Sammlung, Isolierung, und Durchflusszytometrische Analyse der Menschen Endozervikale Proben

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zervikale mononukleäre Zellen mit einer Zytobürste aus einem endozervikalen Kratzer zu isolieren. Nach der Isolierung können diese Zellen in mehreren Assays verwendet werden, einschließlich der Durchflusszytometrie, bei der Sie den Phänotyp und die Funktion von Immunzellen im weiblichen Genitaltrakt bestimmen können. Die Entnahme von Proben der Zytobürste und der Gebärmutterhalsspülung ist ein nicht-invasiver Eingriff, der von einem Gynäkologen oder einem ausgebildeten Arzt durchgeführt werden muss.

Zuerst wird die zervikale Vaginalspülung durchgeführt, bei der der Endozervix mit zwei Mühlen PBS gewaschen wird, das dann nach der Spülung aus dem hinteren Fornix entnommen wird. Das konkave Ende eines Zervixschabers wird gegen den Gebärmutterhals gelegt und gedreht, um die Gebärmutterhalsöffnung oder den Gebärmutterhalswirbel zu beproben. Als nächstes wird die Zytobürste in das endozervikale OS eingeführt und um 360 Grad gedreht.

Die Verwendung von sanftem Druck trägt dazu bei, dass die Probe nicht verunreinigt wird. Die Zytobürsten im Schaber werden in einem Röhrchen gesammelt, das fünf mil PBS enthält. Nach dem Transport auf Eis wird die Probe schnell in einen Wirbel verwandelt, um die Zellen von der Zytobürste zu trennen.

Nachdem Sie die Proben mit Medien gewaschen haben, werden sie durch einen Hundert-Mikron-Nylonfilter gefiltert. Dies ermöglicht die Entnahme der Lymphozyten, Monozyten und Epithelzellen aus der Probe. Die Zellen sind nun bereit, mit Antikörpern gegen Oberflächenproteine gefärbt zu werden, und sobald sie fixiert sind, können sie auf dem Durchflusszytometer ausgeführt werden.

Wir zeigen Ihnen, wie wir die resultierenden Daten analysieren, um den Phänotyp sowohl der am Gebärmutterhals vorhandenen Zöll-Vier- als auch der Zölial-Acht-T-Zellpopulationen zu beurteilen. Hallo, ich bin Doktorand im Labor von Dr. Keith Folk. Unsere Forschung konzentriert sich auf den Zusammenhang zwischen Immunaktivierung und HIV-Anfälligkeit sowie dem Fortschreiten der Krankheit.

Da die Mehrheit der HIV-Infektionen heute durch heterosexuellen Geschlechtsverkehr erfolgt, sind wir auch daran interessiert, die Korrelate des Schutzes vor HIV-Übertragung auf den weiblichen Genitaltrakt zu bestimmen. Leider kann die Entnahme von Proben aus dem Genitaltrakt für die Studienteilnehmer sehr herausfordernd und ziemlich invasiv sein. Die Verwendung von Zytobürsten zur Entnahme von CMCs oder zervikalen mononukleären Zellen ist im Vergleich zu anderen Protokollen wie Biopsien eine schnellere und einfachere Methode.

In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie Sie CMCs isolieren und für den Einsatz in der Durchflusszytometrie oder anderen Downstream-Anwendungen vorbereiten können. Nach der Sammlung werden die Zytobürste und der Schaber in fünf mil kaltem PBS transportiert. Es ist wichtig, die Proben bis zum Zeitpunkt der Verarbeitung, die nicht länger als zwei Stunden nach der Probenentnahme liegen sollte, auf Eis zu transportieren.

Proben, die zu diesem Zeitpunkt mit Blutspuren kontaminiert sind, sollten von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden, um die Zellen von der Zytobürste zu trennen. Drehen Sie das Rohr 45 Sekunden lang auf hoher Stufe, da die Zellen noch auf der Zytobürste und dem Schaber verbleiben. Sie müssen manuell entfernt werden.

