in dem Kanal erzeugt den Signalbeitrag zu empfangen. <p class = „jove_content“&gt; Die genaue Vorbereitung von Proben für Massen Zytometrie-Analyse ist in hohem Maße abhängig von den Typen von Proben gesammelt und die experimentelle Hypothese getestet. Wir stellen Beispiele für zwei Protokolle für die Ernte verschiedene Arten von Zellen (menschliche embryonale Stammzellen) und primäre Zellen (Maus-Brusttumor-Epithelzelle Isolat). Wenn eine Masse Zytometrie Studie beginnen, ist es ratsam, einen kleinen Pilotversuch zum ersten führen, um sicherzustellen, dass alle Protokolle und Antikörpern genutzt werden arbeiten gut in der Hand des Prüfers. Dies ist besonders wichtig, wenn benutzerdefinierte sind konjugierte Antikörper verwendet werden, da die partielle Reduktionsreaktion während der Antikörper-Konjugation hat das Potenzial, Antikörperaffinität zu stören; Daher muss jeder individuelle Antikörper validiert werden empirisch Datengenauigkeit zu gewährleisten. Andere Überlegungen umfassen das Bestimmen, ob der Zelloberfläche Antikörper im Assay verwendet werden, werden ihre Epitope nach der Fixierung erkennen oder wenn sie need angewendet werden Zellen zu leben. Einige Fixierung verhindern richtige Färbung mit Antikörpern Zelloberfläche , wie bekannt ist , auftreten , die mit dem Peptid-MHC - Färbung 3, 4. Durchführen von Zelloberflächen - Antikörper - Färbung an lebenden Zellen kann für einige Antikörper erforderlich sein, aber dies schließt die Möglichkeit zur Antikörpermarkierung vor Strichkodierung da die meisten Strichcodes Verfahren nach der Fixierung durchgeführt werden , obwohl 5 Antikörper-basierte Strichkodierung 6, 7 ist eine Ausnahme. Bei der Bestimmung der Anzahl von Zellen für die Analyse vorbereitet werden, ist es wichtig zu wissen, dass nur ein Bruchteil der auf die Maschine geladen Zellen werden die Daten erfasst werden und produzieren. Dieser Verlust ist hauptsächlich auf Ineffizienzen, wenn der Zerstäuber um die Probe bei der Fackel Sprays. Der genaue prozentuale Verlust hängt von der Masse Zytometrie Maschinenaufbau und Zelltyp, sondern kann von 50 bis 85% liegen und solltebetrachtet, wenn das Experiment zu entwerfen. Dieses Protokoll wurde für 2x10 6 Zellen pro Probe optimiert, kann aber für die Verarbeitung von kleineren oder größeren Probengrößen angepasst werden. Dieses Protokoll kann von 1 × 10 6 bis 4 x 10 6, mit minimalen Modifikationen für Probengrößen verwendet werden , aber es ist wichtig , dass Fallzahl innerhalb eines Versuchs konsistent gehalten werden. Änderungen in der Zellzahl können die Intensität von Barcodes und Antikörper-Färbung beeinflussen und sollte in etwa konsistent gehalten werden, über Proben direkt miteinander verglichen werden. Einige Verfahren, wie tote Zellmarkierung und DNA-Markierung, sollen in der überwiegenden Mehrheit durchgeführt werden, wenn nicht alle experimentellen Designs. Die Kennzeichnung von toten Zellen in den Experimenten nur Oberflächenmarker Analyse kann mit Rh103 erreicht werden, aber Rh103 sollte für Experimente vermieden werden, in denen Permeabilisierung erforderlich ist, wie es in Färbung Verlust zur Folge hat. Für Experimente mit Permeabilisierung, ist es ratsam, Cisplatin zu nutzen Strichkodierung Proben können Antikörper Verbrauch verringern Erfassungszeit reduzieren und eliminieren Probe zu Probe Variabilität 9. Der Prozess der Strichkodierung beinhaltet einen einzigartigen probenspezifischen Code für alle Zellen Anwendung, die verwendet wird, um jede Zelle in seine Ursprungsprobe zuzuordnen. Nachdem die Proben Strichkodierung kann vor der Antikörperfärbung gepoolt werden, ein Verfahren, dass alle Proben gefärbt werden gleichermaßen gewährleistet. Um experimentelle Fehler zu minimieren, ist es ratsam, auf Barcode und bündelt alle Proben, die direkt miteinander verglichen werden. Derzeit gibt es mehrere Methoden für Strichkodierung Proben für Massen Zytometrie Analyse 5, 6, 7, von denen zwei hier vorgestellt werden (siehe unten). Mit derzeit erhältlichen reagents ist es möglich , die Fülle von 38 Antikörper Targets identifizieren Zellen in S-Phase 10, unterscheiden lebenden und toten Zellen und 8 messen zelluläre Niveaus von Hypoxie 11 in einem gemultiplexten Experiment mehrerer Proben zu quantifizieren. Diese Fähigkeit , hohe Parameter Einzelzellendaten für große Zellpopulationen zu sammeln , ermöglicht eine verbesserte Profilieren von sehr heterogenen Zellpopulationen und hat bereits eine Reihe von neuartigen biologischen Erkenntnissen 12, 13, 14, 15, 16 hergestellt. Destillieren der resultierenden komplexen Daten auf interpretierbare Informationen hat 18 die Verwendung von Computer - Algorithmen , einschließlich Spanning Tree Progression der Dichte Normalized Ereignisse (Pik) 17 und Visne erforderlich. Dieser Artikel stellt eine leicht zugänglicheÜberblick darüber, wie zu entwerfen und eine Masse-Zytometrie Experiment durchzuführen und stellt grundlegende Analyse von Massendaten-Zytometrie.

