Messe Cytometry: Protokoll für die tägliche Tuning und Ausführen von Zellproben auf einem CyTOF Messe Cytometer

Das Überholungsziel dieses Verfahrens ist es, die korrekte tägliche Abstimmung und Probenanalyse an einem CyTOF-Gerät zu demonstrieren. Zuerst wird die Maschine zusammengebaut und eingeschaltet. Als nächstes werden die Instrumenteneinstellungen für das Stimmen auf das maximale Signal optimiert.

Die Maschine ist dann bereit, die Proben zu verarbeiten. Im letzten Schritt wird die Maschine gereinigt und abgeschaltet. Letztendlich können optimale Zelldaten nach spezifischem Zeitbedarf erfasst werden.

visuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung. Die täglichen Einrichtungs-, Abstimmungs- und Reinigungsverfahren sind aus dem Handbuch nur schwer zu lernen. Da mehrere Softwareschritte gleichzeitig erforderlich sind.

Sie müssen Erfahrung sammeln, um ein Gefühl für die entsprechenden Hintergrundpegel und Signalintensitäten zu bekommen: Mindestens 15 Minuten vor Beginn eines Experiments. Öffnen Sie das CyTOF-Softwareprogramm und wählen Sie Geräte-Setup. Klicken Sie dann auf der Registerkarte "Kartenkäfig" auf die Schaltfläche "Heizung ein", damit der Sprühkammermantel 200 Grad Celsius erreicht.

Ersetzen Sie die Spritze in der Spritzenpumpe durch eine frische Spritze, die mit Milliwürfelwasser gefüllt ist. Reinigen Sie dann den Vernebler, indem Sie zweimal mit 5%Citron durch die Grifföffnung spülen. Um Zitronenreste zu entfernen, wiederholen Sie die Rückenspülung mit Milli Q Wasser.

Öffnen Sie anschließend das Argongastankventil, wodurch die Argonnenleuchte an der Vorderseite der Maschine aufleuchtet. Befestigen Sie dann den Vernebler an den Zusatzgaseinlass und befestigen Sie den Vernebler an den Flüssigkeitseinführungsschlauch. Stecken Sie das Ende des Verneblers in die weiße Öffnung in der Heizhaube auf der Registerkarte RFG-Controller des Geräteeinrichtungsfensters.

Klicken Sie auf Plasma starten und dann auf OK. Nachdem der Start abgeschlossen ist, klicken Sie im Popup-Fenster erneut auf OK. Schalten Sie nun die Spritzenpumpe ein.

Drücken Sie beim Nachfüllen der Spritze die Stopptaste anstelle der Pause-Taste, um den Volumenzähler zurückzusetzen. Vergewissern Sie sich vor der Kalibrierung des Massenzytometers, dass es sich 20 Minuten lang erwärmt hat. Sobald sich das Gerät stabilisiert hat, klicken Sie auf die Schaltfläche für die Aufnahmeeinstellungen, um das Fenster mit den Datenerfassungseinstellungen zu öffnen. Auf der Registerkarte Analyten.

Klicken Sie auf das Periodensystem, um das Isotopenauswahlfenster zu öffnen. Wählen Sie dann die Isotope in der DVS Sciences Tuning-Lösung aus, die im Handbuch aufgeführt sind, und klicken Sie auf Speichern. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Isotope pro Messwert, um das Fenster Massen pro Messwert zu öffnen.

Wählen Sie Impulse, Anzahl und skalieren Sie die y-Achse neu, indem Sie eine neue Zahl eingeben und dann die Eingabetaste drücken. Füllen Sie nun eine grüne Ein-Milliliter-Norm-Injektionsspritze mit Stimmlösung. Drehen Sie den Sample-Port-Selektor auf Laden.

Injizieren Sie 450 Mikroliter Tuninglösung und drehen Sie dann den Wahlschalter auf Injektion. Warten Sie, bis die Isotope der Abstimmlösung als Streifen in dieser Anzeige erscheinen. Die Signale in der Flugzeit, 9.400 bis 9.800 Region, sind auf Xenon-Isotope im Argongas zurückzuführen.

Kehren Sie nun zu den Massen pro Lesefenster zurück und klicken Sie auf den grünen Play-Button. Jede farbige Linie stellt ausgewählte Isotope aus der Registerkarte Analyten dar. Wenn die Isotopenwerte konstant sind, stellen Sie die aktuelle Stromauswahl aus dem Dropdown-Menü auf der Registerkarte "Parameter" des Fensters mit den Datenerfassungseinstellungen ein.

Geben Sie im Startfenster Null für Ende ein, geben Sie 10 ein. Geben Sie als Schrittwert 0,5 ein, und geben Sie als Einschwingzeit 200 ein. Klicken Sie dann auf Speichern.