Ziehen Sie ein frisches Paar Handschuhe an und kratzen Sie mit der Zytobürste das restliche Material vom Schaber ab. Nachdem du sie in eine Bleichlösung geworfen hast, entferne mit Daumen und Zeigefinger alle verbleibenden Zellen von der Zytobürste, indem du sie über dem Falkenrohr auf und ab drückst. Nachdem Sie die Zytobürste entsorgt haben, wechseln Sie Ihre Handschuhe, bevor Sie eine weitere Probe vorbereiten, und waschen Sie die Seiten des Röhrchens mit einer Transferpipette mit PBS, um sicherzustellen, dass alle Proben entnommen werden.

Passen Sie hundert Mikron Nylon an. Filtrieren Sie über ein frisches Falcon-Röhrchen und filtrieren Sie mit der Pipette das gesamte Volumen der PBS-Lösung. Fügen Sie der Originalröhre fünf mil RPMI-Medien ohne FBS hinzu.

Waschen Sie mit der Pipette die Seiten des Röhrchens gründlich, um anhaftenden Schleim oder Ablagerungen zu entfernen. Übertragen Sie dann das Medium durch den Filter. Verwenden Sie einen Teil des gefilterten Mediums, um den Boden des Filters zu waschen, bevor Sie ihn in Bleiche entsorgen.

Zum Pelletieren der isolierten Zellen. Zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 1500 U/min, um ein Lösen des Pellets zu verhindern. Denken Sie daran, die Zentrifugenbremse auszuschalten, wenn die Zellen für die Durchflusszytometrie verwendet werden.

Bereiten Sie die Blockierungslösung vor, die erforderlich ist, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern. Während des Zentrifugationsschritts werden 100 Mikroliter Blockierungslösung pro Probe verwendet. Die Blockierungslösung enthält 93,2 Mikroliter Fax, Wash oder PBS plus 2 % FBS, fünf Mikroliter FBS und 1,8 Mikroliter Maus-IgG.

Nach dem Schleudern haben die meisten Proben mit lebensfähigen Zellen ein sichtbares Pellet. In einigen Fällen wird das Pellet ziemlich groß sein. In anderen Proben ist es möglicherweise kaum sichtbar.

Die Pelletgröße hängt nicht immer mit der Zellausbeute zusammen. Vorsichtig den Überstand verkanten, um sicherzustellen, dass Sie die Zellen nicht stören, resuspendieren Sie das Pellet durch sanftes Rühren. Waschen Sie die Zellen mit fünf mil PBS und wiederholen Sie die Zentrifugation 10 Minuten lang bei 1500.

RRP M mit dem Abbruch, noch einmal den Überstand dekantieren und das Pellet wie zuvor wieder aufhängen. Zu diesem Zeitpunkt sind die Zellen bereit, vor der Färbung entweder kryokonserviert oder oberflächengefärbt zu werden. Mit fluoreszierenden Antikörpern ist es vorteilhaft, die unspezifische Bindung zu blockieren, indem Zellen mit einer Blockierungslösung inkubiert werden, die während einer früheren Zentrifugation hergestellt wurde. Nachdem das Zellpellet resuspendiert wurde, fügen Sie der Probe hundert Mikroliter Blockierungslösung hinzu und mischen Sie sie gründlich.

Die restlichen Protokollschritte können entweder in einer 96-Well-Platte oder in einer Faxröhre durchgeführt werden. Abhängig von der Größe des CMC-Pellets. Übertragen Sie die Blockierungslösung und das Zellgemisch auf ein Faxrohr.

Inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie während der 10-minütigen Inkubation den Viabilitätsfarbstoff vor, der zur Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen verwendet wird. Bei der Datenanalyse ist der Viabilitätsfarbstoff nach Herstellerangaben vorzubereiten und nach Bedarf vorzutitrieren.