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 Medium Kit</td><td>Stammzellentechnologien</td><td>05850</td><td>Vor Gebrauch bei Raumtemperatur</td></tr><tr><td>erwärmen DMEM F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330-032</td><td>Warm bei 37&nbsp; &deg; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell technologies</td><td>07920</td><td>Warm bei 37&nbsp; &deg; C vor dem Gebrauch</td></tr>: <tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Equitech</td><td>BAH62</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Hyklon</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Zell-ID Pt194</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Bereitgestellt bei 1&nbsp; mM</td></tr><tr><td>cell ID pt195</td><td>fluidigm</td><td></td><td>bereitgestellt bei 1&nbsp; mM</td></tr><tr><td>cell ID pt196</td><td>fluidigm</td><td></td><td>bereitgestellt bei 1&nbsp; mM</td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-400-040-M250</td><td>Löslich bis 25&nbsp; mg/ml in DMSO</td></tr><tr><td>Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td></td></tr><tr><td>5-Iod-2'-Desoxyuridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7125</td><td>Löslich bis 74&nbsp; mg/ml in 0,2&nbsp; N NaOH</td></tr><tr><td>Rhodium 103 Intercelationsmittel</td><td>Fluidigm</td><td>201103A</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>BP1105-4</td><td>Kühlen bei -20&nbsp; &deg; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Röhrchen mit rundem Boden</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 35 &#956; m Filterkappe</td><td>Röhrchen Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>EQ Vier-Elemente-Kalibrierperlen</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase Typ I-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase aus Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Skalpell #10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z69239</td><td></td></tr></tbody></table>

probenvorbereitung für die massen cytometry-analyse

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Massen-Zytometrie verwendet mit Schwermetalletiketten konjugierte Antikörper, ein Ansatz, der stark erhöht die Anzahl der Parameter und Möglichkeiten für tiefe Analyse weit über hat, was möglich ist mit herkömmlichen fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie. Wie bei jeder neuen Technologie gibt es wichtige Schritte, die die zuverlässige Erzeugung von qualitativ hochwertigen Daten sicherzustellen. Dargestellt ist hier ein optimiertes Protokoll, das mehrere Techniken für die Verarbeitung von Zellproben für die Massen Zytometrie Analyse einbezieht. Die hier beschriebenen Methoden helfen dem Benutzer häufige Fehler zu vermeiden und konsistente Ergebnisse erzielen durch Variabilität zu minimieren, die zu ungenauen Daten führen kann. Um experimentelles Design zu informieren, die Gründe für optionale oder alternative Schritte in dem Protokoll und ihre Wirksamkeit bei der Aufdeckung neue Erkenntnisse in der Biologie des Systems wird untersucht, behandelt. Schließlich wird repräsentative Daten vorgelegt erwarteten Ergebnisse der Techniken presente zu illustrierenhier d.

Das Protokoll kann hier im Großen und Ganzen auf eine große Vielfalt von gezüchteten und primären Zellproben mit nur geringfügigen Modifikationen angewandt präsentiert werden. Je nach den Anforderungen des Experiments, kann es in einer modularen Art und Weise durchgeführt werden, wenn bestimmte Elemente, wie Barcodes oder Zelloberflächenfärbung, sind nicht erforderlich. Verwendetes in seiner Gesamtheit ermöglicht dieses Protokoll, um die Herstellung von Massen gemultiplexten Cytometry Pr...

Dieser Artikel beschreibt die Entnahme und Verarbeitung von Proben für die Massenzytometrie-Analyse.