Klicken Sie dann wieder auf die Massen pro Lesefenster und klicken Sie auf Play. Nachdem Sie notiert haben, wo die Signale der Isotope ihren Höhepunkt erreichen, gehen Sie zur Registerkarte "DAC-Kanal-Setup" des Geräte-Setup-Fensters. Scrollen Sie nach unten zu aktuell und geben Sie den Isotopen-Peakwert ein.

Klicken Sie auf Aktuellen Wert festlegen und dann auf Speichern. Ändern Sie als Nächstes das Dropdown-Menü, um Gas nachzufüllen. Geben Sie 0,55 im Startfenster, 0,95 im Endfenster, 0,05 im Schrittwertfenster und 200 im Absetzzeitfenster ein.

Klicken Sie auf Speichern. Nach der Rückkehr zu den Massen pro Messfenster und erneutem Klicken auf die Wiedergabetaste zeigt die x-Achse nun den Nachgasdurchfluss an. Notieren Sie sich die Werte, bei denen die Signale der Isotope ihren Höhepunkt erreichen, und beobachten Sie den raschen Anstieg des Signals GD 1 55 gegen Ende.

Kehren Sie dann zur Registerkarte "DAC-Kanal-Setup" zurück. Scrollen Sie nach unten zu "Makeup, Gas" und geben Sie den neuen Isotopen-Spitzenwert ein. Klicken Sie auf Aktuellen Wert festlegen.

Klicken Sie dann erneut auf Speichern, um das Verhältnis des gewünschten Isotops zu dem Oxid aufzuzeichnen. Machen Sie zuerst eine zweite Injektion von 450 Mikrolitern Stimmlösung. Wählen Sie dann auf der Registerkarte "Parameter" die Option "Zeit" aus dem Dropdown-Menü aus und geben Sie im Startfenster Null, im Endfenster 10, im Schrittwertfenster eine Eins und im Absetzfenster 200 ein.

Nachdem Sie in den Massen pro Lesefenster auf Wiedergabe geklickt haben, lesen Sie mit dem Cursor den höheren Wert für TM 1 69 oder TB 1 59 sowie den GD 1 55-Wert ab. Injizieren Sie nun drei Milliliter Milli Q Wasser durch die Probenschleife, gefolgt von 500 Mikrolitern DVS-Waschlösung. Klicken Sie auf der Registerkarte Massenkalibrierung auf Ausführen, um den Fortschritt der Reinigungswäsche zu überwachen, bis die Intensität der Schlieren abnimmt.

Anschließend drei Milliliter Milliwürfelwasser auftragen und überwachen, bis die Streifen auf Hintergrundniveau gesunken sind. Geben Sie zunächst die Beispielisotope ein, die gerade für die Isotope der Optimierungslösung demonstriert wurden, und klicken Sie dann auf Speichern. Öffnen Sie als Nächstes das Erfassungsfenster und ändern Sie die Erfassungseinstellungen nach Bedarf für das Probenvolumen.

Zum Beispiel füllt eine 450-Mikroliter-Probe die Probenschleife und benötigt 600 Sekunden, um Verzögerungen bei der Erfassung der Zelldaten zu ermöglichen. Stellen Sie die Erfassungsverzögerung auf mindestens 30 Sekunden und die Stabilitätsverzögerung des Detektors auf mindestens 20 Sekunden ein, bevor sie ausgeführt wird. Waschen Sie die Zellproben mindestens zweimal mit Milliwürfelwasser, resuspendieren Sie die Probe dann bei maximal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter und filtrieren Sie die resultierende Zelllösung durch ein 35-Mikrometer-Zellsieb.

Um alle Aggregate zu entfernen. Geben Sie nun einen neuen Dateinamen für das aktuelle Beispiel ein. Beachten Sie, dass alle Dateien auf dem Laufwerk E gespeichert werden müssen.

Schalten Sie dann das Probenschleifenventil auf Laden, injizieren Sie die Probe, schalten Sie das Probenschleifenventil wieder auf Injektion um und klicken Sie dann auf Ausführen. Im Akquisitionsfenster. Die Zellen werden im Snapshot-Fenster als horizontale Ansammlungen von Markierungen in jedem vertikalen Isotopenkanal dargestellt und weisen die beste Auflösung von etwa 300 bis 500 Zellen pro Sekunde auf, wie hier gezeigt.

Wenn die Datenerfassung der Probe abgeschlossen ist, erscheint ein Popup-Fenster. Klicken Sie auf OK, um den Abschluss des Probenlaufs zu bestätigen, und injizieren Sie dann mindestens 500 Mikroliter MQ-Wasser zwischen jede Probe, um die Probenverschleppung für die Reinigung der Maschine zu minimieren. Injizieren Sie nach Gebrauch 450 Mikroliter Waschlösung in die Probenschleife. Überwachen Sie die Freisetzung von freiem Metall und spülen Sie dann die Probenschleife mit drei Millilitern Milli Q Wasser, um die Wäsche zu überwachen, bis die Hintergrundstreifenwerte erreicht sind.