Achten Sie darauf, die Farbmischung vor Licht geschützt zu halten, bis sie verwendet werden kann. Waschen Sie die Zellen nach der 10-minütigen Inkubation mit 500 Mikrolitern Fax, Waschen oder PBS mit 2 % FBS und zentrifugieren Sie sie dann 10 Minuten lang bei 1600 U/min. Dekantieren Sie nach dem Schleudern den Überstand von der Faxröhre.

Die Zellen durch Rühren wieder suspendieren. Fügen Sie nun das entsprechende Volumen des zuvor hergestellten Viabilitätsfarbstoffs hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius und stellen Sie sicher, dass die Proben vor dem Licht geschützt bleiben, indem Sie sie in Alufolie einwickeln.

Während dieser Inkubation können Sie den Mastermix aus fluoreszierenden Antikörpern vorbereiten, der zur Markierung der Zellen verwendet wird. Achten Sie darauf, dass Sie Ihre Antikörper an peripheren Blutkontrollproben vortitrieren und validieren, bevor Sie sie auf CMCs verwenden. Mischen Sie die titrierten Antikörper und bringen Sie sie auf ein Endvolumen von hundert Mikrolitern pro Probe.

Schützen Sie mit Fax, Waschen und Schützen Sie während dieser Schritte alle Antikörper vor dem Licht. Waschen Sie die Probe nach der 30-minütigen Inkubation erneut mit 500 Mikrolitern Fax, waschen, zentrifugieren, dekantieren und resuspendieren Sie die Zellen wie zuvor. Nun ist es an der Zeit, die Zellen mit 100 Mikrolitern des Antikörpercocktails zu inkubieren, der bei der vorherigen Inkubation hergestellt wurde.

Inkubieren Sie die Proben erneut 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius und stellen Sie sicher, dass sie vor Licht geschützt sind. Die inkubierenden CMCs sind nun bereit, ein letztes Mal mit 500 Mikrolitern PBS gewaschen zu werden. Zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 1600 U/min.

Nach dem Dekantieren und Reanimationssuspendieren des Pellets verdünnen Sie die Zellen in einem Endvolumen von 750 Mikrolitern in einer 1%igen Paraldehydlösung. Um sie zu fixieren, ist es wichtig, die Zellen in diesem großen Volumen wieder zu resuspendieren, um ein Verstopfen des Durchflusszytometers zu verhindern. Selbst bei diesem Volumen kann das Probenröhrchen recht trüb erscheinen.

Halten Sie die Zellen im Dunkeln bei vier Grad Celsius, bis sie auf dem Durchflusszytometer erfasst werden. Zusätzlich zur Zytobürstenprobe entnehmen wir routinemäßig zwei mil PBS-Spülung aus dem Gebärmutterhals und der Vagina. Diese Probe wird sieben Minuten lang bei 1400 U/min zentrifugiert, um zelluläre Trümmer aus der Spülung zu entfernen.

Der verbleibende Überstand kann dann zugeteilt und bei minus 80 Grad Celsius eingefroren werden, um die zukünftige Analyse der löslichen Proteinkonzentration zu ermöglichen. Diese Daten können besonders nützlich sein in Kombination mit zellulären Phänotypdaten, die durch Durchflusszytometrie gewonnen werden. Bevor Sie Ihr CMC-Beispiel ausführen.

Es ist hilfreich, PBMC-Kontrollen vorzubereiten, um die Gating-Run-Kompensationsröhren zu unterstützen, indem Perlen oder Einzelfärbezellen verwendet werden, um die spektrale Überlappung auszugleichen. Erfassen Sie das gesamte CMC-Rohr, um alle Ereignisse im Vergleich zu PBMC-Proben zu erfassen. CMCs weisen mehr Dubletten auf einem FSC-Flächen-gegen-der-Höhenplot auf und weisen möglicherweise keine so ausgeprägte Lymphozytenpopulation auf wie PBMC.

Nachdem Sie Ihre Proben erfasst haben, exportieren Sie die Dateien zur Analyse in einem Programm wie FlowJo. Hier zeigen wir die Hauptkomponenten einer typischen Gating-Strategie für CMC-abgeleitete CD-Zellen mit vier positiven und CD mit acht positiven T-Zellen. Verwenden Sie ein FSC-Flächen-gegen-Höhen-Diagramm für die Einzellinge in Ihrer Stichprobe auf G.