Probenvorbereitung für die Massen Cytometry-Analyse

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Das übergeordnete Ziel dieses Probenvorbereitungsprozesses ist es, eine robuste und konsistente Antikörperfärbung verschiedener Proben zu erzeugen, um die Untersuchung heterogener Zellpopulationen zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, Fragen zur Zellidentität, zur Zellsignalisierung und zur Zellantwort in einer komplexen heterogenen Zellpopulation zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Messung von Proteinspiegeln mit hohen Parametern auf Einzelzellebene ermöglicht.Dieses Verfahren wird von Aundrietta Duncan, einer Doktorandin aus unserem Labor, demonstriert. Für jede einzelne Zellsuspensionsprobe wird sie bei viermal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in serumfreiem Medium resuspendiert, 500 Mikroliter frisch zubereitetes 50 Mikromolares Cisplatin pro 2/10 in die sechs Zellen gegeben und die Proben auf einem Orbitalschüttler unter ständigem Mischen bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer Minute wird das Cisplatin mit einem gleichen Volumen Waschpuffer abgeschreckt und die Zellen zentrifugiert.Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Proben zwei weitere Male, indem Sie 500 Mikroliter Waschpuffer hinzufügen, die Zellen zentrifugieren und den Waschpuffer abgießen. Anschließend werden die Proben zweimal in 500 Mikrolitern PBS gewaschen, wobei die Proben auf ähnliche Weise zentrifugiert und der Überstand verworfen wird. Nach der zweiten PBS-Wäsche resuspendieren Sie die Pellets in 500 Mikrolitern frischem PBS und fixieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern 4%PFA.Pipettieren Sie die Zellen, um sie zu mischen. Anschließend werden die Proben 15 Minuten lang bei Raumtemperatur unter konstantem Mischen auf den Orbitalschüttler gelegt. Am Ende der Inkubation pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, gießen den Überstand ab und waschen anschließend frisches PBS.Um die Zellen zu permeabilisieren, schleudern Sie die Zellen wieder herunter und verwerfen Sie die Überstände. Die Proben werden durch sanftes Vortexen wieder in das restliche PBS suspendiert und sofort ein Milliliter 100 %Methanol pro 2/10 10 in die sechsten Zellen durch sanftes Pipettieren gegeben. Inkubieren Sie die Proben mindestens eine Stunde lang bei vier Grad und zentrifugieren Sie die Zellen am Ende der Inkubation.Anschließend das Methanol abgießen. Waschen Sie dann die Pellets in einem Milliliter Waschpuffer für jeden Milliliter Methanol, gefolgt von zwei weiteren Waschgängen in 500 Mikrolitern frischem Waschpuffer. Übertragen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette auf 50 Mikroliter den restlichen Waschpuffer aus jedem Pellet in ein Röhrchen mit dem entsprechenden Antikörpercocktail.Pipettieren Sie die kombinierte Lösung wieder hoch, ohne Luft in die Spitze zu ziehen, indem Sie den Kolben teilweise gedrückt halten. Übertragen Sie dann die Pipettenspitze in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 Mikrolitern Waschpuffer, ohne den Kolben loszulassen. Lassen Sie den Kolben los, ziehen Sie den Waschpuffer für ein Gesamtvolumen des Antikörpercocktails von 50 Mikrolitern auf und markieren Sie die entsprechende Probe durch vorsichtiges Pipettieren mit dem aspirierten Antikörpercocktail.Waschen Sie die Proben nach einer Stunde bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln viermal und gießen Sie den Waschpuffer jedes Mal ab. Um die Zellen mit Iridium zu markieren, suspendieren Sie die endgültigen Pellets erneut in 500 Mikrolitern PBS, gefolgt von der Zugabe von 500 Mikrolitern vier Prozent PFA für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes fügen Sie den Proben 500 Mikroliter frisch zubereitetes 62,5 nanomolares Iridium und PFA hinzu, um weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur zu schütteln.Zentrifugieren Sie dann die Zellen, gießen Sie den Überstand ab und folgen Sie zwei Wäschen in 500 Mikrolitern 0,1 Prozent BSA und gefiltertem deionisiertem Wasser. Analysieren Sie die Proben, indem Sie Normalisierungskügelchen in die Vertiefungen der Probenplatten geben, Zellen in diese Vertiefungen pipettieren und dann innerhalb von 24 Stunden eine Massenzytometrie durchführen. Nach Normalisierung der Signalintensität können die Kalibrierperlen aus den Daten entfernt werden, indem die negative Population der Iridium-191-positiven Kügelchen angesteuert wird.Die Einzelzellereignisse können dann mit einem Gated versehen werden, um die Trümmer und Zellmultipletts unter Verwendung eines biaxialen Diagramms der negativen Expression von Iridium 193 im Vergleich zur Ereignislänge zu entfernen. Die Cisplatin-Markierung kann verwendet werden, um die Zelltiefe zu messen. Hier werden zum Beispiel Proben mit geringen und höheren Mengen an toten Zellen gezeigt.Die toten Zellen können entfernt werden, indem die Platin-198-positive Population weggeged wird, das Barcoding führt zu einer deutlichen Trennung der Proben innerhalb der Barcoding-Parameter, so dass die Zellen ihren ursprünglichen Probenidentitäten zugeordnet werden können. Die IDU-Markierung kann verwendet werden, um hier beobachtete US-Gesichtszellen zu erkennen. Nach der anfänglichen Normalisierung, dem De-Barcoding und dem Gating können die hochdimensionalen Daten mit dem SPADE-Algorithmus analysiert werden, um eine niedrigdimensionale Darstellung der Daten zu generieren, die sich besser für eine visuelle Interpretation eignet.Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von vier bis sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den Probenverlust während des Waschschritts zu minimieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proben für die Massenzytometrie-Analyse vorbereitet.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Natriumazid gefährlich sein kann, daher sollten Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter PSA treffen.

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