Ein Barcoding-Assay zur phänotypischen und funktionellen Charakterisierung von Immunzellen

Beginnen Sie mit Testproben, die stimulierte und fixierte Immunzellen enthalten.

Die Stimulation induziert die Expression spezifischer Marker in Zellen, während bei der Fixierung phänotypische Marker, einschließlich Zelloberflächenantigene, und funktionelle Zustandsmarker, einschließlich Zytokine, erhalten bleiben.

Fügen Sie jeder Probe eine einzigartige Kombination von Schwermetallisotopen-konjugierten Antikörpern hinzu.

Bei dieser Technik werden mehrere Proben eindeutig mit einem Barcode versehen, wobei jede Probe durch ihre Kombination von Schwermetallisotopen unterschieden wird.

Die Antikörper binden an ein gemeinsames Epitop und barcodieren alle Zellen in den Proben.

Kombinieren Sie alle Proben mit Barcode in einem einzigen Röhrchen für die nachgelagerte Verarbeitung.

Fügen Sie einen metallkonjugierten Antikörpercocktail hinzu, um Oberflächenantigene zu färben.

Fügen Sie einen Permeabilisierungspuffer hinzu, um die Permeabilität der Zellmembran für die intrazelluläre Färbung zu erhöhen.

Fügen Sie einen weiteren Satz metallkonjugierter Antikörper hinzu, um intrazelluläre Zytokine zu färben.

Barcoding ermöglicht die gleichzeitige Färbung und Erfassung der gepoolten Proben mittels Massenzytometrie. Diese Technik maximiert die Effizienz des Assays und verbessert die Bewertung von phänotypischen und funktionellen Zustandsmarkern.

Um die lysierten fixierten Zellen mit einem Barcode zu versehen, tauen Sie die Proben aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius langsam auf Eis auf. Verdünnen Sie den 10-fachen Barcoding-Perm-Puffer mit PBS um 1 bis 10 und stellen Sie genügend Puffer für 3 Milliliter pro Probe her.

Füllen Sie einen unsterilen Trog mit CSM und einen mit dem 1x Barcoding Perm-Puffer. Geben Sie dann 1 Milliliter eiskaltes CSM zu den frisch aufgetauten Proben. Gründlich mischen und in die entsprechenden vorbeschrifteten Polypropylen-Cluster-Röhrchen umfüllen.

Nehmen Sie nun eine 10-Mikroliter-Probe und zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler. Normalisieren Sie die Zellzahlen in jedem Cluster-Röhrchen, indem Sie das Volumen der überschüssigen Zellen entfernen. Zentrifugieren Sie dann die Zellen bei 600 mal g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 Milliliter 1x Barcoding Perm-Puffer mit einer Mehrkanalpipette und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 600 mal g. Saugen Sie anschließend den Überstand ab.

Richten Sie die Cluster-Röhrchen in der gleichen Reihenfolge wie auf dem Barcode-Schlüssel angegeben auf einem Gestell aus, sodass die Probe mit dem Barcode übereinstimmt. Geben Sie 800 Mikroliter 1x Barcoding Perm-Puffer per Mehrkanalpipette zu allen Proben in den Cluster-Röhrchen, ohne das Zellpellet zu berühren, um den Zellverlust zu reduzieren.

Stellen Sie dann das Gestell mit den Cluster-Röhren beiseite. Entfernen Sie die Röhrenstreifen des 20-Plex-Palladium-Barcode-Kits bei minus 20 Grad Celsius und tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf. Geben Sie 100 Mikroliter 1x Barcode-Perm-Puffer hinzu, mischen Sie gründlich und überführen Sie 120 Mikroliter der resuspendierten Barcode-Mischung in die entsprechenden Zellproben in den Cluster-Röhrchen.

Gründlich mit einer Mehrkanalpipette mischen, so dass es zu keiner Kreuzkontamination zwischen einzelnen Barcode-Proben kommt. Inkubieren Sie Cluster-Röhrchen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit die Barcodes die Zellen kennzeichnen können. Nach 30 Minuten zentrifugieren Sie die Proben bei 600 mal g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie den Überstand. Suspendieren Sie sie dann in 1 Milliliter CSM. Anschließend zentrifugieren und erneut in CSM resuspendieren.

Danach zentrifugieren Sie bei 600 mal g für 5 Minuten bei Raumtemperatur und aspirieren den Überstand. Übertragen Sie mit einer einzigen Pipette und mit derselben Spitze alle Zellpellets und etwa 70 bis 80 Mikroliter Restvolumen in ein Styroporröhrchen. Werfen Sie die Pipettenspitze nicht aus. Legen Sie die einzelne Pipette mit dieser Spitze beiseite.

Mit einer Mehrkanalpipette und neuen Spitzen können Sie 100 Mikroliter CSM in jedes Original-Cluster-Röhrchen geben, um die Zellrückgewinnung zu maximieren. Übertragen Sie mit der einzelnen Pipette und der beiseite gelegten Spitze alle Zellpellets mit 100 Mikrolitern Restvolumen in dasselbe Polystyrolröhrchen. Fügen Sie CSM hinzu, um die Styroportube auf etwa 3 Milliliter aufzufüllen. Zählen und notieren Sie die Zellennummer des gepoolten Barcode-Satzes. Dann zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 600 mal g und aspirieren den Überstand. Fahren Sie noch am selben Tag mit dem Färben der Barcode-Proben fort.