In diesem übereinstimmenden Vergleich können Sie deutlich die erhöhte Anzahl von Dubletten in einer CMC-Stichprobe im Vergleich zu p BMCs sehen. Als nächstes dient das Plotten eines Fluoreszenzmarkers oder FSC über die Zeit als Qualitätskontrollschritt. Wenn Änderungen an der Flussrate Artefakte in die Daten eingeführt haben, können diese in diesem Schritt entfernt werden.

Oben sehen Sie ein konsistentes Fluoreszenz-Zeit-Profil, das auf eine qualitativ hochwertige Probe hinweist. Unten sehen Sie eine Probe mit mehreren Unterbrechungen und Durchflussraten, die von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden können. Die Identifizierung der Lymphozytenpopulation in CMC-Proben kann eine Herausforderung darstellen.

Die Verwendung der A-P-B-M-C-Steuerung hilft bei der Gangplatzierung. Wie Sie sehen können, weisen einige Proben große klare Populationen auf, während andere Proben keine Lymphozytenpopulationen aufweisen. Insgesamt sollten diese Proben ausgeschlossen werden.

Obwohl wir uns auf Lymphozytenpopulationen konzentrieren werden. Es ist auch möglich, Monozyten durch Gating auf Zellen zu setzen, denen die Expression von Linienmarkern fehlt. Es ist möglich, Zellen zu identifizieren, die Kombinationen von dendritischen Zell- und Monozytenmarkern exprimieren, wie z. B. CD 16 und CD 11 C. Die Aufnahme eines Viabilitätsmarkers oder Farbstoffs ist entscheidend für die CMC-Analyse, auch an frischen Zellen.

Wie Sie sehen können, ist die Mehrheit der CMC-Lymphozyten lebensfähig, aber einige Proben enthalten eine hohe Häufigkeit toter Zellen, die von der Analyse ausgeschlossen werden müssen. Tote Zellen können unspezifisch Antikörper aufnehmen und die Datenanalyse innerhalb des Lymphozytengangs verwirren. CD 3-Flecken sollten robust sein.

Der Anteil der CD-3-positiven T-Zellen ist geringer und variabler als in PBMC-Proben, weshalb es entscheidend ist, die gesamte CMC-Probe zu erfassen und die Anzahl der gesammelten Ereignisse zu maximieren. Die T-Zellpopulationen der CD vier und der CD acht positiven T-Zellen können ebenso identifiziert werden wie in TBMC-Proben. In einigen CMC-Beispielen.

Das Verhältnis von Zöliakie vier zu Zöliakie acht ist niedriger als im peripheren Blut beobachtet, und einige Personen weisen eine große doppelt negative T-Zellpopulation auf. Nach der Identifizierung der CD4-positiven und der CD-8-positiven T-Zellpopulationen ist es möglich, die Expression zahlreicher phänotypischer Marker zu quantifizieren. Obwohl die Expression von CD 1 61 in CMCs nachgewiesen werden kann, fehlt die helle CD 1 61-Population, die im Blut nachweisbar ist, im Genitaltrakt.

In ähnlicher Weise kann die Expression von Aktivierungsmarkern wie CD 69 und H-L-A-D-R sowie von Markern wie CCR five und PD one in CMC-Proben zuverlässig gemessen und quantifiziert werden. Die Verwendung von Zytobürstenproben ermöglicht es uns, sowohl den Phänotyp als auch die Funktion von Immunzellen der Schleimhaut zu charakterisieren, insbesondere im Rahmen von Infektionskrankheiten. Dies gibt uns nicht nur einen besseren Einblick in die Mechanismen, die die Schleimhaut- und Reproduktionsimmunologie regulieren, sondern bildet auch die Grundlage für die Entwicklung neuartiger Messungen der Wirksamkeit von Schleimhautimpfstoffen.