Um das Gerät herunterzufahren, wählen Sie dann die Registerkarte RFG-Controller im Fenster für die Geräteeinrichtung und klicken Sie auf Plasma stoppen. Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, klicken Sie im Popup-Fenster auf OK und empfehlen Sie die Entfernung des Verneblers auf der Registerkarte Kartenkäfig. Schalten Sie die Heizung aus, schließen Sie das Ventil an der Argonnenzufuhr und ziehen Sie dann vorsichtig den Vernebler nach hinten, um ihn aus der Sprühkammer zu entfernen.

Schrauben Sie anschließend den Probeneinführschlauch ab und legen Sie ihn beiseite. Schrauben Sie den Anschluss für die Einführung von Zusatzgas ab, bis er sich leicht lockert, und ziehen Sie dann den Vernebler ab. Reinigen Sie abschließend mit der gleichen Spritze und dem gleichen Schlauch wie zuvor gezeigt beide Anschlüsse des Verneblers mit 5%Citron und bewahren Sie den Vernebler bis zum nächsten Gebrauch mit 5%Citron bedeckt auf.

Durch ausreichendes Waschen des Massenzytometers mit UE-Wasser und DVS-Waschlösung wird die Metallabsorption in den Schlauch und in andere Teile der Maschine reduziert, was dazu beiträgt, den Hintergrund, wie in diesen Diagrammen zu sehen, zu reduzieren. Eine fehlerhafte Abstimmung, die durch die magentafarbene Linie dargestellt wird, erhöhte die Oxidbildung bei m plus 16 im Vergleich zur korrekt abgestimmten Probe, wie die dunkelblaue Linie zeigt. Dies hat zur Folge, dass die gewünschten Signale bei m plus 16 leicht abgeschwächt und die unerwünschten Hintergrundstörungen bei m plus 16 deutlich erhöht werden.

Das richtige Waschen und die richtige Verdünnung der Proben in Milli Q Wasser gewährleisten einen minimalen Hintergrund und die größte Auflösung der Zellen, während gleichzeitig der Bedarf an Geschwindigkeit ausgeglichen wird. Ähnlich wie bei den Daten aus einem repräsentativen Experiment, das hier gezeigt wurde, wurden Polystyrolkügelchen mit natürlicher Häufigkeit Lanthan 1 39 ODIUM one 40, TERBIUM 1 59, DIUM 1 69 und LUTETIUM 1 75 im Zellerfassungsmodus durchgeführt. Die Daten wurden mit FlowJo analysiert und Ablagerungen von zerbrochenen Perlen wurden ausgeblendet.

Die richtig abgestimmte Probe wurde mit der Durchflussrate von 0,74 Litern pro Minute bestimmt, die durch die dunkelblaue Linie dargestellt ist. Bei dieser Flussrate wurden höhere Signalintensitäten beobachtet als bei den niedrigeren Flussraten, und es wurde beobachtet, dass diese richtig abgestimmte Probe ein höheres Signal bei den m Metallmassen und weniger Signal bei den m plus 16 Oxidmassen aufwies als die falsch abgestimmten Signale. Eine Nahaufnahme des Signals bei M Mass LANTHAN 1 39 und THULIUM 1 69 ist hier zu sehen.

Es ist zu beachten, dass die Durchflussrate des Zusatzgases die Signalintensität von LANTHAN 1 39 stärker beeinflusst als die Signalintensität von Thulium 1 69. Diese Diagramme zeigen das Signal bei m plus 16 Oxidmassen 1 55 und 180 5 entsprechend den Oxiden LANTHAN 1 39 plus oh 16 bzw. Thulium 1 69 plus oh 16. Es ist zu beachten, dass die Zusatzgas-Durchflussrate das Signal der Masse 1 55 viel stärker erhöht als das Signal der Masse 180 5, da Lanthan 1 39 leichter oxidiert wird als Thulium 1 69.

Hier sind die Signalintensitäten m und m plus 16 in Abhängigkeit von der Nachflußgasströmung dargestellt. Die gefüllten Symbole stellen die MASSE M dar.Während die offenen Symbole die Masse M plus 16 darstellen, entsprechen die Farben der Linien der jeweiligen Masse M.Beachten Sie, dass die Signalintensitäten von LANTHAN 1 39 und dem Preis ODIUM 1 41 stark von der Zusatzgasflussrate beeinflusst werden. Sogar bis zu einem Punkt, an dem mehr Masse m plus 16 Oxid als Masse M vorhanden ist.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den CyTOF starten, richtig abstimmen, dann Ihre Proben ausführen und schließlich die Maschine am Ende Ihrer täglichen Läufe ordnungsgemäß reinigen und abschalten.